Name: drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish
Uploaded: 2020-04-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish at JoVE.com

تم دعم هذا البحث من قبل جائزة V Foundation V للباحثين ومنح المعاهد القومية للصحة DP2CA228043 ، R01CA227656 (إلى J.S. Blackburn) وNIH Training Grant T32CA165990 (إلى M.G. Haney).

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول من قبل لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في جامعة كنتاكي (البروتوكول 2015-2225). تم جمع عينات المرضى تحت مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة كنتاكي (البروتوكول 44672). يجب أن تتم الموافقة على جميع التجارب الحيوانية التي أجريت بعد هذ?...

<ol>
	<li>Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+human+malignant+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+embryos:+assessment+of+migration+and+cell+division+in+the+absence+of+tumor+formation.">The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).</li><li>Topczewska, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+tumorigenic+pathways+converge+via+Nodal+signaling:+role+in+melanoma+aggressiveness.">Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness.</a> Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).</li><li>Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukaemia+xenotransplantation+in+zebrafish--chemotherapy+response+assay+in+vivo.">Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo.</a> British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).</li><li>Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=15+years+of+zebrafish+chemical+screening.">15 years of zebrafish chemical screening.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).</li><li>Ghotra, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole+animal+bio-imaging+assay+for+human+cancer+dissemination.">Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination.</a> PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., W&#228;hlby, C., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).</li><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+automating+the+imaging+of+zebrafish+larvae.">Tools for automating the imaging of zebrafish larvae.</a> Methods. 96, 118-126 (2016).</li><li>Henn, K., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dechorionation+as+a+tool+to+improve+the+fish+embryo+toxicity+test+(FET)+with+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio).</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &amp; Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Embryo+Xenograft+and+Metastasis+Assay.">Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay.</a> Bio-Protocol. 8 (18), (2018).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Cold Spring Harbor Laboratory Press. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+medium+(for+zebrafish+embryos).">E3 medium (for zebrafish embryos).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).</li><li>Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Xenograft+Platform:+Evolution+of+a+Novel+Cancer+Model+and+Preclinical+Screening+Tool.">The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li><li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Engrafted+Human+Cancer+and+Therapy+Responses+in+Immunodeficient+Zebrafish.">Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish.</a> Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li></ol>

في هذه الدراسة، أظهرنا طريقة موحدة لإذابة وحقن خلايا سرطان الدم المريض الأولي في حمار وحشي كنموذج xenograft. كما وضعنا بروتوكولًا لفحص الأدوية عالية الإنتاجية لسمك الحمار الوحشي xenografted باستخدام وحدة تصوير مجهزة بالمجهر الفلوري ووحدة أخذ العينات الآلية. في السابق ، تم الإبلاغ عن xenografts مع خطوط ...

Xenografting من سرطانات المرضى الأولية أو خطوط الخلايا السرطانية البشرية في الكائنات الحية النموذجية هو تقنية تستخدم على نطاق واسع لدراسة تطور الورم والسلوك في الجسم الحي، واستجابة الورم للعلاج من المخدرات، وتفاعل الخلايا السرطانية مع البيئة الدقيقة، من بين أمور أخرى. تقليديا، يتم تطعيم الخلايا في الفئران المحصنة، وهذا لا يزال المعيار في هذا المجال. ومع ذلك، هذا النظام النموذجي لديه العديد من القيود، مثل ارتفاع التكلفة، وانخفاض الأرقام المتكررة، والصعوبات في تحديد حجم دقيق عبء الورم في الجسم الحي، والوقت الممتد الذي يستغرقه الأورام لغير المطعم واختبار المخدرات ليتم الانتهاء منها. في السنوات الأخيرة، ظهرت سمك الحمار الوحشي كنموذج xenograft بديل، مع أول يجري الإبلاغ عنها في عام 2005، مع البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وصفت خطوط خلايا الميلانوما البشرية المزروعة في الأجنة في مرحلة الانفجار1,,2. في الآونة الأخيرة، تم استخدام 2 يوم بعد الإخصاب (dpf) يرقات حمار وحشي كمستلمين xenograft للسماح للسيطرة على الموقع التشريحي للحقن واستخدامها في دقة عالية في تصوير الجسم الحي من تفاعل الورم مع البيئة الدقيقة المحيطة3,4.
حمار وحشي تقدم العديد من المزايا كنموذج xenograft. أولاً، يمكن إيواء سمك الحمار الوحشي البالغ وتربيته بسرعة بكميات كبيرة بتكلفة منخفضة نسبياً. يمكن لكل زوج من التزاوج من سمك الحمار الوحشي البالغ إنتاج مئات من الأسماك اليرقات في الأسبوع. نظرًا لصغر حجمها ، يمكن الحفاظ على هذه السمكة الوحشية اليرقية في 96 لوحة جيدة لفحص المخدرات عالية الإنتاجية. لا يجب تغذية اليرقات أثناء تجربة xenograft النموذجية ، حيث يوفر صفارها - كيس العناصر الغذائية للحفاظ عليها في الأسبوع الأول من حياتها. وعلاوة على ذلك، لا تحتوي سمك الحمار الوحشي على جهاز مناعي يعمل بكامل طاقته حتى 7 dpf، مما يعني أنها لا تتطلب تشعيع أو نظم مثبطة للمناعة قبل حقن xenograft. وأخيراً، تسمح خطوط سمك الحمار الوحشي الواضحة بصريًا بالتصوير عالي الدقة للتفاعلات بين الورم والبيئة الدقيقة.
ولعل التطبيق الواعد من حمار وحشي كنموذج xenograft هو القدرة على إجراء فحص المخدرات عالية الإنتاجية على عينات السرطان البشري بطريقة غير ممكنة باستخدام أي كائن حي نموذج آخر. تمتص اليرقات الأدوية من الماء عبر الجلد ، مما يعزز سهولة إدارة الدواء5. ولأن الحيوانات تُحتفظ بها في لوحات 96 بئراً، وعادة ما تكون في 100-300 ميكرولتر من المياه، فإن الشاشات تتطلب كميات أدوية أصغر مقارنة بالفئران. حاليا، هناك عدة طرق مختلفة لتوحيد وتقدير تأثير المخدرات على عبء الورم البشري في سمك الحمار الوحشي، وبعضها أكثر عملية من غيرها لتوسيع نطاق اختبار المخدرات واحد إلى فحص عالية الإنتاجية. على سبيل المثال، تقوم بعض المجموعات بفصل الأسماك إلى تعليق خلية واحدة، والقياس الكمي للخلايا السرطانية المسماة أو الملطخة بالفلورسنت عن طريق تصوير قطرات فردية من التعليق وقياس الفلورسيز باستخدام ماكرو ImageJ شبه الآلي4. تم تطوير طريقة تصوير شبه آلية لليرقات الكاملة تم فيها إصلاح أسماك اليرقات في لوحات 96 بئرًا وتصويرها باستخدام مجهر فلوري مقلوب قبل إعادة تنظيم الصور المركبة والقياس الكمي لبؤر الخلايا السرطانية6. كل من هذه المقالات هي أساليب كثيفة العمالة إلى حد ما للقياس الكمي، والتي جعلت حقا فحص المخدرات عالية الإنتاجية في نماذج xenograft سمك الحمار الوحشي غير عملي.
وقد تم تناول هذه المسألة من خلال تطوير التكنولوجيا الخاصة بالفحص الآلي الفقارية (VAST) Bioimages و الجسيمات الكبيرة (LP) العينات ، والمجهر الفلورسينس مجهزة وحدة التصوير والآلي وحدة أخذ العينات(الشكل 1 وجدول المواد)، وهو وسيلة مؤتمتة حقا لتصوير عالية الإنتاجية من يرقات حمار وحشي7،8،9. مع هذه الوحدة ، يتم كشف الأسماك ، أخذ عينات تلقائيًا من لوحة 96 - جيدًا ، يتم وضعها في شعرية وتدويرها في اتجاه المجموعة استنادًا إلى تفضيل المستخدم المحدد مسبقًا ، والصورة ، ثم يتم وضعها مرة أخرى في نفس البئر من لوحة 96-well جديدة لمزيد من الدراسات أو يتم التخلص منها. الجمع بين هذه التكنولوجيا التصوير مع زيوجرافات حمار وحشي قد تسمح لإمكانية الطب الشخصي الذي يستخدم عالية الإنتاجية فحص المخدرات من المكتبات المركبة المخدرات الكبيرة ضد أورام المرضى الفردية. كما تقدم زيينوجرافات حمار وحشي طريقة واسعة النطاق ومنخفضة التكلفة لاختبار كل من سمية وفعالية المركبات الجديدة في الجسم الحي. يمكن استخدام سمك الحمار الوحشي كخطوة فحص أولية قبل الشروع في نماذج xenograft الماوس.
لقد قمنا بتطوير سير عمل مبسط لخلايا سرطان الدم المريض الأولي ة xenografting في حمار وحشي وأداء شاشات المخدرات عالية الإنتاجية مع التصوير الآلي والقياس الكمي، والتي يمكن تطبيقها على أي خلايا الورم المريض الأولية الأخرى أو خط الخلايا السرطانية. استخدم سير العمل هذا مجهر فلورسينس مجهز بوحدة تصوير ووحدة عينات آلية لتحسين طرق التوحيد والقياس الكمي الحالية ويقدم بديلاً آلياً للطرق السابقة الأكثر كثافة في العمل لتحديد كتلة الورم في الجسم الحي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10x TBE Liquid Concentrate</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:115px;">0658-5L</td>
			<td style="width:360px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">96-well plate, flat bottom</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229195</td>
			<td style="width:360px;">VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Agarose</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Borosilicate Glass Capillary without Filament</td>
			<td style="width:139px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:115px;">B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-EI126-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E3 media</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Femtotips Microloader Tips</td>
			<td style="width:139px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:115px;">930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td>FIJI</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Large Particle (LP) Sampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methotrexate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6770-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral Oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>PBL06-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stage Micrometer (400-Stage)</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>400-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:139px;">Pentair Aquatic</td>
			<td style="width:115px;">TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">VAST Bioimager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vincristine Sulfate</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T117-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vybrant DiI Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>V22885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish

نماذج xenograft المشتقة من المريض حاسمة في تحديد كيفية استجابة السرطانات المختلفة للعلاج الدوائي في نظام في الجسم الحي. نماذج الماوس هي المعيار في هذا المجال، ولكن ظهرت حمار وحشي كنموذج بديل مع العديد من المزايا، بما في ذلك القدرة على فحص المخدرات عالية الإنتاجية ومنخفضة التكلفة. الحمار الوحشي يسمح أيضا في فحص المخدرات في الجسم الحي مع أعداد تكرار كبيرة التي كانت في السابق فقط يمكن الحصول عليها مع في النظم المختبرية. القدرة على أداء بسرعة شاشات المخدرات على نطاق واسع قد تفتح إمكانية للطب شخصية مع الترجمة السريعة للنتائج مرة أخرى إلى العيادة. يمكن أيضًا استخدام نماذج زينوسوهوتورفيش الوحشية للفحص السريع للطفرات القابلة للتنفيذ استنادًا إلى استجابة الورم للعلاجات المستهدفة أو لتحديد مركبات جديدة مضادة للسرطان من المكتبات الكبيرة. والقيود الرئيسية الحالية في هذا المجال هي تحديد العملية كميا وأتمتة هاوية بحيث يمكن إجراء شاشات الأدوية على نطاق أوسع وتكون أقل كثافة في اليد العاملة. لقد قمنا بتطوير سير عمل لعينات المريض الأولية xenografting في يرقات حمار وحشي وأداء شاشات المخدرات على نطاق واسع باستخدام مجهر الفلورسينس وحدة التصوير المجهزة ووحدة العينات الآلية. تسمح هذه الطريقة بتوحيد وقياس مساحة الورم المطعمة والاستجابة للعلاج الدوائي عبر أعداد كبيرة من يرقات سمك الحمار الوحشي. عموما، هذه الطريقة مفيدة على الخلايا التقليدية الخلايا فحص المخدرات لأنها تسمح لنمو الخلايا السرطانية في بيئة في الجسم الحي في جميع أنحاء العلاج بالعقاقير، وأكثر عملية وفعالة من حيث التكلفة من الفئران على نطاق واسع في شاشات المخدرات على الهواء.

بعد البروتوكول المذكور أعلاه ، تم تطعيم سمك الحمار الوحشي في صفار وبيركارديوم مع ثنائي الفينيل متعدد البروم المريض الرئيسي التي كانت معزولة في الأصل عن مريض سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-ALL) في التشخيص والمصرفية كعينة قابلة للحياة ومجمدة. في 48 hpi، تم فحص الأسماك xenografted للخلايا السرطانية الم...

Watch this Scientific Journal Video about Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish at JoVE.com

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

نماذج زيونوجراف وزينوجراف تسمح لفحص المخدرات عالية الإنتاجية والتصوير الفلورسنت للخلايا السرطانية البشرية في بيئة صغيرة في الجسم الحي. قمنا بتطوير سير عمل لفحص المخدرات على نطاق واسع آلي على عينات سرطان الدم المشتقة من المريض في سمك الحمار الوحشي باستخدام مجهر الفلورسينس الآلي مجهزوحدة التصوير.

فحص المخدرات للمريض الأولي المشتقة الورم Xenografts في حمار وحشي

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

لدينا حمار وحشي xenograft المخدرات فحص سير العمل يسمح للتصوير الآلي وتكميم خلايا السرطان البشرية واستجابتها للعلاج من المخدرات. ويمكن استخدامه لاختبار سريع استجابة الخلايا السرطانية الصبر للأدوية المعروفة أو لتحديد مركبات جديدة لمكافحة السرطان. استخدام نماذج الحمار الوحشي xenograph وفحص المخدرات يسمح ل Inviva الأرقام المقلدة التي كانت في السابق فقط الحصول عليها مع النظم في المختبر.كما أنها أكثر فعالية من حيث التكلفة من نماذج الماوس في الفحص من خلال مكتبات كبيرة من المركبات. هذا العمل لديه عدة خطوات من تدخل الخلايا السرطانية في حمار وحشي لتصوير استجابة المخدرات التي يتم تعلمها بشكل أفضل عن طريق مظاهرة بصرية. للبدء، الطرد المركزي على الأقل مرتين 10 إلى الخلايا السادسة في خمسة ملليمترات من برنامج تلفزيوني في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق، ويتبخر.Resuspend لوحة الخلية في خمسة ملليمترات من حل دي تلطيخ. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية محمية من الضوء لمدة 20 دقيقة. ثم دوامة بلطف واحتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء.ثم الطرد المركزي الخلايا في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق ويتبخر ونافر. غسل الخلايا عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق، وpirating ناضح. كرر غسل مرة واحدة إضافية.إعادة تعليق الخلايا في ميكرولتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل 250 ألف خلية حية ونقلها إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليمتر. إبقاء الخلايا التي أعيد تعليقها على الجليد في الظلام. قبل تلطيخ الخلايا وحقن، وجعل لوحات agarose لحقن عن طريق صب 25 ملليلتر من ثلاثة في المئة agarose في 1X TBE في طبق بتري والسماح لها لترسيخ.تخزين لوحات في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. أيضا قبل تلطيخ الخلايا وحقن، إزالة الكلور يومين بعد الإخصاب الأسماك الحمار الوحشي باستخدام ملقط تحت مجهر تشريح. سحب من طرفي نقيض من المشيمة واقية من الأسماك حمار وحشي مع ملقط حتى الدموع المشيمية والأسماك حمار وحشي يصبح غير مظلل.لمنع تكتل الخلايا أثناء الحقن المجهري، قبل البرد غير خيوط البوروسيليكات الإبر الزجاجية في أربع درجات مئوية أو على الجليد. مباشرة بعد تلطيخ الخلايا، استخدم طرف ماصة microloader لتحميل خمسة ميكرولترات من الخلايا الملطخة في الإبرة المبردة. قم بتحميل الإبرة في ذراع الحقن الدقيق.مستوى طرف إبرة باستخدام شفرة حلاقة معقمة. باستخدام ميكرومتر المرحلة، وقياس حجم قطرة في الزيوت المعدنية. الحفاظ على حجم قطرات باستمرار في اثنين من nanoliters، والتي هي حوالي 1.5 ملليمتر في القطر.بعد دقيقة واحدة من التخدير ، قم بنقل اليرقات المخدرة إلى لوحة حقن سطحية مستوًا معدة مع ثلاثة في المئة من الأغاروز ، وحقن اليرقات بمضخة واحدة من الخلايا الملطخة في موقع الحقن المطلوب. يجب أن تكتمل جميع الحقن في غضون ساعة إلى ثلاث ساعات بعد تلطيخ الخلايا لمنع تكتل الإبرة. اغسل اليرقات من صفيحة الحقن في طبق بتري طوله 10 سنتيمترات يحتوي على E3 وسائط بدون أزرق الميثيلين واحتضانها عند 28 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للتعافي.نقل طبق اليرقات المحقونة إلى حاضنة درجة مئوية 34. مع طبق بتري فارغ يوضع بين الرف وطبق بتري من اليرقات ليكون بمثابة عازل. في 48 ساعة بعد الحقن، وشاشة يرقات الأسماك حمار وحشي لgraftment الخلايا السرطانية الفلورية والصحة.إزالة أي أسماك حمار وحشي الميت أو المشوه، وتحديد الأسماك حمار وحشي مع engraftment مماثلة. إزالة الأسماك حمار وحشي غير مغر. بالنسبة للأسماك التي يتم حقنها بالرفار، قم بإزالة الأسماك حيث لا يمكن رؤية حدود النير حول كتلة الخلايا المحنّة.بالنسبة للأسماك التي يتم حقنها بالبيراصير، قم بإزالة الأسماك حيث تتعدى كتلة الخلايا المحقونة في كيس صفار. لنقل الأسماك المختارة إلى لوحة 96 جيدا، وقطع أولا طرف قبالة 200 ميكرولتر ماصات تلميح، فقط كبيرة بما يكفي لمدة أربعة أيام بعد الإخصاب الأسماك الحمار الوحشي لتناسب من خلال. pirate 150 ميكرولترات من وسائل الإعلام E3 مع سمكة حمار وحشي واحدة من لوحة باستخدام ماصة P200 وإضافتها إلى بئر فارغة من لوحة مسطحة أسفل 96 جيدا.إضافة 150 ميكرولترات من 2X محلول المخدرات المخفف إلى كل بئر تحتوي على يرقات الأسماك حمار وحشي للوصول إلى حجم النهائي من 300 ميكرولترات مع 1X حل المخدرات في بئر. احتضان لوحة في 34 درجة مئوية. تحقق من وجود أسماك حمار وحشي ميتة يوميا.بعد يومين، إذا رغبت في ذلك، تحديث الدواء عن طريق استبدال 200 ميكرولترات من السائل من كل بئر مع 1X حل المخدرات أو DMSO في وسائل الإعلام E3. في برنامج Zen Blue، قم بإزالة جميع القنوات الفلورية غير المرغوب فيها في برنامج التصوير وأضف قناة Dii. تحقق من قناة الفلورسنت المطلوبة.في نفس النافذة، حدد كيفية التقاط الصور، واصمّة Z، والأتمتة، والحلقات، والسلسلة، وما إلى ذلك. صورة لـ DMSO تتحكم في الأسماك قبل أن يتم علاج المخدرات. وتعيين وقت التعرض المناسب في برنامج التصوير.لتحديد كمية الفلوريسنس، فتح برنامج imagej. انتقل إلى ملف، وفتح، وحدد ملف CZI المطلوب. البرنامج إحضار نافذة خيارات الاستيراد.لعرض المكدس، حدد الـ hyperstacks، تحقق من فتح الملفات بشكل فردي، تحقق من المقياس التلقائي، وتحقق من القنوات المنقسمة. بالنسبة إلى خيار اللون، حدد ملون. ثم انقر فوق الإضافات ، وحدات الماكرو ، سجل.انقر فوق الصورة، وضبط، والحد. حدد نوع الصورة باللون الأحمر في القائمة المنسدلة على الجانب الأيمن من نافذة العتبة. اضبط الحد الأدنى حتى يقوم البرنامج فقط بتمييز المناطق ذات الفلور، ثم انقر فوق تطبيق.البرنامج يحول الصورة إلى أبيض وأسود مع المنطقة المحددة باللون الأسود. انقر فوق تحليل وقياس. البرنامج تسحب ما يصل نافذة النتائج التي تحتوي على منطقة الفلورسنت لتلك الصورة.انقر فوق إنشاء على نافذة مسجل الماكرو. هذا يفتح إطار جديد مع التعليمات البرمجية الماكرو. تسليط الضوء على جميع الصور المطلوبة للتحليل وفتح وفقا ل التراص عرض أو لون الخيار.حدد تشغيل على الإطار مع الماكرو. إطار النتائج الآن يحتوي على منطقة لكل صورة. في هذا البروتوكول، في حقن بعد 48 ساعة، تم فحص الأسماك xenografted للخلايا السرطانية المسمى الفلورسنت وعلاجها مع العلاج الكيميائي أو DMSO.وعموما، أظهرت الأسماك ذات الشطة التي عولجت بفينكريستين أكبر انخفاض وأكثر اتساقا في كتلة الخلايا xenografted مقارنة بالأسماك المعالجة من قبل نظام إدارة الوجهات السياحية. وأظهرت الأسماك المعالجة Dexamethasone حوالي نصف الانخفاض في منطقة الورم مقارنة مع Vincristine. ولكن لا يزال أظهر انخفاضا في منطقة الورم مقارنة مع DMSO.يمكن استخدام هذا الإجراء لفحص أي خط خلية سرطانية أو عينة المريض للاستجابة لأدوية مختلفة أو علاجات محددة مستهدفة تعطي نظرة ثاقبة على ورم كل مريض.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

وضع العلامات لسرطان الثدي Xenografts المستمدة من المريض مع يمكن عزوها مراسلون لنمو الأورام والدراسات الانبثاث

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

إنشاء ثقافة الأولية المستمدة من المريض الأنسجة اللينة كابوزي

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

التدفق الخلوي لتقدير لوكيميا الخلايا الجذعية في الابتدائي سرطان الدم النقوي الحاد والمريض-المشتقة-تكثيفها، في التشخيص والمتابعة حتى

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

عزل وتوصيف الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما المستمدة من المرضى Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

نموذج Xenograft غير متجانس ة من سرطان البنكرياس المستمدة من المريض باستخدام يرقات سمك الحمار الوحشي كمضيفين للتقييم المقارن للأدوية

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

الفيزيولوجيالمريض المستمدة 3D Spheroids لفحص المخدرات المضادة للأورام لاستهداف الخلايا الجذعية السرطان

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

في التصوير في الجسم الحي وتكميم الاستجابة الوعائية المضيف في ورم حمار وحشي Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

إنشاء نماذج Xenograft المستمدة من سرطان المعدة وخطوط الخلايا الأولية

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

اختبار العلاجات المستهدفة في السرطان باستخدام تحليل تعديل الحمض النووي الهيكلي وXenografts المستمدة من المريض

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

تعزيز قابلية البقاء لثقافات الهيدروجيل Ex vivo 3D من Xenografts المستمدة من المريض في منصة Microfluidic Perfused

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...