Name: drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish
Uploaded: 2020-04-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af en V Foundation V Scholar Award og NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (til J.S. Blackburn) og NIH Training Grant T32CA165990 (til M.G. Haney).

Alle procedurer, der er beskrevet i denne protokol, er blevet godkendt af University of Kentucky's Institutional Animal Care and Use Committee (protokol 2015-2225). Patientprøver blev indsamlet under University of Kentucky's Institutional Review Board (protokol 44672). Alle dyreforsøg, der udføres efter denne protokol, skal godkendes af brugerens institutionelle dyrepleje- og brugskomité.
1. Optøning primær patient akut lymfoblastær leukæmi celler
<ol><li>Optø primære patient perif...

<ol>
	<li>Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+human+malignant+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+embryos:+assessment+of+migration+and+cell+division+in+the+absence+of+tumor+formation.">The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).</li><li>Topczewska, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+tumorigenic+pathways+converge+via+Nodal+signaling:+role+in+melanoma+aggressiveness.">Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness.</a> Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).</li><li>Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukaemia+xenotransplantation+in+zebrafish--chemotherapy+response+assay+in+vivo.">Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo.</a> British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).</li><li>Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=15+years+of+zebrafish+chemical+screening.">15 years of zebrafish chemical screening.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).</li><li>Ghotra, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole+animal+bio-imaging+assay+for+human+cancer+dissemination.">Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination.</a> PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., W&#228;hlby, C., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).</li><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+automating+the+imaging+of+zebrafish+larvae.">Tools for automating the imaging of zebrafish larvae.</a> Methods. 96, 118-126 (2016).</li><li>Henn, K., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dechorionation+as+a+tool+to+improve+the+fish+embryo+toxicity+test+(FET)+with+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio).</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &amp; Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Embryo+Xenograft+and+Metastasis+Assay.">Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay.</a> Bio-Protocol. 8 (18), (2018).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Cold Spring Harbor Laboratory Press. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+medium+(for+zebrafish+embryos).">E3 medium (for zebrafish embryos).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).</li><li>Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Xenograft+Platform:+Evolution+of+a+Novel+Cancer+Model+and+Preclinical+Screening+Tool.">The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li><li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Engrafted+Human+Cancer+and+Therapy+Responses+in+Immunodeficient+Zebrafish.">Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish.</a> Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li></ol>

I denne undersøgelse viste vi en standardiseret metode til optøning og injektion af primære patientleukæmiceller i zebrafisk som en xenograftmodel. Vi har også etableret en protokol for høj-throughput narkotika screening af xenografted zebrafisk ved hjælp af en fluorescens mikroskop udstyret billeddannelse enhed og automatiseret sampler enhed. Tidligere, xenografts er blevet rapporteret med menneskelige cellelinjer, og kvantificering af xenografted tumorer i en høj-throughput måde har været en udfordring i mark...

Xenografting af primære patient kræftformer eller menneskelige kræft celle linjer i model organismer er en udbredt teknik til at studere tumor progression og adfærd in vivo, tumor respons på narkotikabehandling, og kræft celle interaktion med mikromiljøet, blandt andre. Traditionelt er celler xenografted i immun-kompromitterede mus, og dette er fortsat standardi marken. Men, denne model system har flere begrænsninger, såsom høje omkostninger, lave replikat numre, vanskeligheder med præcist at kvantificere tumor byrde in vivo, og den forlængede tid, det tager for tumorer til engraft og drug test, der skal udfyldes. I de seneste år har zebrafisk vist sig som en alternativ xenograft model, med den første er rapporteret i 2005, med grønne fluorescerende protein (GFP)-mærket menneskelige melanom cellelinjer transplanteret i blastula-trins embryoner1,2. For nylig, 2 dag post-befrugtning (dpf) zebrafisk larver er blevet brugt som xenograft modtagere til at give mulighed for kontrol af anatomiske placering af injektion og til brug i høj opløsning in vivo billeddannelse af tumor interaktion med det omgivende mikromiljø3,4.
Zebrafisk tilbyder mange fordele som en xenograft model. For det første kan voksne zebrafisk opstaldet og hurtigt opdrættet i store mængder til en forholdsvis lav pris. Hvert parringspar voksne zebrafisk kan producere hundredvis af larvefisk om ugen. På grund af deres lille størrelse, kan disse larve zebrafisk opretholdes i 96-brønd plader til høj-throughput narkotika screening. Larver behøver ikke at blive fodret i løbet af en typisk xenograft eksperiment, som deres æggeblomme-sæk giver næringsstoffer til at opretholde dem for deres første uge af livet. Desuden har zebrafisk ikke et fuldt funktionelt immunsystem før 7 dpf, hvilket betyder, at de ikke kræver bestråling eller immunsuppressive regimer før injektion af xenograft. Endelig optisk klare zebrafisk linjer giver mulighed for høj opløsning billeddannelse af tumor-mikromiljø interaktioner.
Måske den mest lovende anvendelse af zebrafisk som en xenograft model er evnen til at udføre høj-throughput narkotika screening på menneskelige kræftprøver på en måde, der ikke er muligt ved hjælp af nogen anden model organisme. Larver absorberer lægemidler fra vandet gennem huden, hvilket øger brugervenligheden af administration af lægemidler5. Da dyr holdes i 96 brøndplader, typisk i 100−300 μL vand, kræver skærme mindre lægemiddelmængder sammenlignet med mus. I øjeblikket er der flere forskellige metoder til standardisering og kvantificering af virkningen af lægemidler på menneskelige tumor byrde i zebrafisk, hvoraf nogle er mere praktisk end andre til opskalering enkelt drug test til høj-throughput screening. For eksempel, nogle grupper adskille fisk i enkelt celle suspensioner, og kvantificere fluorescerende mærket eller farvede tumorceller ved billeddannelse individuelle dråber af suspensionen og kvantificere fluorescens ved hjælp af en semi-automatiseret ImageJ makro4. En semi-automatiseret hellarver imaging metode blev udviklet, hvor larve fisk blev fastsat i 96-godt plader og afbildet ved hjælp af en omvendt fluorescerende mikroskop før justering af sammensatte billeder og kvantificering af tumor celle foci6. Begge disse analyser er temmelig arbejdskrævende metoder til kvantificering, som har gjort virkelig høj-throughput narkotika screening i zebrafisk xenograft modeller upraktisk.
Dette problem er blevet løst ved udviklingen af hvirveldyr automatiseret screening teknologi (VAST) Bioimager og Large Particle (LP) Sampler, en fluorescens mikroskop udstyret billeddannelse enhed og automatiseret sampler enhed (Figur 1 og Tabel af materialer), som er en virkelig automatiseret metode til høj-throughput imaging af zebrafisk larver7,8,9. Med denne enhed, er fisk bedøvet, stikprøven automatisk fra en 96-godt plade, placeret i en kapillær og roteret ind i den indstillede orientering baseret på en forudindstillet bruger præference, afbildet, og derefter enten placeret tilbage i samme brønd af en ny 96-godt plade til yderligere undersøgelser eller kasseres. Ved at kombinere denne billeddannelse teknologi med zebrafisk xenografts kan give mulighed for personlig medicin, der bruger høj-throughput narkotika screening af store stof sammensatte biblioteker mod individuelle patient tumorer. Zebrafisk xenografts tilbyder også en storstilet og billig metode til at teste både toksicitet og effekten af nye forbindelser in vivo. Zebrafisk kan bruges som et indledende screeningstrin, før du fortsætter til musexenograftmodeller.
Vi har udviklet en strømlinet arbejdsgang for xenografting primære patient leukæmiceller i zebrafisk og udfører lægemiddelskærme med høj gennemløb med automatiseret billeddannelse og kvantificering, som kan anvendes på alle andre primære patienttumorceller eller kræftcellelinje. Denne arbejdsgang udnyttede en fluorescens mikroskop udstyret billeddannelse enhed og automatiseret sampler enhed til at forbedre den nuværende standardisering og kvantificering metoder og tilbyder et automatiseret alternativ til tidligere, mere arbejdskrævende metoder til kvantificering tumormasse in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10x TBE Liquid Concentrate</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:115px;">0658-5L</td>
			<td style="width:360px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">96-well plate, flat bottom</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229195</td>
			<td style="width:360px;">VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Agarose</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Borosilicate Glass Capillary without Filament</td>
			<td style="width:139px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:115px;">B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-EI126-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E3 media</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Femtotips Microloader Tips</td>
			<td style="width:139px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:115px;">930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td>FIJI</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Large Particle (LP) Sampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methotrexate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6770-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral Oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>PBL06-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stage Micrometer (400-Stage)</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>400-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:139px;">Pentair Aquatic</td>
			<td style="width:115px;">TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">VAST Bioimager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vincristine Sulfate</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T117-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vybrant DiI Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>V22885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish

Patient afledte xenograft modeller er afgørende for at definere, hvordan forskellige kræftformer reagerer på narkotikabehandling i et in vivo-system. Musemodeller er standarden på området, men zebrafisk har vist sig som en alternativ model med flere fordele, herunder evnen til høj-throughput og billig narkotika screening. Zebrafisk også give mulighed for in vivo stof screening med store replikat numre, der tidligere kun var opnåelige med in vitro-systemer. Evnen til hurtigt at udføre store narkotika skærme kan åbne mulighed for personlig medicin med hurtig oversættelse af resultater tilbage til klinikken. Zebrafish xenograft modeller kunne også bruges til hurtigt at screene for handlingsrettede mutationer baseret på tumor respons på målrettede behandlinger eller til at identificere nye anti-cancer forbindelser fra store biblioteker. Den nuværende store begrænsning på området har været kvantificering og automatisering af processen, således at narkotika skærme kan gøres på en større skala og være mindre arbejdskrævende. Vi har udviklet en arbejdsgang for xenografting primære patientprøver i zebrafisklarver og udfører store narkotikaskærme ved hjælp af en fluorescensmikroskop udstyret billedenhed og automatiseret sampler enhed. Denne metode giver mulighed for standardisering og kvantificering af engrafted tumor område og reaktion på narkotikabehandling på tværs af et stort antal zebrafisk larver. Samlet set er denne metode fordelagtig i forhold til traditionel cellekultur stof screening, da det giver mulighed for vækst af tumorceller i en in vivo miljø i hele narkotikabehandling, og er mere praktisk og omkostningseffektiv end mus til store in vivo narkotika skærme.

Efter den ovenfor beskrevne protokol blev zebrafisk xenografted i æggeblomme og perikardiet med primær patient PBMC'er, der oprindeligt var isoleret fra en T-celle akut lymfoblastær leukæmi (T-ALL) patient ved diagnosen og bankede som en levedygtig, frossen prøve. Ved 48 hpi blev xenografted fisk screenet for fluorescerende mærkede tumorceller (Figur 2C,D) og behandlet med kemoterapi (dexamethason eller vincristin) eller DMSO. Fisk blev afbildet ved 7 dpi, efter 3 dage...

Watch this Scientific Journal Video about Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish at JoVE.com

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Zebrafisk xenograft modeller giver mulighed for høj-throughput narkotika screening og fluorescerende billeddannelse af menneskelige kræftceller i en in vivo mikromiljø. Vi udviklede en arbejdsgang for storstilet, automatiseret lægemiddelscreening på patientafledte leukæmiprøver i zebrafisk ved hjælp af en automatiseret fluorescensmikroskopudstyret billedenhed.

Drug Screening af primære patient afledt tumor xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Vores zebrafisk xenograft drug screening workflow giver mulighed for automatiseret billeddannelse og kvantificering af humane kræftceller og deres reaktion på narkotikabehandling. Det kan bruges til hurtigt at teste reaktionen af en tålmodighed kræftceller til kendte lægemidler eller til at identificere nye anticancer forbindelser. Ved hjælp af zebrafisk xenograph modeller og narkotika screening giver mulighed for Inviva replikant numre, der tidligere kun kunne fås med in vitro-systemer.Det er også langt mere omkostningseffektiv end musemodeller ved screening gennem store biblioteker af forbindelser. Denne arbejdsgang har flere trin fra tilråb af kræftceller i zebrafisk til billeddannelse af lægemiddelrespons, der læres bedst ved visuel demonstration. Til at begynde, centrifuge mindst to gange 10 til den sjette celler i fem millimeter PBS ved 200 gange g i fem minutter, og aspirere supernatant.Resuspend cellepaletten i fem millimeter dii farvning løsning. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius beskyttet mod lys i 20 minutter. Derefter vortex forsigtigt og inkubere cellerne på is i 15 minutter beskyttet mod lys.Derefter centrifuge cellerne ved 200 gange g i fem minutter og aspirere supernatant. Cellerne vaskes ved at tilsætte fem milliliter PBS, centrifugere ved 200 gange g i fem minutter og aspirere supernatanten. Gentag vasken en ekstra gang.Resuspend cellerne i en mikroliter PBS pr 250 tusind levende celler og overføre dem til en 1,5 millimeter mikro centrifuge rør. Hold de resuspenderede celler på is i mørke. Før farvning celler og indsprøjtning, gøre agarose plader til injektion ved at hælde 25 millileiers af tre procent agarose i 1X TBE i en petriskål og lad det størkne.Opbevar pladerne ved fire grader Celsius i op til to uger. Også før farvning celler og indsprøjtning, dechlorinere to dage efter befrugtning zebra fisk ved hjælp af sniver under en dissekere mikroskop. Træk fra den modsatte ende af den beskyttende chorion af zebra fisk med snævler, indtil chorion tårer og zebra fisk bliver uudviklet.For at forhindre sammenklumpning af celler under mikroinjektion, pre chill ikke filamentous borosilikat glas nåle ved fire grader Celsius eller på is. Umiddelbart efter farvning celler, bruge en mikroloader pipette spids til at indlæse fem mikroliter af farvede celler i den kølede nål. Læg nålen i mikroinjektorarmen.Niveau nålespidsen med et sterilt barberblad. Ved hjælp af et trinmikrometer måles dråbestørrelsen i mineralsk olie. Hold dråbevolumen konsekvent på to nanoliter, hvilket er omkring 1,5 millimeter i diameter.Et minut efter anæstesi, overføre bedøvet larver til en forberedt flad overflade injektion plade med tre procent agarose, og injicere larverne med en pumpe af farvede celler på det ønskede injektionssted. Alle injektioner skal afsluttes inden for en til tre timer efter farvning af cellerne for at forhindre sammenklumpning af nålen. Vaske larver fra injektion plade i en 10 centimeter petriskål indeholder E3 medier uden methylenblåt og inkuberes ved 28 grader Celsius for en time restitutionsperiode.Flyt skålen af den injicerede larver i en 34 grader Celsius inkubator. Med en tom petriskål placeret mellem hylden og petriskålen af larver til at fungere som en buffer. På 48 timer efter injektion, skærmen zebra fisk larver for fluorescerende tumorcelle engraftment og sundhed.Fjern eventuelle døde eller misdannede zebra fisk, og vælg zebra fisk med lignende engraftment. Fjern unengrafted zebra fisk. For æggeblomme injiceret fisk, fjerne fisk, hvor grænserne for åget ikke kan ses omkring den engrafted cellemasse.For pericardium injiceret fisk, fjerne fisk, hvor injiceres cellemasse indgreb i æggeblomme sæk. For at overføre den valgte fisk til en 96-brønd plade, først skære spidsen af en 200 mikroliter pipette spids, lige stor nok til en fire dages post befrugtning zebra fisk til at passe igennem. Aspirere 150 mikroliter af E3-medier med en zebrafisk fra pladen ved hjælp af P200-pipetten, og tilsæt den til en tom brønd af en flad bundplade på 96 brønde.Tilføj 150 mikroliter af 2X fortyndet lægemiddelopløsning til hver brønd, der indeholder zebrafisklarver, for at nå et endeligt volumen på 300 mikroliter med 1X lægemiddelopløsning pr. brønd. Inkuber pladen ved 34 grader Celsius. Tjek for døde zebra fisk dagligt.Efter to dage, hvis det ønskes, genopfriske stoffet ved at erstatte 200 mikroliter af væske fra hver brønd med 1X stof løsning eller DMSO i E3 medier. I Zen blå software, fjerne alle uønskede fluorescerende kanaler i billedbehandling software og tilføje Dii kanal. Kontroller den ønskede lysstofrør.I samme vindue skal du vælge, hvordan billederne skal tages, Z-stakke, automatisering, sløjfer og serier osv. Billede DMSO kontrol fisk før stoffet behandlede fisk. Og indstille den relevante eksponeringstid i billedbehandlingssoftwaren.Hvis du vil kvantificere fluorescensen, skal du åbne imagej-softwaren. Gå til fil, åbn, og vælg den ønskede CZI-fil. Softwaren bringer en import muligheder vindue.Hvis du vil have stakvisning, skal du vælge hyperstacks, kontrollere åbne filer individuelt, kontrollere automatisk skalering og kontrollere opdelte kanaler. Vælg farveindstilling for farveindstillingen. Klik derefter på plugins, makroer, optag.Klik på billede, juster, tærskel. Vælg billedtype som rød i rullemenuen i højre side af tærskelvinduet. Juster minimumstærsklen, indtil softwaren kun fremhæver områder med fluorescens, og klik derefter på anvend.Softwaren konverterer billedet til sort og hvid med det valgte område i sort. Klik på analysér og målér. Softwaren trækker op et resultatvindue, der indeholder fluorescerende område for dette billede.Klik på Opret i vinduet med makrooptageren. Dette åbner et nyt vindue med koden til makroen. Fremhæv alle de ønskede billeder til analyse og åbne i henhold til stabling visning eller farve indstilling.Vælg Kør i vinduet med makroen. Resultatvinduet indeholder nu området for hvert billede. I denne protokol, på 48 timer efter injektion, xenografted fisk blev screenet for fluorescerende mærket tumorceller og behandlet med kemoterapi eller DMSO.Samlet set viste xenografted fisk behandlet med Vincristine det største og mest konsekvente fald i xenografted cellemasse sammenlignet med DMSO-behandlede fisk. Dexamethasonbehandlede fisk viste omkring halvdelen af reduktionen i tumorområdet sammenlignet med Vincristin. Men stadig viste en reduktion i tumor område i forhold til DMSO.Denne procedure kan bruges til at screene enhver kræftcelle linje eller patient prøve for reaktion på forskellige lægemidler eller specifikke målrettede behandlinger giver indsigt i hver patients tumor.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Mærkning af Breast Cancer Patient-afledte Xenografter med Sporbare Journalister for tumorvækst og Metastase Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Etablering af en primær kultur af Patient-afledte bløddelssarkom

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow flowcytometri for at vurdere leukæmi stamceller i primære akut Myeloid leukæmi og Patient-afledt-xenografts, på diagnose og følg op

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering og karakterisering af tumor initierende celler fra sarkom patient afledte Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-afledt heterogene xenograft model af kræft i bugspytkirtlen ved hjælp af Zebrafish larver som værter for sammenlignende Lægemiddelvurdering

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisk patient afledte 3D Sfæroider til anti-neoplastisk Drug screening for at målrette kræft stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

In vivo billeddannelse og Kvantitation af værten Angiogen respons i Zebrafish tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering af gastrisk Cancer patient afledte xenograft-modeller og primære cellelinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Test målrettede behandlinger i kræft ved hjælp af strukturel dna ændringsanalyse og patient-afledte Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Forbedret levedygtighed for Ex vivo 3D Hydrogel Kulturer af patient-afledte Xenografts i en perfunderet microfluidic platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...