Name: drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish
Uploaded: 2020-04-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door een V Foundation V Scholar Award en NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (aan J.S. Blackburn) en NIH Training Grant T32CA165990 (aan M.G. Haney).

Alle procedures beschreven in dit protocol zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Kentucky (protocol 2015-2225). Patiënt monsters werden verzameld onder de Universiteit van Kentucky's Institutional Review Board (protocol 44672). Alle dierproeven die volgens dit protocol worden uitgevoerd, moeten worden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de gebruiker.
1. Ontdooien primaire patiënt acute lymfooblastische leu...

<ol>
	<li>Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+human+malignant+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+embryos:+assessment+of+migration+and+cell+division+in+the+absence+of+tumor+formation.">The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).</li><li>Topczewska, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+tumorigenic+pathways+converge+via+Nodal+signaling:+role+in+melanoma+aggressiveness.">Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness.</a> Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).</li><li>Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukaemia+xenotransplantation+in+zebrafish--chemotherapy+response+assay+in+vivo.">Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo.</a> British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).</li><li>Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=15+years+of+zebrafish+chemical+screening.">15 years of zebrafish chemical screening.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).</li><li>Ghotra, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole+animal+bio-imaging+assay+for+human+cancer+dissemination.">Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination.</a> PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., W&#228;hlby, C., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).</li><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+automating+the+imaging+of+zebrafish+larvae.">Tools for automating the imaging of zebrafish larvae.</a> Methods. 96, 118-126 (2016).</li><li>Henn, K., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dechorionation+as+a+tool+to+improve+the+fish+embryo+toxicity+test+(FET)+with+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio).</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &amp; Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Embryo+Xenograft+and+Metastasis+Assay.">Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay.</a> Bio-Protocol. 8 (18), (2018).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Cold Spring Harbor Laboratory Press. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+medium+(for+zebrafish+embryos).">E3 medium (for zebrafish embryos).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).</li><li>Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Xenograft+Platform:+Evolution+of+a+Novel+Cancer+Model+and+Preclinical+Screening+Tool.">The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li><li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Engrafted+Human+Cancer+and+Therapy+Responses+in+Immunodeficient+Zebrafish.">Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish.</a> Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li></ol>

In deze studie demonstreerden we een gestandaardiseerde methode voor ontdooien en injecteren van primaire patiëntenleukemiecellen in zebravissen als xenograft-model. We hebben ook een protocol opgesteld voor high-throughput drug screening van xenografted zebrafish met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit en geautomatiseerde sampler unit. Eerder, xenografts zijn gemeld met menselijke cellijnen, en kwantificering van xenografted tumoren in een high-throughput manier is een uitdaging in het veld. ...

Xenografting van primaire patiëntkankerof menselijke kankercellijnen in modelorganismen is een veel gebruikte techniek om tumorprogressie en gedrag in vivo, tumorreactie op de behandeling van geneesmiddelen en de interactie van kankercellen met de micro-omgeving te bestuderen. Traditioneel worden cellen xenografted in immuun-gecompromitteerde muizen, en dit blijft de standaard in het veld. Dit modelsysteem heeft echter verschillende beperkingen, zoals hoge kosten, lage replicerengetallen, moeilijkheden bij het nauwkeurig kwantificeren van tumorlast in vivo en de langere tijd die het kost om tumoren te laten enten en medicijntests te voltooien. In de afgelopen jaren, zebravis zijn ontstaan als een alternatieve xenograft model, met de eerste wordt gemeld in 2005, met groene fluorescerende eiwitten (GFP) gelabeld menselijke melanoom cellijnen getransplanteerd in blastula-stadium embryo's1,2. Meer recent, 2 dagen na de bevruchting (dpf) zebravis larven zijn gebruikt als xenograft ontvangers om controle van anatomische locatie van injectie en voor gebruik in hoge resolutie in vivo beeldvorming van tumor interactie met de omringende micro-omgeving3,4.
Zebravissen bieden vele voordelen als een xenograft model. Ten eerste kunnen volwassen zebravis worden gehuisvest en snel worden gekweekt in grote hoeveelheden tegen relatief lage kosten. Elk paar volwassen zebravis kan honderden larvevissen per week produceren. Vanwege hun kleine omvang kunnen deze larve zebravissen worden onderhouden in 96-putplaten voor high-throughput drug screening. Larven hoeven niet te worden gevoed tijdens een typisch xenograft-experiment, omdat hun dooierzak de voedingsstoffen biedt om ze hun eerste week van het leven te ondersteunen. Bovendien hebben zebravissen pas om 7 dpf een volledig functioneel immuunsysteem, wat betekent dat ze geen bestraling of immunosuppressieve regimes nodig hebben voorafgaand aan de xenograft-injectie. Ten slotte zorgen optisch heldere zebravislijnen voor hoge resolutie beeldvorming van tumor-micro-omgeving interacties.
Misschien wel de meest veelbelovende toepassing van zebravissen als een xenograft model is de mogelijkheid om high-throughput drug screening uit te voeren op menselijke kanker monsters op een manier die niet mogelijk is met behulp van een ander model organisme. Larven absorberen medicijnen uit het water via de huid, waardoor het gemak van toediening van geneesmiddelenwordt verbeterd 5. Omdat dieren worden onderhouden in 96-put platen, meestal in 100−300 μL water, schermen vereisen kleinere hoeveelheden drugs in vergelijking met muizen. Momenteel zijn er verschillende methoden voor standaardisatie en kwantificering van het effect van geneesmiddelen op de menselijke tumorlast bij zebravissen, waarvan sommige praktischer zijn dan andere voor het opschalen van enkelvoudige medicijntests tot screening met een hoge doorvoer. Sommige groepen scheiden bijvoorbeeld vis in eencellige suspensie en kwantificeren fluorescerende of gekleurde tumorcellen door individuele druppels van de suspensie te beeldvorming en fluorescentie te kwantificeren met behulp van een semi-geautomatiseerde ImageJ-macro4. Een semi-geautomatiseerde whole-larimaging methode werd ontwikkeld waarin larve vissen werden vastgesteld in 96-put platen en afgebeeld met behulp van een omgekeerde fluorescerende microscoop voor de herschikking van samengestelde beelden en kwantificering van tumorcel foci6. Beide testen zijn vrij arbeidsintensieve methoden voor kwantificering, die heeft gemaakt echt high-throughput drug screening in zebrafish xenograft modellen onpraktisch.
Dit probleem is aangepakt door de ontwikkeling van de Vertebrate Automated Screening Technology (VAST) Bioimager and Large Particle (LP) Sampler, een fluorescentiemicroscoop uitgeruste beeldverwerkingseenheid en geautomatiseerde sampler unit (Figuur 1 en Tabel van Materialen), dat is een echt geautomatiseerde methode voor high-throughput beeldvorming van zebravissen larven7,8,9. Met deze eenheid worden vissen verdoofd, automatisch bemonsterd van een 96-well plaat, gepositioneerd in een capillaire en gedraaid in de ingestelde oriëntatie op basis van een vooraf ingestelde gebruiker voorkeur, afgebeeld, en vervolgens ofwel terug geplaatst in dezelfde put van een nieuwe 96-well plaat voor verdere studies of weggegooid. Het combineren van deze beeldvormende technologie met zebravissen xenografts kan zorgen voor de mogelijkheid van gepersonaliseerde geneeskunde die high-throughput drug screening van grote drug samengestelde bibliotheken tegen individuele patiënt tumoren gebruikt. Zebrafish xenografts bieden ook een grootschalige en goedkope methode voor het testen van zowel toxiciteit en werkzaamheid van nieuwe verbindingen in vivo. Zebravissen kunnen worden gebruikt als een voorlopige screening stap alvorens over te gaan tot muis xenograft modellen.
We hebben een gestroomlijnde workflow ontwikkeld voor xenografting primary patient leukemie cellen in zebravissen en het uitvoeren van high-throughput drug schermen met geautomatiseerde beeldvorming en kwantificering, die kan worden toegepast op elke andere primaire patiënt tumorcellen of kankercelllijn. Deze workflow maakte gebruik van een fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit en geautomatiseerde sampler unit om te verbeteren op de huidige standaardisatie en kwantificering methoden en biedt een geautomatiseerd alternatief voor eerdere, meer arbeidsintensieve methoden voor het kwantificeren van tumormassa in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10x TBE Liquid Concentrate</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:115px;">0658-5L</td>
			<td style="width:360px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">96-well plate, flat bottom</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229195</td>
			<td style="width:360px;">VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Agarose</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Borosilicate Glass Capillary without Filament</td>
			<td style="width:139px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:115px;">B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-EI126-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E3 media</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Femtotips Microloader Tips</td>
			<td style="width:139px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:115px;">930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td>FIJI</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Large Particle (LP) Sampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methotrexate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6770-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral Oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>PBL06-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stage Micrometer (400-Stage)</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>400-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:139px;">Pentair Aquatic</td>
			<td style="width:115px;">TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">VAST Bioimager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vincristine Sulfate</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T117-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vybrant DiI Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>V22885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish

Patiënt afgeleide xenograft modellen zijn van cruciaal belang bij het definiëren van hoe verschillende vormen van kanker reageren op medicamenteuze behandeling in een in vivo systeem. Muis modellen zijn de standaard in het veld, maar zebravis zijn ontstaan als een alternatief model met verschillende voordelen, waaronder de mogelijkheid voor high-throughput en low-cost drug screening. Zebravissen maken ook in vivo drug screening met grote repliceren nummers die voorheen alleen verkrijgbaar waren met in vitro systemen. De mogelijkheid om snel uit te voeren grootschalige drug schermen kan openen de mogelijkheid voor gepersonaliseerde geneeskunde met een snelle vertaling van de resultaten terug naar de kliniek. Zebrafish xenograft modellen kunnen ook worden gebruikt om snel te screenen op bruikbare mutaties op basis van tumor respons op gerichte therapieën of om nieuwe anti-kanker verbindingen uit grote bibliotheken te identificeren. De huidige grote beperking in het veld is het kwantificeren en automatiseren van het proces, zodat drug schermen kunnen worden gedaan op grotere schaal en minder arbeidsintensief. We hebben een workflow ontwikkeld voor het xenograften van primaire patiëntmonsters in zebravissenlarven en het uitvoeren van grootschalige drugsschermen met behulp van een met fluorescentiemicroscoop uitgeruste beeldverwerkingseenheid en geautomatiseerde sampler-eenheid. Deze methode maakt standaardisatie en kwantificering van geënte tumorgebied en reactie op de behandeling van geneesmiddelen in grote aantallen zebravissen larven. Over het algemeen is deze methode voordelig ten opzichte van traditionele celkweekmedicijnscreening, omdat het de groei van tumorcellen in een in vivo-omgeving tijdens de behandeling van geneesmiddelen mogelijk maakt en praktischer en kosteneffectiever is dan muizen voor grootschalige in vivo-medicijnschermen.

Volgens het hierboven beschreven protocol werden zebravissen xenografted in de dooier en het hartzakje met primaire patiënt PBMC's die oorspronkelijk werden geïsoleerd van een T-cel acute lymfolastische leukemie (T-ALL) patiënt bij diagnose en gebanked als een levensvatbaar, bevroren monster. Bij 48 pki werden xenografted vissen gescreend op fluorescerende tumorcellen (Figuur 2C,D) en behandeld met chemotherapie (dexamethason of vincristine) of DMSO. Vissen werden afgebee...

Watch this Scientific Journal Video about Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish at JoVE.com

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Zebrafish xenograft modellen zorgen voor high-throughput drug screening en fluorescerende beeldvorming van menselijke kankercellen in een in vivo micro-omgeving. We ontwikkelden een workflow voor grootschalige, geautomatiseerde medicijnscreening op patiënt-afgeleide leukemiemonsters bij zebravissen met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit.

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Onze zebrafish xenograft drug screening workflow zorgt voor geautomatiseerde beeldvorming en kwantificering van menselijke kankercellen en hun reactie op medicamenteuze behandeling. Het kan worden gebruikt om snel te testen van de reactie van kankercellen van een geduld op bekende geneesmiddelen of om nieuwe antikanker verbindingen te identificeren. Met behulp van zebravis xenograaf modellen en drug screening zorgt voor Inviva replicant nummers die voorheen alleen verkrijgbaar waren met in vitro systemen.Het is ook veel kosteneffectiever dan muismodellen bij het screenen door middel van grote bibliotheken van verbindingen. Deze workflow heeft verschillende stappen van interjectie van kankercellen in zebravissen tot beeldvorming van de reactie van geneesmiddelen die het beste worden geleerd door visuele demonstratie. Om te beginnen, centrifugeren een minimum van twee keer 10 tot de zesde cellen in vijf millimeter PBS op 200 keer g gedurende vijf minuten, en aspirate de supernatant.Resuspend het celpalet in vijf millimeter dii kleuroplossing. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius beschermd tegen licht gedurende 20 minuten. Dan vortex voorzichtig en incubeer de cellen op ijs gedurende 15 minuten beschermd tegen licht.Centrifugeer de cellen vervolgens vijf minuten op 200 keer g en loker de supernatant aan. Was de cellen door het toevoegen van vijf milliliter PBS, centrifugeren op 200 keer g gedurende vijf minuten, en aspirating de supernatant. Herhaal de was een extra tijd.Resuspend de cellen in een microliter van PBS per 250 duizend levende cellen en breng ze naar een 1,5 millimeter micro centrifuge buis. Houd de geresuspended cellen op ijs in het donker. Voorafgaand aan het bevlekken van cellen en injecteren, maak agarose platen voor het injecteren door gieten 25 millileeriers van drie procent agarose in 1X TBE in een petrischaal en laat het stollen.Bewaar de platen maximaal twee weken op vier graden Celsius. Ook voorafgaand aan het beitsen van cellen en injecteren, dechlorinate twee dagen na bevruchting zebra vissen met behulp van tangen onder een ontleden microscoop. Trek van de tegenovergestelde einden van het beschermende chorion van de zebravissen met tangen tot de chorionscheuren en de zebravissen unenveloped worden.Om klonteren van cellen tijdens microinjectie te voorkomen, pre chill niet filamenteuze borosilicaat glasnaalden op vier graden Celsius of op ijs. Onmiddellijk na het bevlekken van cellen, gebruik maken van een microloader pipet tip om vijf microliter van gekleurde cellen te laden in de gekoelde naald. Laad de naald in de microinjectorarm.Niveau van de naald tip met behulp van een steriel scheermesje. Met behulp van een fase micrometer, meet de druppelgrootte in minerale olie. Houd het druppelvolume constant op twee nanoliter, dat is ongeveer 1,5 millimeter in diameter.Breng de verdoofde larven een minuut na de verdoving over op een voorbereide vlakke oppervlakteinjectieplaat met drie procent agarose en injecteer de larven met één pomp gekleurde cellen op de gewenste injectieplaats. Alle injecties moeten binnen één tot drie uur na het bevlekken van de cellen worden voltooid om samenklonteren van de naald te voorkomen. Was de larven van de injectieplaat in een petrischaaltje van 10 centimeter met E3-media zonder methyleenblauw en incubeer bij 28 graden Celsius gedurende een herstelperiode van een uur.Verplaats de schotel van de geïnjecteerde larven in een 34 graden Celsius incubator. Met een lege petrischaal geplaatst tussen de plank en de petrischaal van larven om als buffer te fungeren. Bij 48 uur na injectie screenen zebravissen larven op fluorescerende tumorcelen engraftment en gezondheid.Verwijder dode of misvormde zebravissen en selecteer zebravissen met vergelijkbare engraftment. Verwijder ongeengrafeerde zebravissen. Voor dooier geïnjecteerd vis, verwijder vis waar grenzen van het juk niet kan worden gezien rond de gegrafeerde celmassa.Voor pericardium geïnjecteerde vis, verwijder vis waar geïnjecteerde cel massa encroaches in de dooier zak. Om de geselecteerde vis over te brengen naar een 96-put plaat, eerst snijd de tip uit een 200 microliter pipet tip, net groot genoeg voor een vier dagen na bemesting zebra vissen om door te passen. Aspirate 150 microliters van E3 media met een zebra vis van de plaat met behulp van de P200 pipet en voeg het toe aan een lege put van een platte bodem 96-put plaat.Voeg 150 microliters 2x verdunde geneesmiddelenoplossing toe aan elke put die zebravislarven bevat om een eindvolume van 300 microliters te bereiken met 1x medicijnoplossing per put. Broed de plaat uit op 34 graden Celsius. Controleer dagelijks op dode zebravissen.Na twee dagen, indien gewenst, vernieuw het medicijn door 200 microliter vloeistof uit elke put te vervangen door 1X-medicijnoplossing of DMSO in E3-media. Verwijder in de Zen-blauwe software alle ongewenste tl-kanalen in de beeldsoftware en voeg het Dii-kanaal toe. Controleer het gewenste tl-kanaal.Selecteer in hetzelfde venster hoe de beelden worden gemaakt, Z-stacks, automatisering, lussen en series, et cetera. Beeld de DMSO controle vissen voor de drug behandelde vissen. En stel de juiste belichtingstijd in de beeldsoftware.Om de fluorescentie te kwantificeren, open imagej software. Ga naar het bestand, open en selecteer het gewenste CZI-bestand. De software brengt een venster met importopties.Selecteer hyperstacks voor het bekijken van stapels, selecteer bestanden afzonderlijk, controleer de automatische schaal en controleert gesplitste kanalen. Selecteer voor de optie kleur de optie Kleur. Klik vervolgens op plug-ins, macro's, opnemen.Klik op afbeelding, aanpassen, drempel. Selecteer afbeeldingstype als rood in het vervolgkeuzemenu aan de rechterkant van het drempelvenster. Pas de minimumdrempel aan totdat de software alleen gebieden met fluorescentie markeert en klik op toepassen.De software zet de foto om naar zwart-wit met het geselecteerde gebied in het zwart. Klik op analyseren en meten. De software trekt een resultatenvenster omhoog dat het fluorescerende gebied voor dat beeld bevat.Klik op maken in het macrorecordervenster. Hiermee wordt een nieuw venster geopend met de code voor de macro. Markeer alle gewenste afbeeldingen voor analyse en open volgens de weergave- of kleuroptie stapelen.Selecteer uitvoeren op het venster met de macro. Het resultatenvenster bevat nu het gebied voor elke afbeelding. In dit protocol, bij 48 uur na injectie, xenografted vis werden gescreend op fluorescerend gelabelde tumorcellen en behandeld met chemotherapie of DMSO.Over het algemeen vertoonde xenografeerde vis die met Vincristine werd behandeld de grootste en meest consistente daling van de xenograftedcelmassa in vergelijking met DMSO behandelde vis. Dexamethasone behandelde vis toonde ongeveer de helft van de vermindering van het tumorgebied in vergelijking met Vincristine. Maar nog steeds toonde een vermindering van het tumorgebied in vergelijking met DMSO.Deze procedure kan worden gebruikt om een kankercellijn of patiëntenmonster te screenen op reactie op verschillende geneesmiddelen of specifieke gerichte therapieën die inzicht geven in de tumor van elke patiënt.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Etikettering van borstkanker-Patient afgeleid Xenograften met Traceable Verslaggevers voor tumorgroei en metastase Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Oprichting van een primaire cultuur van patiënt-afgeleide weke delen Sarcoom

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Stroom Cytometry om te schatten leukemie cellen van de stam in primaire Acute myeloïde leukemie en patiënt-afgeleid-xenografts, bij diagnose en Follow Up

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolatie en karakterisering van tumor initiërende cellen uit Sarcoom patiënt-afgeleide xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Door patiënten afgeleid heterogeen xenograft-model van pancreaskanker met behulp van zebravis larven als gastheer voor vergelijkende geneesmiddelenbeoordeling

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

In vivo beeldvorming en Kwantatie van de gastheer Angiogenic respons in zebravis tumor xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Oprichting van maagkanker patiënten afgeleide xenograft modellen en primaire cellijnen

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testen gerichte therapieën bij kanker met behulp van structurele DNA-wijzigingsanalyse en patiënt-afgeleide Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Verbeterde levensvatbaarheid voor Ex vivo 3D Hydrogel Culturen van patiënt-afgeleide Xenografts in een perfused microfluïdisch platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...