Name: drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish
Uploaded: 2020-04-10T14:00:00
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Cette recherche a été appuyée par un V Foundation V Scholar Award et des NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (à J.S. Blackburn) et la subvention de formation des NIH T32CA165990 (à M.G. Haney).

Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Kentucky (protocole 2015-2225). Des échantillons de patients ont été prélevés par la Commission d’examen institutionnel de l’Université du Kentucky (protocole 44672). Toutes les expériences animales effectuées à la suite de ce protocole doivent être approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’utilisat...

<ol>
	<li>Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+human+malignant+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+embryos:+assessment+of+migration+and+cell+division+in+the+absence+of+tumor+formation.">The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).</li><li>Topczewska, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+tumorigenic+pathways+converge+via+Nodal+signaling:+role+in+melanoma+aggressiveness.">Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness.</a> Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).</li><li>Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole+animal+bio-imaging+assay+for+human+cancer+dissemination.">Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination.</a> PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., W&#228;hlby, C., Yanik, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Embryo+Xenograft+and+Metastasis+Assay.">Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay.</a> Bio-Protocol. 8 (18), (2018).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Cold Spring Harbor Laboratory Press. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+medium+(for+zebrafish+embryos).">E3 medium (for zebrafish embryos).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).</li><li>Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Xenograft+Platform:+Evolution+of+a+Novel+Cancer+Model+and+Preclinical+Screening+Tool.">The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li><li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Engrafted+Human+Cancer+and+Therapy+Responses+in+Immunodeficient+Zebrafish.">Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish.</a> Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li></ol>

Dans cette étude, nous avons démontré une méthode normalisée pour la décongélation et l’injection des cellules laucémiques des patients primaires dans le poisson zèbre comme modèle de xénogreffe. Nous avons également établi un protocole pour le dépistage à haut débit des poissons zèbres xénogreffes à l’aide d’une unité d’imagerie équipée d’un microscope à fluorescence et d’une unité d’échantillonneur automatisé. Précédemment, des xénogreffes ont été rapportées avec des ligné...

Xenografting des cancers primaires de patient ou des lignées humaines de cellules cancéreuses dans les organismes modèles est une technique largement utilisée pour étudier la progression et le comportement de tumeur in vivo, la réponse de tumeur au traitement de drogue, et l’interaction de cellules cancéreuses avec le microenvironnement, entre autres. Traditionnellement, les cellules sont xénogreffées dans des souris immunodéprimées, ce qui reste la norme sur le terrain. Cependant, ce système modèle a plusieurs limitations, telles que le coût élevé, les nombres bas de réplique, les difficultés à quantifier avec précision la charge de tumeur in vivo, et le temps prolongé qu’il faut pour que les tumeurs à l’engraft et le test de drogue pour être accompli. Ces dernières années, le poisson zèbre est apparu comme un modèle alternatif de xénogreffe, avec le premier signalé en 2005, avec des lignées de cellules de mélanome humain étiquetées protéine fluorescente verte (GFP) transplantées dans des embryons de stade blastule1,2. Plus récemment, 2 jours après la fertilisation (dpf) larves de poisson zèbre ont été utilisés comme destinataires de xénogreffe pour permettre le contrôle de l’emplacement anatomique de l’injection et pour une utilisation dans l’imagerie in vivo à haute résolution de l’interaction tumorale avec le microenvironnement environnant3,4.
Le poisson zèbre offre de nombreux avantages en tant que modèle de xénogreffe. Tout d’abord, le poisson zèbre adulte peut être logé et rapidement élevé en grandes quantités à un coût relativement faible. Chaque paire d’accouplement de poissons zèbres adultes peut produire des centaines de poissons larvés par semaine. En raison de leur petite taille, ces poissons zèbres larvaires peuvent être maintenus dans des plaques de 96 puits pour le dépistage des médicaments à haut débit. Les larves n’ont pas besoin d’être nourries au cours d’une expérience typique de xénogreffe, car leur jaune-sac fournit les nutriments pour les soutenir pour leur première semaine de vie. En outre, les poissons zèbres n’ont pas un système immunitaire entièrement fonctionnel jusqu’à 7 dpf, ce qui signifie qu’ils ne nécessitent pas d’irradiation ou de régimes immunosuppresseurs avant l’injection de xénogreffe. Enfin, les lignes de poissons zèbres optiquement claires permettent l’imagerie à haute résolution des interactions tumeur-microenvironnement.
Peut-être l’application la plus prometteuse du poisson zèbre comme modèle de xénogreffe est la capacité d’effectuer le dépistage de médicaments à haut débit sur des échantillons de cancer humain d’une manière qui n’est pas possible en utilisant tout autre organisme modèle. Les larves absorbent les médicaments de l’eau à travers la peau, améliorant la facilité de l’administration de la drogue5. Étant donné que les animaux sont maintenus dans des assiettes de 96 puits, généralement dans 100 à 300 ll d’eau, les écrans nécessitent des quantités de médicaments plus petites que chez les souris. Actuellement, il existe plusieurs méthodes différentes pour la normalisation et la quantification de l’effet des médicaments sur le fardeau tumoral humain chez les poissons zèbres, dont certains sont plus pratiques que d’autres pour l’échelle des tests de dépistage de drogues simples à haut débit de dépistage. Par exemple, certains groupes dissocient les poissons en suspensions à cellule unique, et quantifient les cellules tumorales étiquetées fluorescentes ou tachées en imagerie des gouttelettes individuelles de la suspension et en quantifiant la fluorescence à l’aide d’une macro4imageJ semi-automatisée. Une méthode semi-automatisée d’imagerie des larves entières a été mise au point dans laquelle les poissons larvaire ont été fixés dans des plaques de 96 puits et photographiés à l’aide d’un microscope fluorescent inversé avant le réalignement des images composites et la quantification des foyers de cellules tumorales6. Ces deux essais sont des méthodes assez laborieuses pour la quantification, qui a rendu le dépistage de médicaments vraiment à haut débit dans les modèles de xénogreffe de poisson zèbre impraticable.
Cette question a été abordée par le développement de la technologie de dépistage automatisé des vertébrés (VAST) Bioimager et Large Particle (LP), une unité d’imagerie équipée d’un microscope à fluorescence et une unité d’échantillonneur automatisé(figure 1 et tableau des matériaux), qui est une méthode vraiment automatisée pour l’imagerie à haut débit des larves de poissons zèbres7,8,9. Avec cette unité, les poissons sont anesthésiés, échantillonnés automatiquement à partir d’une plaque de 96 puits, placés dans un capillaire et tournés dans l’orientation définie en fonction d’une préférence préétablique de l’utilisateur, photographié, puis soit remis dans le même puits d’une nouvelle plaque de 96 puits pour d’autres études ou jeté. La combinaison de cette technologie d’imagerie avec des xénogreffes de poisson zèbre peut permettre la possibilité d’un médicament personnalisé qui utilise le dépistage de médicaments à haut débit des grandes bibliothèques de composés de médicaments contre les tumeurs individuelles des patients. Les xénogreffes de poisson zèbre offrent également une méthode à grande échelle et à faible coût pour tester à la fois la toxicité et l’efficacité de nouveaux composés in vivo. Le poisson zèbre peut être utilisé comme étape préliminaire de dépistage avant de passer aux modèles de xénogreffe de souris.
Nous avons développé un flux de travail simplifié pour les cellules de leucémie des patients primaires de xenografting dans le poisson zèbre et effectuant des écrans de drogue à haut débit avec l’imagerie automatisée et la quantification, qui peuvent être appliquées à n’importe quelles autres cellules tumorales de patient primaire ou ligne de cellules cancéreuses. Ce flux de travail a utilisé une unité d’imagerie équipée de microscope de fluorescence et une unité d’échantillonneur automatisée pour améliorer les méthodes actuelles de normalisation et de quantification et offre une alternative automatisée aux méthodes précédentes et plus laborieuses de quantification de la masse tumorale in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10x TBE Liquid Concentrate</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:115px;">0658-5L</td>
			<td style="width:360px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">96-well plate, flat bottom</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229195</td>
			<td style="width:360px;">VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Agarose</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Borosilicate Glass Capillary without Filament</td>
			<td style="width:139px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:115px;">B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-EI126-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E3 media</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Femtotips Microloader Tips</td>
			<td style="width:139px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:115px;">930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td>FIJI</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Large Particle (LP) Sampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methotrexate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6770-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral Oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>PBL06-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stage Micrometer (400-Stage)</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>400-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:139px;">Pentair Aquatic</td>
			<td style="width:115px;">TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">VAST Bioimager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vincristine Sulfate</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T117-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vybrant DiI Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>V22885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish

Les modèles de xénogreffe dérivés des patients sont essentiels pour définir comment différents cancers réagissent au traitement médicamenteux dans un système in vivo. Les modèles de souris sont la norme dans le domaine, mais le poisson zèbre a émergé comme un modèle alternatif avec plusieurs avantages, y compris la capacité pour le haut débit et le dépistage des médicaments à faible coût. Le poisson zèbre permet également le dépistage in vivo des médicaments avec un grand nombre de répliques qui n’étaient auparavant disponibles qu’avec des systèmes in vitro. La capacité d’effectuer rapidement des écrans de médicaments à grande échelle peut ouvrir la possibilité de la médecine personnalisée avec une traduction rapide des résultats de retour à la clinique. Les modèles de xénogreffe de poisson-zèbre pourraient également être employés pour dépister rapidement des mutations actionnables basées sur la réponse tumorale aux thérapies ciblées ou pour identifier de nouveaux composés anticancéreux des grandes bibliothèques. La principale limitation actuelle dans le domaine a été la quantification et l’automatisation du processus afin que les écrans de drogue puissent être effectués à plus grande échelle et être moins exigeants en main-d’œuvre. Nous avons mis au point un flux de travail pour les échantillons primaires de patients de xenografting dans les larves de poissons zèbres et effectuant des écrans de drogue à grande échelle utilisant une unité d’imagerie équipée de microscope de fluorescence et unité automatisée d’échantillonneur. Cette méthode permet la normalisation et la quantification de la zone tumorale engrafted et la réponse au traitement de drogue à travers un grand nombre de larves de poisson zèbre. Dans l’ensemble, cette méthode est avantageuse par rapport au dépistage traditionnel des médicaments de culture cellulaire car elle permet la croissance des cellules tumorales dans un environnement in vivo tout au long du traitement de drogue, et est plus pratique et rentable que les souris pour les écrans de drogue in vivo à grande échelle.

Suivant le protocole décrit ci-dessus, le poisson zèbre a été xénogrefted dans le jaune et le péricarde avec le patient primaire PBMCs qui ont été à l’origine isolés d’un T-cellule aigue patiente de leucémie lymphoblastique (T-ALL) patient au diagnostic et incliné comme un échantillon viable et congelé. À 48 hpi, les poissons xénogreffiés ont été examinés pour les cellules tumorales étiquetées fluorescentes(figure 2C,D) et traités avec la chimioth?...

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Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Les modèles de xénogreffe de poisson zèbre permettent le dépistage des médicaments à haut débit et l’imagerie fluorescente des cellules cancéreuses humaines dans un microenvironnement in vivo. Nous avons mis au point un flux de travail pour le dépistage automatisé à grande échelle des médicaments sur des échantillons de leucémie dérivés du patient chez le poisson zèbre à l’aide d’une unité d’imagerie automatisée équipée d’un microscope à fluorescence.

Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Notre flux de travail de dépistage des médicaments contre la xénogreffe du poisson zèbre permet l’imagerie automatisée et la quantification des cellules cancéreuses humaines et leur réponse au traitement médicamenteux. Il peut être utilisé pour tester rapidement la réponse des cellules cancéreuses d’une patience à des médicaments connus ou pour identifier de nouveaux composés anticancéreux. L’utilisation de modèles xénographiques de poisson zèbre et de dépistage des médicaments permet d’obtenir des nombres réplicateurs Inviva qui n’étaient auparavant disponibles qu’avec des systèmes in vitro.Il est également beaucoup plus rentable que les modèles de souris lors du criblage à travers de grandes bibliothèques de composés. Ce flux de travail a plusieurs étapes de l’interjection des cellules cancéreuses chez le poisson zèbre à l’imagerie de la réponse médicamenteuses qui sont mieux apprises par la démonstration visuelle. Pour commencer, centrifugeuse un minimum de deux fois 10 à la sixième cellule en cinq millimètres de PBS à 200 fois g pendant cinq minutes, et aspirer le supernatant.Resuspendez la palette cellulaire en cinq millimètres de solution de coloration dii. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius à l’abri de la lumière pendant 20 minutes. Puis vortex doucement et incuber les cellules sur la glace pendant 15 minutes à l’abri de la lumière.Puis centrifuger les cellules à 200 fois g pendant cinq minutes et aspirer le supernatant. Lavez les cellules en ajoutant cinq millilitres de PBS, en centrifugant à 200 fois g pendant cinq minutes et en aspirant le surnatant. Répétez le lavage une fois de plus.Resuspendez les cellules dans un microlitre de PBS pour 250 000 cellules vivantes et transférez-les dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millimètre. Gardez les cellules résuspendées sur la glace dans l’obscurité. Avant de tacher les cellules et de s’injecter, faire des plaques d’agarose pour l’injection en versant 25 millileiers de trois pour cent d’agarose en 1X TBE dans une boîte de Pétri et lui permettre de se solidifier.Conserver les assiettes à quatre degrés Celsius jusqu’à deux semaines. Aussi avant de tacher les cellules et de s’injecter, déchlorer deux jours après la fécondation des poissons zèbres à l’aide de forceps sous un microscope dissection. Tirez des extrémités opposées de la chorion protectrice du poisson zèbre avec des forceps jusqu’à ce que les larmes de chorion et le poisson zèbre devient unnveloped.Pour éviter l’agglutination des cellules pendant la microinjection, pré-refroidir les aiguilles en verre borosilicate non filamenteux à quatre degrés Celsius ou sur la glace. Immédiatement après la coloration des cellules, utilisez une pointe de pipette de microchargeur pour charger cinq microlitres de cellules tachées dans l’aiguille réfrigérée. Chargez l’aiguille dans le bras du microinjecteur.Niveler la pointe de l’aiguille à l’aide d’une lame de rasoir stérile. À l’aide d’un micromètre de stade, mesurer la taille des gouttelettes dans l’huile minérale. Gardez le volume de gouttelettes uniformément à deux nanolitres, qui est d’environ 1,5 millimètres de diamètre.Une minute après l’anesthésie, transférez les larves anesthésiées dans une plaque d’injection de surface plate préparée avec 3 % d’agarose et injectez aux larves une pompe de cellules tachées au site d’injection désiré. Toutes les injections doivent être effectuées dans un délai d’une à trois heures après la coloration des cellules pour éviter l’agglutination de l’aiguille. Lavez les larves de la plaque d’injection dans une boîte de Pétri de 10 centimètres contenant des supports E3 sans bleu méthylène et incubez à 28 degrés Celsius pendant une période de récupération d’une heure.Déplacez le plat des larves injectées dans un incubateur de 34 degrés Celsius. Avec une boîte de Pétri vide placée entre l’étagère et la boîte de Pétri des larves pour agir comme un tampon. À 48 heures après injection, filtrez les larves de poissons zèbres pour l’engraftment fluorescent de cellules de tumeur et la santé.Enlevez tout poisson zèbre mort ou malformé et sélectionnez les poissons zèbres avec un engraftment similaire. Retirer les poissons zèbres non greffés. Pour les poissons injectés par le jaune, retirez les poissons là où les bordures du joug ne peuvent pas être vues autour de la masse cellulaire greffée.Pour les poissons injectés au péricarde, retirer les poissons où la masse cellulaire injectée empiète dans le sac à jaunes. Pour transférer le poisson sélectionné dans une assiette de 96 puits, coupez d’abord la pointe d’une pointe de pipette de 200 microlitres, juste assez grande pour qu’un poisson zèbre de quatre jours après la fécondation s’adapte à travers. Aspirer 150 microlitres de médias E3 avec un poisson zèbre de l’assiette à l’aide de la pipette P200 et l’ajouter à un puits vide d’une plaque à fond plat de 96 puits.Ajouter 150 microlitres de solution médicamenteuses diluée 2X à chaque puits contenant des larves de poissons zèbres pour atteindre un volume final de 300 microlitres avec 1X solution médicamenteuses par puits. Incuber la plaque à 34 degrés Celsius. Vérifiez tous les jours la mort des poissons zèbres.Après deux jours, si désiré, rafraîchissez le médicament en remplaçant 200 microlitres de liquide de chaque puits par une solution médicamenteuses 1X ou DMSO dans les médias E3. Dans le logiciel Zen blue, supprimez tous les canaux fluorescents indésirables dans le logiciel d’imagerie et ajoutez le canal Dii. Vérifiez le canal fluorescent désiré.Dans la même fenêtre, sélectionnez la façon dont les images seront prises, les piles Z, l’automatisation, les boucles et les séries, et cetera. Image le poisson de contrôle de DMSO avant que le poisson traité de drogue. Et définissez le temps d’exposition approprié dans le logiciel d’imagerie.Pour quantifier la fluorescence, ouvrez le logiciel imagej. Allez déposer, ouvrez et sélectionnez le fichier CZI désiré. Le logiciel apporte une fenêtre d’options d’importation.Pour la visualisation de pile, sélectionnez hyperstacks, vérifiez les fichiers ouverts individuellement, vérifiez l’échelle automatique, et vérifiez les canaux divisés. Pour l’option couleur, sélectionnez colorisé. Cliquez ensuite sur plugins, macros, enregistrer.Cliquez sur l’image, ajustez, seuilz. Sélectionnez le type d’image comme rouge dans le menu drop down sur le côté droit de la fenêtre seuil. Ajustez le seuil minimum jusqu’à ce que le logiciel ne met en évidence que les zones de fluorescence, puis cliquez sur appliquer.Le logiciel convertit la photo en noir et blanc avec la zone sélectionnée en noir. Cliquez sur analyser et mesurer. Le logiciel tire vers le haut d’une fenêtre de résultats contenant la zone fluorescente pour cette image.Cliquez sur créer sur la fenêtre de l’enregistreur macro. Cela ouvre une nouvelle fenêtre avec le code pour la macro. Mettez en surbrillance toutes les images désirées pour analyse et ouvrez en fonction de l’empilage de visualisation ou de l’option couleur.Sélectionnez exécuter sur la fenêtre avec la macro. La fenêtre de résultats contient maintenant la zone pour chaque image. Dans ce protocole, à 48 heures après injection, les poissons xénogreffe ont été examinés pour les cellules fluorescentes de tumeur étiquetées et traités avec la chimiothérapie ou le DMSO.Dans l’ensemble, les poissons xénogreffes traités avec de la vincristine ont montré la diminution la plus importante et la plus constante de la masse cellulaire xénogreffe par rapport aux poissons traités par le DMSO. Dexaméthasone poissons traités ont montré environ la moitié de la réduction de la zone tumorale par rapport à vincristine. Mais toujours montré une réduction de la zone tumorale par rapport à DMSO.Cette procédure peut être utilisée pour dépister n’importe quelle lignée de cellules cancéreuses ou échantillon de patient pour la réponse à différents médicaments ou thérapies ciblées spécifiques donnant un aperçu de la tumeur de chaque patient.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Étiquetage des xénogreffes de patients dérivés cancer du sein avec traçables Reporters pour la croissance tumorale et la métastase études

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Recherche

Recherche en cancérologie

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Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Cytométrie en flux pour estimer la leucémie des cellules souches dans la leucémie myéloïde aiguë primaire et Patient-dérivés-xénogreffes, diagnostic et suivre vers le haut

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Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

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