Name: drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish
Uploaded: 2020-04-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish at JoVE.com

Diese Forschung wurde durch einen V Foundation V Scholar Award und NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (zu J.S. Blackburn) und NIH Training Grant T32CA165990 (an M.G. Haney) unterstützt.

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Kentucky (Protokoll 2015-2225) genehmigt. Patientenproben wurden im Rahmen des Institutional Review Board der University of Kentucky (Protokoll 44672) gesammelt. Alle Tierversuche, die nach diesem Protokoll durchgeführt werden, müssen vom Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss des Benutzers genehmigt werden.
1. Auftauen primärer Patient akute lymphoblastische L...

<ol>
	<li>Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+human+malignant+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+embryos:+assessment+of+migration+and+cell+division+in+the+absence+of+tumor+formation.">The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).</li><li>Topczewska, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+tumorigenic+pathways+converge+via+Nodal+signaling:+role+in+melanoma+aggressiveness.">Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness.</a> Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).</li><li>Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukaemia+xenotransplantation+in+zebrafish--chemotherapy+response+assay+in+vivo.">Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo.</a> British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).</li><li>Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=15+years+of+zebrafish+chemical+screening.">15 years of zebrafish chemical screening.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).</li><li>Ghotra, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole+animal+bio-imaging+assay+for+human+cancer+dissemination.">Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination.</a> PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., W&#228;hlby, C., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).</li><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+automating+the+imaging+of+zebrafish+larvae.">Tools for automating the imaging of zebrafish larvae.</a> Methods. 96, 118-126 (2016).</li><li>Henn, K., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dechorionation+as+a+tool+to+improve+the+fish+embryo+toxicity+test+(FET)+with+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio).</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &amp; Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Embryo+Xenograft+and+Metastasis+Assay.">Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay.</a> Bio-Protocol. 8 (18), (2018).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Cold Spring Harbor Laboratory Press. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+medium+(for+zebrafish+embryos).">E3 medium (for zebrafish embryos).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).</li><li>Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Xenograft+Platform:+Evolution+of+a+Novel+Cancer+Model+and+Preclinical+Screening+Tool.">The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li><li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Engrafted+Human+Cancer+and+Therapy+Responses+in+Immunodeficient+Zebrafish.">Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish.</a> Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li></ol>

In dieser Studie haben wir eine standardisierte Methode zum Auftauen und Einspritzen von primären Leukämiezellen bei Patienten in Zebrafische als Xenograft-Modell demonstriert. Wir haben auch ein Protokoll für das Hochdurchsatz-Arzneimittelscreening von xenografierten Zebrafischen mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Bildgebungseinheit und einer automatisierten Probenehmereinheit erstellt. Bisher wurden Xenografts mit menschlichen Zelllinien berichtet, und die Quantifizierung von xenografted Tumoren in einer Hochdurchsa...

Xenografting von Primärpatientenkrebs oder menschlichen Krebszelllinien in Modellorganismen ist eine weit verbreitete Technik zur Untersuchung der Tumorprogression und des Verhaltens in vivo, der Tumorreaktion auf die medikamentöse Behandlung und der Interaktion von Krebszellen mit der Mikroumgebung. Traditionell werden Zellen in immungeschwächte Mäuse gexpfropt, und dies bleibt der Standard auf dem Gebiet. Dieses Modellsystem hat jedoch mehrere Einschränkungen, wie hohe Kosten, niedrige Replikationszahlen, Schwierigkeiten bei der genauen Quantifizierung der Tumorbelastung in vivo und die längere Zeit, die es für die Transplantation von Tumoren und die Abgeschlossenheit von Medikamententests benötigt. In den letzten Jahren sind Zebrafische als alternatives Xenograft-Modell entstanden, wobei das erste im Jahr 2005 berichtet wurde, mit grünen fluoreszierenden Proteinen (GFP)-markierten menschlichen Melanomzelllinien, die in Blastula-Stadium-Embryonentransplantiertwurden 1,2. In jüngerer Zeit wurden 2 Tage nach der Befruchtung (dpf) Zebrafischlarven als Xenograft-Empfänger verwendet, um die Kontrolle der anatomischen Injektionsortung zu ermöglichen und für den Einsatz in hochauflösender In-vivo-Bildgebung der Tumorinteraktion mit der umgebenden Mikroumgebung3,4.
Zebrafische bieten viele Vorteile als Xenograft-Modell. Erstens können erwachsene Zebrafische zu relativ geringen Kosten in großen Mengen untergebracht und gezüchtet werden. Jedes Paar erwachsener Zebrafische kann Hunderte von Larvenfischen pro Woche produzieren. Aufgrund ihrer geringen Größe können diese Larvenzebrafische in 96-Well-Platten für das Hochdurchsatz-Drogenscreening aufbewahrt werden. Larven müssen nicht im Rahmen eines typischen Xenograft-Experiments gefüttert werden, da ihr Eigelbsack die Nährstoffe liefert, um sie für ihre erste Lebenswoche zu erhalten. Darüber hinaus haben Zebrafische erst 7 dpf ein voll funktionsfähiges Immunsystem, was bedeutet, dass sie vor der Xenograft-Injektion keine Bestrahlung oder immunsuppressive Therapien benötigen. Schließlich ermöglichen optisch klare Zebrafischlinien eine hochauflösende Abbildung von Tumor-Mikro-Umgebungen.
Die vielleicht vielversprechendste Anwendung von Zebrafischen als Xenograft-Modell ist die Fähigkeit, drogenstarke Untersuchungen an menschlichen Krebsproben auf eine Weise durchzuführen, die mit keinem anderen Modellorganismus möglich ist. Larven absorbieren Medikamente aus dem Wasser durch die Haut, Verbesserung der Leichtigkeit der Medikamentenadministration5. Da Tiere in 96-Well-Platten gehalten werden, in der Regel in 100 bis 300 l Wasser, erfordern Sie kleinere Wirkstoffmengen im Vergleich zu Mäusen. Derzeit gibt es mehrere verschiedene Methoden zur Standardisierung und Quantifizierung der Wirkung von Medikamenten auf die menschliche Tumorbelastung bei Zebrafischen, von denen einige praktischer sind als andere für die Ausweitung einzelner Arzneimitteltests auf ein Hochdurchsatz-Screening. Einige Gruppen dissoziieren beispielsweise Fische in einzelzellige Suspensionen und quantifizieren fluoreszierend oder gefärbte Tumorzellen, indem sie einzelne Tröpfchen der Suspension bildgeben und die Fluoreszenz mit einem halbautomatischen ImageJ-Makro4quantifizieren. Es wurde ein halbautomatisches Ganzlarven-Bildgebungsverfahren entwickelt, bei dem Larvenfische in 96-Well-Platten fixiert und mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop vor der Neuausrichtung von zusammengesetzten Bildern und der Quantifizierung von Tumorzellfoci6abgebildet wurden. Beide Assays sind ziemlich arbeitsintensive Methoden zur Quantifizierung, die wirklich High-Throughput-Drogen-Screening in Zebrafisch Xenograft Modelle unpraktisch gemacht hat.
Dieses Problem wurde durch die Entwicklung der Wirbeltier-Automated Screening Technology (VAST) Bioimager and Large Particle (LP) Sampler, einer fluoreszenzmikroskopischen Bildgebungseinheit und automatisierten Probenehmereinheit (Abbildung 1 und Tabelle der Materialien) angegangen, die eine wirklich automatisierte Methode zur Hochdurchsatz-Bildgebung von Zebrafischlarven7,8,9ist. Mit dieser Einheit werden Fische beäpftisiert, automatisch aus einer 96-Well-Platte entnommen, in einer Kapillare positioniert und auf der Grundlage einer voreingestellten Benutzerpräferenz in die eingestellte Ausrichtung gedreht, abgebildet und dann entweder für weitere Studien in den gleichen Brunnen einer neuen 96-Well-Platte gelegt oder verworfen. Die Kombination dieser bildgebenden Technologie mit Zebrafisch-Xenografts kann die Möglichkeit einer personalisierten Medizin ermöglichen, die ein hochdurchsatziges Arzneimittelscreening großer Arzneimittelbibliotheken gegen einzelne Patiententumoren verwendet. Zebrafish Xenografts bieten auch eine groß angelegte und kostengünstige Methode zur Prüfung sowohl der Toxizität als auch der Wirksamkeit neuartiger Verbindungen in vivo. Zebrafische können als vorderer Screening-Schritt verwendet werden, bevor Sie zu Maus-Xenograft-Modellen übergehen.
Wir haben einen optimierten Workflow für die Xenogtransplantation von primären Leukämiezellen von Patienten in Zebrafische entwickelt und durchführen hochdurchsatzige Arzneimittelbildschirme mit automatisierter Bildgebung und Quantifizierung, die auf alle anderen primären Tumorzellen oder Krebszelllinien angewendet werden können. Dieser Workflow nutzte eine mit Fluoreszenzmikroskop ausgestattete Bildgebungseinheit und eine automatisierte Probenehmereinheit, um aktuelle Standardisierungs- und Quantifizierungsmethoden zu verbessern und bietet eine automatisierte Alternative zu früheren, arbeitsintensiveren Methoden zur Quantifizierung der Tumormasse in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10x TBE Liquid Concentrate</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:115px;">0658-5L</td>
			<td style="width:360px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">96-well plate, flat bottom</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229195</td>
			<td style="width:360px;">VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Agarose</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Borosilicate Glass Capillary without Filament</td>
			<td style="width:139px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:115px;">B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-EI126-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E3 media</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Femtotips Microloader Tips</td>
			<td style="width:139px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:115px;">930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td>FIJI</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Large Particle (LP) Sampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methotrexate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6770-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral Oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>PBL06-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stage Micrometer (400-Stage)</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>400-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:139px;">Pentair Aquatic</td>
			<td style="width:115px;">TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">VAST Bioimager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vincristine Sulfate</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T117-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vybrant DiI Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>V22885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish

Von Patienten abgeleitete Xenograft-Modelle sind entscheidend für die Definition, wie verschiedene Krebsarten auf die medikamentöse Behandlung in einem In-vivo-System reagieren. Mausmodelle sind der Standard auf dem Gebiet, aber Zebrafische haben sich als alternatives Modell mit mehreren Vorteilen herauskristallisiert, einschließlich der Fähigkeit für High-Throughput und Low-Cost-Drogen-Screening. Zebrafische ermöglichen auch in vivo-Arzneimittelscreenings mit großen Replikationszahlen, die bisher nur mit In-vitro-Systemen erhältlich waren. Die Fähigkeit, schnell großflächige Arzneimittel-Screens durchzuführen, kann die Möglichkeit für personalisierte Medizin mit schneller Übersetzung der Ergebnisse zurück in die Klinik eröffnen. Zebrafish Xenograft-Modelle könnten auch verwendet werden, um schnell auf umsetzbare Mutationen basierend auf Tumorreaktionen auf gezielte Therapien zu überprüfen oder um neue Krebsabwehrverbindungen aus großen Bibliotheken zu identifizieren. Die aktuelle Hauptbeschränkung in diesem Bereich war die Quantifizierung und Automatisierung des Prozesses, so dass Drogenbildschirme in größerem Maßstab durchgeführt werden können und weniger arbeitsintensiv sind. Wir haben einen Workflow für die Xenogtransplantation von primären Patientenproben in Zebrafischlarven und die Durchführung von großflächigen Medikamentensieben mit einer mit Fluoreszenzmikroskop ausgestatteten Bildgebungseinheit und einer automatisierten Probenehmereinheit entwickelt. Diese Methode ermöglicht die Standardisierung und Quantifizierung des transplantierten Tumorbereichs und die Reaktion auf die medikamentöse Behandlung über eine große Anzahl von Zebrafischlarven. Insgesamt ist diese Methode vorteilhaft gegenüber dem herkömmlichen Zellkultur-Arzneimittel-Screening, da sie das Wachstum von Tumorzellen in einer In-vivo-Umgebung während der gesamten medikamentösen Behandlung ermöglicht und praktischer und kostengünstiger ist als Mäuse für groß angelegte In-vivo-Medikamenten-Screenings.

Nach dem oben beschriebenen Protokoll wurden Zebrafische bei der Diagnose in das Eigelb und Perikard mit primären Patienten-PBMCs xenografiert, die ursprünglich von einem T-Zell-Patienten der akuten lymphatischen Leukämie (T-ALL) isoliert wurden, und als lebensfähige, gefrorene Probe gebrandmarkt. Bei 48 PSi wurden xenografierte Fische auf fluoreszierend markierte Tumorzellen untersucht (Abbildung 2C,D) und mit Chemotherapie (Dexamethason oder Vincristin) oder DMSO behan...

Watch this Scientific Journal Video about Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish at JoVE.com

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Zebrafish Xenograft-Modelle ermöglichen ein hochdurchsatziges Arzneimittelscreening und eine fluoreszierende Bildgebung menschlicher Krebszellen in einer in vivo Mikroumgebung. Wir haben einen Workflow für großangelegte, automatisierte Arzneimitteluntersuchungen an von Patienten abgeleiteten Leukämieproben in Zebrafischen mit hilfe einer automatisierten Fluoreszenzmikroskop-Bildgebungseinheit entwickelt.

Arzneimittel-Screening von Primärpatienten abgeleitetTumor Xenografts in Zebrafischen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Unser Zebrafish Xenograft-Arzneimittel-Screening-Workflow ermöglicht die automatisierte Bildgebung und Quantifizierung menschlicher Krebszellen und deren Reaktion auf die medikamentöse Behandlung. Es kann verwendet werden, um schnell die Reaktion einer Geduld Krebszellen auf bekannte Medikamente zu testen oder neue Anti-Krebs-Verbindungen zu identifizieren. Die Verwendung von Zebrafisch-Xenographenmodellen und Medikamentenscreening ermöglicht Inviva-Replikatzahlen, die bisher nur mit In-vitro-Systemen erhältlich waren.Es ist auch viel kostengünstiger als Mausmodelle beim Screening durch große Bibliotheken von Verbindungen. Dieser Workflow hat mehrere Schritte von der Interjektion von Krebszellen in Zebrafischen bis zur Bildgebung der Arzneimittelreaktion, die am besten durch visuelle Demonstration gelernt werden. Zunächst zentrifugieren Sie mindestens zwei mal 10 bis zu den sechsten Zellen in fünf Millimetern PBS bei 200 mal g für fünf Minuten, und aspirieren Sie den Überstand.Setzen Sie die Zellpalette in fünf Millimetern Dii-Färbungslösung aus. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten vor Licht geschützt. Dann wirbeln Sie sanft und inkubieren Sie die Zellen auf Eis für 15 Minuten vor Licht geschützt.Zentrifugieren Sie dann die Zellen fünf Minuten lang bei 200 mal g und aspirieren Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen, indem Sie fünf Milliliter PBS hinzufügen, fünf Minuten lang bei 200 mal g zentrieren und den Überstand anstreuen. Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal.Setzen Sie die Zellen in einem Mikroliter PBS pro 250 Tausend lebende Zellen aus und übertragen Sie sie in ein 1,5 Millimeter Mikrozentrifugenrohr. Halten Sie die resuspendierten Zellen im Dunkeln auf Eis. Vor dem Färben von Zellen und Injektionen, machen Agarose Platten für die Injektion durch Gießen 25 Millileiers von drei Prozent Agarose in 1X TBE in eine Petrischale und lassen Sie es zu erstarren.Bewahren Sie die Teller bei vier Grad Celsius bis zu zwei Wochen auf. Auch vor der Färbung von Zellen und Injektionen, entchlorieren Sie zwei Tage nach der Befruchtung Zebrafische mit Zangen unter einem Sezieren Mikroskop. Ziehen Sie von den gegenüberliegenden Enden der schützenden Chorion des Zebrafisches mit Zange, bis der Chorion reißt und der Zebrafisch uneingehüllt wird.Um das Verklumpen von Zellen während der Mikroinjektion zu verhindern, können Sie nicht fadenförmige Borosilikat-Glasnadeln bei vier Grad Celsius oder auf Eis vorkühlen. Unmittelbar nach der Färbung von Zellen, verwenden Sie eine Mikrolader Pipettenspitze, um fünf Mikroliter von gefärbten Zellen in die gekühlte Nadel zu laden. Laden Sie die Nadel in den Mikroinjektorarm.Nivellieren Sie die Nadelspitze mit einer sterilen Rasierklinge. Messen Sie mit einem Bühnenmikrometer die Tröpfchengröße in Mineralöl. Halten Sie das Tröpfchenvolumen konstant bei zwei Nanolitern, was einem Durchmesser von etwa 1,5 Millimetern entspricht.Eine Minute nach der Anästhesie die anästhesierten Larven auf eine vorbereitete flache Injektionsplatte mit drei Prozent Agarose übertragen und die Larven mit einer Pumpe von gebeizten Zellen an der gewünschten Injektionsstelle injizieren. Alle Injektionen sollten innerhalb von ein bis drei Stunden nach der Färbung der Zellen abgeschlossen werden, um klumpende Der Nadel zu verhindern. Waschen Sie die Larven von der Injektionsplatte in eine 10 Zentimeter lange Petrischale mit E3-Medien ohne Methylenblau und brüten Sie bei 28 Grad Celsius für eine Stunde Erholungszeit.Bewegen Sie die Schale der injizierten Larven in einen 34 Grad Celsius Inkubator. Mit einer leeren Petrischale zwischen dem Regal und der Petrischale von Larven als Puffer zu handeln. Bei 48 Stunden nach der Injektion, Sieb Zebra Fisch Larven für fluoreszierende Tumorzellentransplantation und Gesundheit.Entfernen Sie tote oder missgebildete Zebrafische und wählen Sie Zebrafische mit ähnlicher Verzierung aus. Entfernen Sie nicht transplantierte Zebrafische. Entfernen Sie bei injizierten Fischen Dotterfische, bei denen die Grenzen des Jochs nicht um die transplantierte Zellmasse herum zu sehen sind.Für perikardinjizierte Fische, entfernen Sie Fische, wo injizierte Zellmasse in den Eigelbsack eindringt. Um den ausgewählten Fisch auf eine 96-Well-Platte zu übertragen, schneiden Sie zunächst die Spitze von einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ab, gerade groß genug für einen viertägigen Zebrafisch nach der Düngung. 150 Mikroliter E3-Medien mit einem Zebrafisch von der Platte mit der P200 Pipette aspirieren und in einen leeren Brunnen einer flachen 96-Well-Platte geben.Fügen Sie 150 Mikroliter 2X verdünnte Arzneimittellösung zu jedem Brunnen enthaltenden Zebrafischlarven hinzu, um ein Endvolumen von 300 Mikrolitern mit 1X Medikamentenlösung pro Brunnen zu erreichen. Inkubieren Sie die Platte bei 34 Grad Celsius. Überprüfen Sie täglich nach toten Zebrafischen.Nach zwei Tagen, wenn gewünscht, aktualisieren Sie das Medikament, indem Sie 200 Mikroliter Flüssigkeit aus jedem Brunnen durch 1X Arzneimittellösung oder DMSO in E3-Medien ersetzen. Entfernen Sie in der Zen-Blau-Software alle unerwünschten Fluoreszenzkanäle in der Bildverarbeitungssoftware und fügen Sie den Dii-Kanal hinzu. Überprüfen Sie den gewünschten Fluoreszenzkanal.Wählen Sie im selben Fenster aus, wie die Bilder aufgenommen werden sollen, Z-Stacks, Automatisierung, Loops und Serien usw. Stellen Sie sich die DMSO Kontrollfische vor dem medikamentösen behandelten Fisch vor. Und stellen Sie die entsprechende Belichtungszeit in der Bildverarbeitungssoftware ein.Um die Fluoreszenz zu quantifizieren, öffnen Sie imagej-Software. Wechseln Sie zur Datei, öffnen Sie die gewünschte CZI-Datei, und wählen Sie sie aus. Die Software öffnet ein Importoptionen-Fenster.Wählen Sie für die Stapelanzeige Hyperstacks aus, überprüfen Sie die öffnenden Dateien einzeln, überprüfen Sie die automatische Skalierung und überprüfen Sie geteilte Kanäle. Wählen Sie für die Farboption colorized aus. Dann klicken Sie auf Plugins, Makros, aufzeichnen.Klicken Sie auf Bild, anpassen, Schwellenwert. Wählen Sie den Bildtyp rot im Dropdown-Menü auf der rechten Seite des Schwellenfensters aus. Passen Sie den Mindestschwellenwert an, bis die Software nur Bereiche mit Fluoreszenz hervorhebt, und klicken Sie dann auf Anwenden.Die Software konvertiert das Foto in Schwarzweiß mit dem ausgewählten Bereich in schwarz. Klicken Sie auf Analysieren und Messen. Die Software zieht ein Ergebnisfenster hoch, das den fluoreszierenden Bereich für dieses Bild enthält.Klicken Sie im Makrorecorder-Fenster auf Erstellen. Dadurch wird ein neues Fenster mit dem Code für das Makro geöffnet. Markieren Sie alle gewünschten Bilder für die Analyse und öffnen Sie sie entsprechend der Stapelanzeige oder Der Farboption.Wählen Sie Ausführen im Fenster mit dem Makro aus. Das Ergebnisfenster enthält nun den Bereich für jedes Bild. In diesem Protokoll wurden nach 48 Stunden nach der Injektion xenografierte Fische auf fluoreszierend markierte Tumorzellen untersucht und mit Chemotherapie oder DMSO behandelt.Insgesamt zeigten xenografierte Fische, die mit Vincristin behandelt wurden, die größte und beständigste Abnahme der xenografierten Zellmasse im Vergleich zu DMSO-behandelten Fischen. Dexamethason behandelte Fische zeigten etwa die Hälfte der Reduktion der Tumorfläche im Vergleich zu Vincristin. Aber zeigte immer noch eine Verringerung der Tumorfläche im Vergleich zu DMSO.Dieses Verfahren kann verwendet werden, um jede Krebszelllinie oder Patientenprobe auf Reaktion auf verschiedene Medikamente oder spezifische gezielte Therapien zu untersuchen, die Einblick in den Tumor jedes Patienten geben.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Forschung

Krebsforschung

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Einrichtung einer primären Kultur des Patienten abgeleitet Weichteilsarkomen

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolierung und Charakterisierung tumorinitiierender Zellen aus Sarkom-Patienten-abgeleiteten Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patientenabgeleitetes heterogenes Xenograft-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs mit Zebrafischlarven als Wirte für vergleichende Arzneimittelbewertung

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

In Vivo Bildgebung und Quantifizierung der Angiogenreaktion des Wirts bei Zebrafischtumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testen von gezielten Krebstherapien mit struktureller DNA-Alterationsanalyse und patientenabgeleiteten Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Verbesserte Lebensfähigkeit für Ex vivo 3D Hydrogelkulturen von patientenabgeleiteten Xenografts in einer perfused Microfluidic Platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...