Name: drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish
Uploaded: 2020-04-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish at JoVE.com

מחקר זה היה נתמך על ידי פרס V המלומד הקרן v ו NIH מענקים DP2CA228043, R01CA227656 (ל ס בלקברן) ו NIH הדרכה מענק T32CA165990 (כדי מ Haney).

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על-ידי הוועדה המוסדית של אוניברסיטת קנטקי והשימוש בבעלי חיים (פרוטוקול 2015-2225). דגימות המטופל נאספו תחת הלוח המוסדי של אוניברסיטת קנטקי (פרוטוקול 44672). כל ניסויי החיות שבוצעו בעקבות פרוטוקול זה חייבים להיות מאושרים על ידי הוועדה המוסדית של המשתמש לטיפ?...

<ol>
	<li>Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+human+malignant+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+embryos:+assessment+of+migration+and+cell+division+in+the+absence+of+tumor+formation.">The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).</li><li>Topczewska, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+tumorigenic+pathways+converge+via+Nodal+signaling:+role+in+melanoma+aggressiveness.">Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness.</a> Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).</li><li>Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukaemia+xenotransplantation+in+zebrafish--chemotherapy+response+assay+in+vivo.">Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo.</a> British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).</li><li>Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=15+years+of+zebrafish+chemical+screening.">15 years of zebrafish chemical screening.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).</li><li>Ghotra, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole+animal+bio-imaging+assay+for+human+cancer+dissemination.">Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination.</a> PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., W&#228;hlby, C., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).</li><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+automating+the+imaging+of+zebrafish+larvae.">Tools for automating the imaging of zebrafish larvae.</a> Methods. 96, 118-126 (2016).</li><li>Henn, K., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dechorionation+as+a+tool+to+improve+the+fish+embryo+toxicity+test+(FET)+with+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio).</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &amp; Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Embryo+Xenograft+and+Metastasis+Assay.">Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay.</a> Bio-Protocol. 8 (18), (2018).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Cold Spring Harbor Laboratory Press. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+medium+(for+zebrafish+embryos).">E3 medium (for zebrafish embryos).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).</li><li>Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Xenograft+Platform:+Evolution+of+a+Novel+Cancer+Model+and+Preclinical+Screening+Tool.">The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li><li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Engrafted+Human+Cancer+and+Therapy+Responses+in+Immunodeficient+Zebrafish.">Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish.</a> Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li></ol>

במחקר זה, הדגמנו שיטה סטנדרטית להחדרה והזרקה של תאי לוקמיה של המטופל העיקרי לתוך דג דג זברה כמודל מבע. כמו כן הקמנו פרוטוקול עבור הקרנת התרופה בתפוקה גבוהה של דגי מכסימום באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית מאובזר יחידת הדמיה ויחידת דוגם אוטומטי. בעבר, שתלי xenografts עם קווי התאים האנושיים, וכימות...

Xenografting שתלה של סרטן החולה הראשי או סרטן האדם קווי תאים לתוך אורגניזמים מודל היא טכניקה נפוצה בשימוש כדי ללמוד התקדמות הגידול והתנהגות vivo, התגובה הגידול לטיפול בסמים, ואינטראקציה תא סרטן עם מיקרוסביבה, בין היתר. באופן מסורתי, תאים מושתלים בתוך עכברים שנפגעו ממערכת החיסון, וזה נשאר התקן בשדה. עם זאת, מערכת זו מודל יש מגבלות מספר, כגון עלות גבוהה, נמוך לשכפל מספרים, קשיים באופן מדויק העומס הגידול בvivo, ואת הזמן המורחב שלוקח גידולים כדי לעבור בדיקות וסמים כדי להסתיים. בשנים האחרונות, דג זברה התפתחה כמו מודל חלופי מבע, עם הראשון שדווחו ב 2005, עם חלבון פלורסנט ירוק (gfp)-התווית מלנומה האדם קו תאים מושתלים1לתוך blastula-שלבהעוברים 1,2. לאחרונה, 2 יום לאחר הפריה (dpf) דג זברה הזחלים שימשו כנמענים מבע כדי לאפשר שליטה של מיקום אנטומיים של הזרקה ולשימוש ברזולוציה גבוהה vivo הדמיה של אינטראקציה הגידול עם מיקרוסביבה המקיפה3,4.
Zebrafish מציעים יתרונות רבים כמודל השתל מבע ראשית, ניתן לאכסן דגי מבוגרים ולגדל במהירות בכמויות גדולות בעלות נמוכה יחסית. יכול לייצר מאות. דגי זחל בשבוע בשל גודלם הקטן, ניתן לתחזק את הזחל הזה ב-96-לוחיות הרישוי לצורך הקרנת תרופות בתפוקה גבוהה. הזחלים לא צריך להיות מוזן במהלך ניסוי טיפוסי מבע, כמו שק החלמון שלהם מספק את החומרים המזינים לקיים אותם בשבוע הראשון שלהם של החיים. יתר על כן, דג זברה אין מערכת חיסונית תפקודית לחלוטין עד 7 dpf, כלומר הם לא דורשים הקרנה או מדכאים חיסוני משטרי לפני הזרקת מבע. בסופו של דבר, קווי דג זברה ברורים לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות גידול מיקרואקולוגיה.
אולי היישום המבטיח ביותר של דג זברה כמו מודל מבע היא היכולת לבצע הקרנת סמים בתפוקה גבוהה על דגימות סרטן האדם באופן שאינו אפשרי באמצעות כל אורגניזם מודל אחר. הזחלים סופגים סמים מהמים דרך העור, ומשפרים את קלות מינהל התרופות5. מכיוון שבעלי חיים נשמרים ב-96-צלחות, בדרך כלל ב-100-300 μL של מים, המסכים דורשים כמויות קטנות יותר של סמים בהשוואה לעכברים. כיום, ישנן מספר שיטות שונות לסטנדרטיזציה וכימות ההשפעה של תרופות על נטל הגידול האנושי של דג zebrafish, כמה מהם הם מעשיים יותר מאשר אחרים עבור שדרוג בדיקות סמים יחיד להקרנה בתפוקה גבוהה. לדוגמה, קבוצות מסוימות מנתק דגים לתוך השעיה תא בודד, ו לכמת בצורה פלואורוסקופים או תאים סרטניים מוכתם על ידי הדמיה של טיפות בודדות של ההשעיה וכימות זריחה באמצעות ImageJ חצי אוטומטי מאקרו4. חצי אוטומטי למחצה הזחלים שיטת הדמיה פותחה בו דגי זחל תוקנו ב 96-היטב צלחות והדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה לפני היישור של תמונות מרוכבים וכימות של הגידול בתוך התאים6. שני הצדדים האלה הם למעשה שיטות תובעניות לעבודה עבור כימות, אשר עשה באמת התפוקה בקצב גבוהה הקרנת סמים ב-דג זברה מודלים מבע מעשי.
בעיה זו טופלה על ידי התפתחות של בעלי חוליות הקרנה אוטומטית טכנולוגיה (המכריע) bioimager ו חלקיקים גדולים (LP) דוגם, מיקרוסקופ פלואורסצנטית מצויד יחידת הדמיה ויחידת דוגם אוטומטי (איור 1 וטבלה של חומרים), שהיא שיטה אוטומטית באמת עבור תפוקה גבוהה הדמיה של הזחלים דג זברה7,8,9. עם יחידה זו, הדגים מורדם, שנדגמו באופן אוטומטי מצלחת 96-באר, ממוקם בקפילר ומסובבת לכיוון הגדרת מבוסס על העדפה משתמש מוגדרת מראש, התמונה, ולאחר מכן ממוקם בחזרה לתוך אותו טוב של הצלחת 96-באר חדש למחקרים נוספים או מושלך. שילוב זה טכנולוגיה הדמיה עם דג זברה xשתלי עשוי לאפשר את האפשרות של רפואה אישית המשתמשת הקרנת סמים בתפוקה גבוהה של ספריות מתחם גדול סמים נגד גידולים החולה הפרט. זייברפיש xenografts גם להציע שיטה בקנה מידה גדול ובעלות נמוכה לבדיקת הן רעילות ויעילות של תרכובות הרומן ב vivo. Zebrafish יכול לשמש צעד הקרנה ראשונית לפני שתמשיך מודלים מבע העכבר.
פיתחנו זרימת עבודה יעילה עבור תאים מטופלים לוקמיה של החולה שתלה וביצוע מסכי סמים בתפוקה גבוהה עם הדמיה וכימות אוטומטי, אשר ניתן להחיל על כל התאים הראשוניים של החולה הראשי או קו התא של סרטן. זרימת עבודה זו מנוצל מיקרוסקופ פלואורסצנטית מאובזר יחידת הדמיה יחידת דוגם אוטומטי כדי לשפר את התקינה הנוכחית שיטות כימות ומציעה חלופה אוטומטית הקודם, יותר העבודה אינטנסיבית שיטות של המסה הגידול לכמת ב vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10x TBE Liquid Concentrate</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:115px;">0658-5L</td>
			<td style="width:360px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">96-well plate, flat bottom</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229195</td>
			<td style="width:360px;">VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Agarose</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Borosilicate Glass Capillary without Filament</td>
			<td style="width:139px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:115px;">B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-EI126-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E3 media</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Femtotips Microloader Tips</td>
			<td style="width:139px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:115px;">930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td>FIJI</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Large Particle (LP) Sampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methotrexate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6770-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral Oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>PBL06-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stage Micrometer (400-Stage)</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>400-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:139px;">Pentair Aquatic</td>
			<td style="width:115px;">TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">VAST Bioimager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vincristine Sulfate</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T117-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vybrant DiI Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>V22885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish

החולה הנגזרים מודלים מבע הם קריטיים בהגדרת איך סרטן שונים להגיב לטיפול בסמים ב vivo system. מודלים של עכברים הם תקן בתחום, אבל דג זברה התפתחה כמודל אלטרנטיבי עם מספר יתרונות, כולל את היכולת של תפוקה גבוהה והקרנת סמים בעלות נמוכה. Zebrafish גם לאפשר בהקרנה vivo סמים עם מספרים שכפול גדול שהיו בעבר רק השגה עם מערכות חוץ גופית. היכולת לבצע במהירות מסכי סמים בקנה מידה גדול עשויים לפתוח את האפשרות לרפואה אישית עם תרגום מהיר של תוצאות חזרה למרפאה. Zebrafish מודלים מבע יכול לשמש גם מסך במהירות עבור מוטציות שימושי מבוסס על תגובת הגידול לטיפולים ייעודיים או כדי לזהות תרכובות אנטי סרטניים חדש מספריות גדולות. המגבלה העיקרית הנוכחית בתחום מהווה כמות ואוטומציה של התהליך כך שניתן יהיה לבצע מסכי סמים בקנה מידה גדול יותר ולהיות פחות בעלי עבודה. פיתחנו זרימת עבודה עבור דגימות המטופל הראשי xהשתלה לתוך הזחלים דג זברה וביצוע מסכי סמים בקנה מידה גדול באמצעות מיקרוסקופ מצויד במיקרוסקופ פלואורסצנטית יחידת הדמיה אוטומטית היחידה. שיטה זו מאפשרת סטנדרטיזציה וכימות של אזור גידול מנופה ותגובה לטיפול בסמים על פני מספר גדול של הזחלים דג זברה. בסך הכל, שיטה זו היא יתרון על ההקרנה המסורתית התרופה בתרבות התא כפי שהוא מאפשר צמיחה של תאים סרטניים בסביבה vivo במהלך טיפול בסמים, והוא מעשי יותר וחסכוני יותר עכברים בקנה מידה גדול במסכים vivo סמים.

בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, דג דג זברה היו מושתלים בחלמון ואת קרום הלב עם pbmcs החולה הראשי שהיו מבודדים במקור לוקמיה לימפובלסטית חריפה בתאי t (t-ALL) מטופל באבחון הפקדה כמדגם בר קיימא, קפוא. ב 48 hpi, דגים x, מושתלים הוקרן עבור פלואורוסקופים בעלי תווית תאים סרטניים (איור 2ג, ד</s...

Watch this Scientific Journal Video about Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish at JoVE.com

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Zebrafish מודלים מבע לאפשר סינון תפוקה גבוהה ההקרנה והדמיה פלורסנט של תאים סרטניים אנושיים ב vivo microenvironment. פיתחנו זרימת עבודה עבור קנה מידה גדול, הקרנת תרופות אוטומטיות על החולה הנגזרת דגימות לוקמיה ב דג זברה באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי מצויד במיקרוסקופ הדמיה יחידה.

הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

זרימת העבודה שלנו להקרנת תרופות קסנוגרפט מאפשרת הדמיה וכימות אוטומטיים של תאים סרטניים אנושיים ותגובתם לטיפול תרופתי. זה יכול לשמש כדי לבדוק במהירות את התגובה של תאים סרטניים של סבלנות לתרופות ידועות או לזהות תרכובות נגד סרטן חדש. שימוש במודלים קסנוגרף zebrafish הקרנת סמים מאפשר מספרים משוכפלים Inviva שהיו בעבר רק להשגה עם מערכות במבחנה.זה גם הרבה יותר חסכוני מאשר מודלים העכבר בהקרנה באמצעות ספריות גדולות של תרכובות. זרימת עבודה זו יש כמה צעדים מן interjection של תאים סרטניים זברה כדי הדמיה של תגובה תרופתית כי הם למדו הטוב ביותר על ידי הדגמה חזותית. כדי להתחיל, צנטריפוגה מינימום של פעמיים 10 לתאים השישי בחמישה מילימטרים של PBS ב 200 פעמים g במשך חמש דקות, ושואפים את העל טבעי.תן שימוש חוזר בלוח התאים בחמישה מילימטרים של תותכת dii. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור במשך 20 דקות. ואז מערבולת בעדינות להידגר את התאים על הקרח במשך 15 דקות מוגן מפני אור.ואז צנטריפוגה התאים ב 200 פעמים g במשך חמש דקות ושואפים את supernatant. לשטוף את התאים על ידי הוספת חמישה מיליליטר של PBS, צנטריפוגה ב 200 פעמים גרם במשך חמש דקות, ושאיפת העל טבעי. חזור על לשטוף פעם נוספת.תן שימוש חוזר בתאים במיקרוליטר אחד של PBS לכל 250 אלף תאים חיים והעבר אותם לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מילימטר. שמור את התאים המתווסכים על קרח בחושך. לפני הכתמת תאים והזרקה, להכין צלחות אגרוז להזרקה על ידי שפיכת 25 מיליליטר של שלושה אחוזים agarose ב 1X TBE לתוך צלחת פטרי ולאפשר לו להתגבש.לאחסן את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס עד שבועיים. כמו כן, לפני הכתמת תאים והזרקה, dechlorinate יומיים לאחר הפריה דג זברה באמצעות מדפים תחת מיקרוסקופ ניתוח. משוך מהקצוות הנגדיים של chorion מגן של דג הזברה עם מטלפים עד דמעות chorion ואת דג הזברה הופך מפותח.כדי למנוע גושים של תאים במהלך microinjection, מראש צמרמורת לא filamentous מחטי זכוכית borosilicate בארבע מעלות צלזיוס או על קרח. מיד לאחר הכתמת תאים, השתמש בקצה פיפס מיקרו-עומס כדי לטעון חמישה מיקרוליטרים של תאים מוכתמים לתוך המחט המצונן. טען את המחט לזרוע המיקרו-מזרק.מיישרים את קצה המחט בעזרת סכין גילוח סטרילי. באמצעות מיקרומטר שלב, למדוד את גודל טיפה בשמן מינרלי. שמור על נפח טיפה באופן עקבי על שני nanoliters, אשר סביב 1.5 מילימטרים קוטר.דקה לאחר ההרדמה, מעבירים את הזחלים ההרדמה לצלחת הזרקת משטח שטוחה מוכנה עם שלושה אחוזים אגרוז, ומזריקים לזחלים משאבה אחת של תאים מוכתמים באתר ההזרקה הרצוי. כל הזריקות צריך להסתיים בתוך 1 עד 3 שעות לאחר הכתמת התאים כדי למנוע גושים של המחט. לשטוף את הזחלים את צלחת ההזרקה לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ המכילה E3 מדיה ללא כחול מתילן דגירה ב 28 מעלות צלזיוס לתקופת החלמה של שעה אחת.מעבירים את המנה של הזחלים המוזרקים לתוך חממה של 34 מעלות צלזיוס. עם צלחת פטרי ריקה המונחת בין המדף לבין צלחת פטרי של זחלים לפעול כחוצץ. בהזרקה לאחר 48 שעות, זחלי דג זברה מסך עבור חריטה תא גידול פלואורסצנטי ובריאות.הסר כל דג זברה מת או פגום, ובחר דג זברה עם חריטה דומה. הסר דגי זברה לא משופים. עבור דגים מוזרקים חלמון, להסיר דגים שבו גבולות של עול לא ניתן לראות סביב מסת התא חריט.עבור דג מוזרק קרום הלב, להסיר דגים שבו המסה התא מוזרק פולש לתוך שק החלמון. כדי להעביר את הדג הנבחר לצלחת 96 באר, ראשית לחתוך את הקצה את קצה פיפטה 200 microliter, רק גדול מספיק עבור ארבעה ימים לאחר הפריה דג זברה כדי להתאים דרך. שאפו 150 מיקרוליטרים של מדיה E3 עם דג זברה אחד מהצלחת באמצעות פיפטה P200 ומוסיפים אותו ל באר ריקה של צלחת שטוחה 96 בארות.הוסף 150 microliters של פתרון תרופה מדולל 2X לכל זחלי דג זברה המכילים כדי להגיע לנפח סופי של 300 microliters עם פתרון תרופה 1X לבא. דגירה הצלחת ב 34 מעלות צלזיוס. תבדקו אם יש דגי זברה מתים מדי יום.לאחר יומיים, אם תרצה, לרענן את התרופה על ידי החלפת 200 microliters של נוזל מכל באר עם פתרון תרופה 1X או DMSO במדיה E3. בתוכנת זן כחול, להסיר את כל ערוצי פלואורסצנטי לא רצויים בתוכנת ההדמיה ולהוסיף את ערוץ Dii. בדוק את הערוץ הפלואורסצנטי הרצוי.באותו חלון, בחר כיצד התמונות יצולמו, ערימות Z, אוטומציה, לולאות וסדרות וכו '. תמונה DMSO לשלוט דגים לפני הדגים שטופלו התרופה. ולהגדיר את זמן החשיפה המתאים בתוכנת ההדמיה.כדי לכמת את הפלואורסצנטיות, פתח את תוכנת imagej. עבור אל הקובץ, פתח ובחר את קובץ CZI הרצוי. התוכנה מעלה חלון אפשרויות ייבוא.להצגת מחסנית, בחרו היפרסטאקים, בדקו קבצים פתוחים בנפרד, בדקו את קנה המידה האוטומטי ובדקו ערוצים מפוצלים. עבור אפשרות הצבע, בחר בצבע. לאחר מכן לחץ על תוספים, פקודות מאקרו, הקלט.לחץ על תמונה, התאם, סף. בחרו 'כתב תמונה' כאדום בתפריט הנפתח בצד ימין של חלון הסף. התאם את הסף המינימלי עד שהתוכנה רק תדגיש אזורים עם פלואורסצנטיות ולאחר מכן לחץ על החל.התוכנה ממירה את התמונה לשחור ולבן עם האזור שנבחר בשחור. לחץ על נתח ולמדוד. התוכנה מושכת את חלון תוצאות המכיל את אזור הפלואורסצנטי עבור תמונה זו.לחץ על צור בחלון מקליט המאקרו. פעולה זו פותחת חלון חדש עם הקוד עבור המאקרו. סמן את כל התמונות הרצויות לניתוח ופתיחה בהתאם לאפשרות תצוגה או צבע בערימה.בחר הפעל בחלון באמצעות המאקרו. חלון התוצאות מכיל כעת את האזור עבור כל תמונה. בפרוטוקול זה, בהזרקה של 48 שעות לאחר הזרקת קסנוגרפט, דגי קסנוגרפט הוקרן עבור תאים סרטניים בעלי תווית פלואורסצנטית וטופלו בכימותרפיה או ב- DMSO.בסך הכל, דגים שנאת זרים שטופלו ב-Vincristine הראו את הירידה הגדולה והעקבית ביותר במסת תאים שנאת זרים בהשוואה לדגים שטופלו ב- DMSO. דגי דקסמתזון שטופלו הראו כמחצית מהירידה באזור הגידול בהשוואה לווינכריסטין. אבל עדיין הראה ירידה באזור הגידול בהשוואה ל- DMSO.הליך זה יכול לשמש כדי לסנן כל קו תאים סרטניים או מדגם המטופל לתגובה לתרופות שונות או טיפולים ממוקדים ספציפיים נותן תובנה הגידול של כל חולה.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

תיוג של xenografts הנגזר חולה סרטן השד עם כתבים לעקיבים עבור צמיחת גידולים וגרורים מחקרים

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

הקמתה של תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry להעריך לוקמיה תאי גזע ראשי לוקמיה מיאלואידית חריפה, החולה-נגזר-xenografts, אבחון, מעקב.

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

בידוד ואפיון של הגידול-ליזום תאים מחולה סרקומה-Xenografts נגזרים

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

מטופל-נגזר הטרוגנית מודל Xenograft של סרטן הלבלב באמצעות הזחלים Zebrafish כפונדקאים עבור הערכת סמים השוואתי

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

החולה הפיזיולוגי הנגזרות 3D Spheroids עבור הקרנת תרופות אנטי-נאופלסטית כדי למקד את תאי גזע הסרטן

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

בVivo הדמיה וככמת של התגובה המארחת אנגיוגנטית ב-Zebrafish גידול Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

בדיקת טיפולים ייעודיים בסרטן באמצעות ניתוח שינוי DNA מבנית והמטופל נגזר Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

קיימות משופרת עבור תרבויות הידרוג'ל 3D Ex vivo של Xenografts נגזר המטופל בפלטפורמה מיקרופלויד perfused

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...