Name: drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish
Uploaded: 2020-04-10T14:00:00
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이 연구는 V 재단 V 학자 상과 NIH 교부금 DP2CA228043, R01CA227656 (J.S. 블랙번) 및 NIH 교육 보조금 T32CA165990 (M.G. Haney에)에 의해 지원되었다.

이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 켄터키 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 2015-2225)에 의해 승인되었습니다. 환자 샘플은 켄터키 대학의 기관 검토 위원회 (프로토콜 44672)에서 수집되었습니다. 이 프로토콜에 따라 수행된 모든 동물 실험은 사용자의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아야 합니다.
1. 해동 1 차 환자 급성 림프 구성 백혈병 세포
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	<li>Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+human+malignant+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+embryos:+assessment+of+migration+and+cell+division+in+the+absence+of+tumor+formation.">The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).</li><li>Topczewska, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+tumorigenic+pathways+converge+via+Nodal+signaling:+role+in+melanoma+aggressiveness.">Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness.</a> Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).</li><li>Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukaemia+xenotransplantation+in+zebrafish--chemotherapy+response+assay+in+vivo.">Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo.</a> British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).</li><li>Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=15+years+of+zebrafish+chemical+screening.">15 years of zebrafish chemical screening.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).</li><li>Ghotra, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole+animal+bio-imaging+assay+for+human+cancer+dissemination.">Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination.</a> PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., W&#228;hlby, C., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).</li><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+automating+the+imaging+of+zebrafish+larvae.">Tools for automating the imaging of zebrafish larvae.</a> Methods. 96, 118-126 (2016).</li><li>Henn, K., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dechorionation+as+a+tool+to+improve+the+fish+embryo+toxicity+test+(FET)+with+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio).</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &amp; Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Embryo+Xenograft+and+Metastasis+Assay.">Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay.</a> Bio-Protocol. 8 (18), (2018).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Cold Spring Harbor Laboratory Press. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+medium+(for+zebrafish+embryos).">E3 medium (for zebrafish embryos).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).</li><li>Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Xenograft+Platform:+Evolution+of+a+Novel+Cancer+Model+and+Preclinical+Screening+Tool.">The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li><li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Engrafted+Human+Cancer+and+Therapy+Responses+in+Immunodeficient+Zebrafish.">Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish.</a> Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li></ol>

본 연구에서, 우리는 이종이식 모델로서 제브라피시로 1차 환자 백혈병 세포를 해동하고 주입하는 표준화된 방법을 입증하였다. 또한 형광 현미경 장착 영상 장치 및 자동 샘플러 유닛을 사용하여 이종이식 제브라피시의 고처리량 약물 스크리닝 프로토콜을 수립했습니다. 이전에는 이종이식은 인간 세포주로 보고되었으며, 이종이식 종양을 높은 처리량 방식으로 정량화하는 것은 현장에서 어려?...

1차 환자 암 또는 인간 암 세포주를 모델 유기체로 Xenografting하는 것은 생체 내에서 종양 진행 및 행동, 약물 치료에 대한 종양 반응, 및 미세 환경과의 암 세포 상호 작용을 연구하는 데 널리 사용되는 기술이다. 전통적으로, 세포는 면역 손상된 마우스로 이종이 식이식되고, 이것은 필드에 있는 표준남아 있습니다. 그러나, 이 모델 시스템은 높은 비용, 낮은 복제 수, 생체 내 종양 부담을 정확하게 정량화하는 데 어려움, 종양이 생착 및 약물 검사를 완료하기까지 걸리는 연장 된 시간과 같은 몇 가지 제한사항이 있습니다. 최근에는 제브라피쉬가 대체 이종이식 모델로 등장하여 2005년에 최초로 보고되고 있으며, 녹색 형광 단백질(GFP)으로 표지된 인간 흑색종 세포주를 블라스쿨라단계배아로 이식하여 1,,2. 최근에는 2일 후 수정(dpf) 제브라피시 유충이 주사의 해부학적 위치를 조절할 수 있도록 이종이식 수용자로 사용되어 왔으며, 주변 미세환경과의 종양 상호작용의 생체내 영상에서 고해상도로 사용하기 위해3,,4.
제브라피쉬는 이종이식 모델로서 많은 이점을 제공합니다. 첫째, 성인용 제브라피쉬는 비교적 저렴한 비용으로 대량으로 사육하고 빠르게 사육할 수 있습니다. 성제 얼룩말의 각 짝짓기 쌍은 매주 애벌레 물고기의 수백을 생산할 수 있습니다. 그들의 작은 크기 때문에, 이 애벌레 얼룩말은 높은 처리량 약물 검열을 위한 96 웰 플레이트에서 유지될 수 있습니다. 유충은 노른자 주머니가 생후 첫 주 동안 영양분을 공급하기 때문에 전형적인 이종이식 실험 과정에서 먹이를 줄 필요가 없습니다. 더욱이, 제브라피쉬는 7 dpf까지 완전한 기능성 면역 계통을 갖지 않으며, 이는 이종이식 주사 전에 조사 또는 면역 억제 요법을 필요로 하지 않는다는 것을 의미합니다. 마지막으로, 광학적으로 명확한 얼룩말 물고기 라인은 종양 미세 환경 상호 작용의 고해상도 화상 진찰을 허용합니다.
아마도 이종이식 모델로 제브라피시의 가장 유망한 응용 프로그램은 다른 모델 유기체를 사용하여 불가능한 방식으로 인간 암 샘플에 대한 높은 처리량 약물 스크리닝을 수행하는 능력입니다. 애벌레는 피부를 통해 물에서 약물을 흡수, 약물 투여의 용이성을 향상5. 동물은 일반적으로 100-300 μL의 물에서 96 웰 플레이트에서 유지되기 때문에 스크린은 마우스에 비해 적은 약물 양을 필요로합니다. 현재, 제브라피시에 있는 인간 종양 부담에 대한 약물의 효력의 표준화 그리고 정량화를 위한 몇몇 다른 방법이 있습니다, 그 중 일부는 높은 처리량 검열에 단 하나 약 시험을 확장하기 위한 그외 보다는 더 실용적입니다. 예를 들어, 일부 그룹은 물고기를 단일 세포 현탁액으로 해리하고, 반자동 ImageJ 매크로4를사용하여 현탁액의 개별 방울을 이미징하고 형광을 정량화함으로써 형광 표지 또는 염색된 종양 세포를 정량화한다. 반자동 전신 애벌레 이미징 방법은 애벌레 물고기가 96 웰 플레이트에 고정되고 합성 이미지의 재정렬 및 종양 세포 초점6의 정량화 전에 반전형광 현미경을 사용하여 이미지화하는 방식으로개발되었습니다. 이 두 가지 검사는 정량화를 위한 상당히 노동 집약적인 방법이며, 이는 제브라피시 이종이식 모델에서 진정으로 높은 처리량의 약물 스크리닝을 비현실적으로 만들었습니다.
이 문제는 척추동물 자동 선별 기술(VAST) 생체 이미지 및 대입자(LP) 샘플러, 형광 현미경 장착 이미징 유닛 및 자동 샘플러유닛(그림 1 및 표 재료)의개발로 해결되었으며, 이는 제브라피시 유충7,,8,,9의고처리량 이미징을 위한 진정한 자동화 된 방법입니다. 이 장치를 사용하면 생선이 마취되고 96 웰 플레이트에서 자동으로 샘플링되고 모세관에 배치되고 미리 설정된 사용자 선호도에 따라 설정된 방향으로 회전된 다음 추가 연구를 위해 새로운 96웰 플레이트의 동일한 웰에 다시 배치하거나 폐기합니다. 이 화상 진찰 기술을 zebrafish 이종이식과 결합하면 개별 환자 종양에 대한 대형 약물 화합물 라이브러리의 고처리량 약물 스크리닝을 사용하는 개인화 된 의학의 가능성을 허용할 수 있습니다. Zebrafish 이종이식은 또한 생체 내에서 새로운 화합물의 독성과 효능을 모두 테스트하기 위한 대규모 저비용 방법을 제공합니다. 제브라피쉬는 마우스 이종이식 모델로 진행하기 전에 예비 스크리닝 단계로 사용할 수 있습니다.
당사는 1차 환자 백혈병 세포를 제브라피시로 이식하고 다른 1차 환자 종양 세포 또는 암 세포라인에 적용할 수 있는 자동 이미징 및 정량화를 통해 고처리량 약물 스크린을 수행하기 위한 간소화된 워크플로우를 개발했습니다. 이 워크플로우는 형광 현미경 장착 이미징 유닛과 자동 샘플러 유닛을 활용하여 현재 표준화 및 정량화 방법을 개선하고 생체 내에서 종양 질량을 정량화하는 이전의 보다 노동 집약적인 방법에 대한 자동화된 대안을 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10x TBE Liquid Concentrate</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:115px;">0658-5L</td>
			<td style="width:360px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">96-well plate, flat bottom</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229195</td>
			<td style="width:360px;">VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Agarose</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Borosilicate Glass Capillary without Filament</td>
			<td style="width:139px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:115px;">B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-EI126-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E3 media</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Femtotips Microloader Tips</td>
			<td style="width:139px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:115px;">930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td>FIJI</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Large Particle (LP) Sampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methotrexate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6770-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral Oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>PBL06-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stage Micrometer (400-Stage)</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>400-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:139px;">Pentair Aquatic</td>
			<td style="width:115px;">TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">VAST Bioimager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vincristine Sulfate</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T117-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vybrant DiI Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>V22885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish

환자 유래 이종이식 모델은 생체 내 시스템에서 다른 암이 약물 치료에 어떻게 반응하는지 정의하는 데 중요합니다. 마우스 모델은 현장에서 표준이지만, 제브라피쉬는 고처리량 및 저비용 약물 스크리닝 능력을 포함하여 여러 가지 장점을 가진 대체 모델로 부상했습니다. Zebrafish는 또한 이전에 는 시험관 내 시스템으로만 얻을 수 있던 큰 복제 숫자로 생체 내 약물 스크리닝을 허용합니다. 대규모 약물 스크린을 신속하게 수행 할 수있는 능력은 결과를 신속하게 클리닉으로 신속하게 번역하여 개인화 된 의학의 가능성을 열 수 있습니다. Zebrafish 이종이식 모델은 또한 표적 치료에 대한 종양 반응에 근거를 둔 실행 가능한 돌연변이를 신속하게 선별하거나 대형 라이브러리에서 새로운 항암 화합물을 식별하는 데 사용될 수 있습니다. 이 분야의 현재 주요 제한은 약물 스크린이 더 큰 규모로 수행되고 노동 집약적이지 않도록 프로세스를 정량화하고 자동화하고 있습니다. 우리는 제브라피쉬 유충으로 1 차 환자 샘플을 이종이 식이식하고 형광 현미경 장착 이미징 장치 및 자동화 된 샘플러 유닛을 사용하여 대규모 약물 스크린을 수행하기위한 워크플로우를 개발했습니다. 이 방법은 제브라피시 유충의 다수에 걸쳐 이식된 종양 영역및 약물 치료에 대한 반응을 표준화하고 정량화할 수 있게 한다. 전반적으로, 이 방법은 약물 치료 전반에 걸쳐 생체 내 환경에서 종양 세포의 성장을 허용하고, 생체 내 약물 스크린에서 대규모의 마우스보다 더 실용적이고 비용 효율적이기 때문에 전통적인 세포 배양 약물 스크리닝에 비해 유리하다.

전술한 프로토콜에 따라, 제브라피쉬는 원래 T 세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL) 환자로부터 분리된 1차 환자 PBMC를 사용하여 노른자와 심낭에서 이종이이식하고 생존 가능한 냉동 샘플로 뱅크하였다. 48 hpi에서, 이종이식된 물고기는 형광표지된 종양세포(도 2C,D)를위해 스크리너드하고 화학요법(덱사메타손 또는 빈크리스틴) 또는 DMSO로 처리하였다. 물고기는 7 dp...

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Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Zebrafish 이종이식 모델은 생체 내 미세 환경에서 인간 암 세포의 고처리량 약물 스크리닝 및 형광 이미징을 허용합니다. 당사는 자동 형광 현미경 장착 이미징 유닛을 사용하여 제브라피시의 환자 유래 백혈병 시료에 대한 대규모 자동 약물 스크리닝을 위한 워크플로우를 개발했습니다.

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Zebrafish xenograft 약물 스크리닝 워크플로우를 통해 인간 암세포의 자동 이미징 및 정량화 및 약물 치료에 대한 반응을 허용합니다. 그것은 빨리 알려진된 약에 인내의 암세포의 반응을 시험하거나 새로운 항암 성 화합물을 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다. Zebrafish xenograph 모델 및 약물 스크리닝을 사용하면 이전에는 체외 시스템에서만 얻을 수 있었던 Inviva 복제 번호를 사용할 수 있습니다.또한 큰 화합물 라이브러리를 통해 스크리닝할 때 마우스 모델보다 훨씬 더 비용 효율적입니다. 이 워크플로우는 제브라피시에 있는 암세포의 간섭에서 시각적 데모에 의해 가장 잘 배운 약 반응의 화상 진찰에 몇몇 단계가 있습니다. 시작하려면, 원심분리는 5분 동안 200배 g에서 PBS의 5밀리미터에서 6세포에 최소 2배 10을, 과부를 흡인한다.디이 염색 용액의 5 밀리미터에서 세포 팔레트를 다시 중단합니다. 20 분 동안 빛으로부터 보호 되는 섭씨 37도에서 세포를 배양. 그런 다음 부드럽게 소용돌이와 빛으로부터 보호 15 분 동안 얼음에 세포를 배양.그런 다음 세포를 5 분 동안 200 배 g로 원심 분리하고 수퍼나탄을 흡인시합니다. PBS의 5 밀리리터를 추가하고, 5분 동안 200배 g에서 원심분리하고, 상퍼를 흡입하여 세포를 세척합니다. 세탁을 한 번 더 반복합니다.250,000 개의 살아있는 세포 당 PBS의 1 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고 1.5 밀리미터 마이크로 원심 분리기 튜브로 전송합니다. 다시 매달린 세포를 어둠 속에서 얼음 위에 두십시오. 세포를 염색하고 주입하기 전에, 1X TBE에 3%의 아가로즈 25밀리레이를 부어 주입을 위한 아가로즈 플레이트를 만들어 페트리 접시에 넣고 고화시키도록 합니다.최대 2주 동안 접시를 섭씨 4도에 보관하십시오. 또한 세포를 염색하고 주입하기 전에 해부 현미경으로 집게를 사용하여 2 일 간의 후 수정 얼룩말 물고기를 탈염시합니다. 초리온이 눈물과 얼룩말 물고기가 봉투가 될 때까지 집게와 얼룩말 물고기의 보호 초리온의 반대쪽 끝에서 당겨.미세 주입 중 세포의 응집을 방지하기 위해, 전 냉각 비 필라멘트 borosilicate 유리 바늘은 섭씨 4도 또는 얼음에. 세포를 염색한 직후 마이크로로더 파이펫 팁을 사용하여 염색된 셀의 5마이크로리터를 차가운 바늘에 적재합니다. 바늘을 마이크로인젝터 암에 넣습니다.멸균 면도날을 사용하여 바늘 끝을 평평하게 합니다. 단계 마이크로미터를 사용하여 미네랄 오일의 액적 크기를 측정합니다. 두 나노 리터에서 지속적으로 물방울 볼륨을 유지, 이는 직경 약 1.5 밀리미터입니다.마취 후 1 분, 마취 유충을 3 % 아가로즈로 준비 된 평평한 표면 사출 판으로 옮기고 원하는 주사 부위에 스테인드 셀 1 펌프로 애벌레를 주입하십시오. 모든 주사는 바늘의 응집을 방지하기 위해 세포를 염색 한 후 1 ~ 3 시간 이내에 완료해야합니다. 사출 판에서 유충을 메틸렌 블루 없이 E3 미디어를 함유한 10센티미터 페트리 접시에 넣고 1시간 동안 섭씨 28도에서 배양합니다.주입된 애벌레의 접시를 섭씨 34도 인큐베이터로 옮킨다. 선반과 애벌레의 페트리 접시 사이에 빈 페트리 접시를 놓아 버퍼 역할을합니다. 48 시간 후 주입에서, 형광 종양 세포 이식 및 건강을 위한 얼룩말 물고기 애벌레를 스크린합니다.죽은 또는 기형 얼룩말 물고기를 제거하고 유사한 이식 얼룩말 물고기를 선택합니다. 이식되지 않은 얼룩말 물고기를 제거합니다. 노른자를 주입 한 물고기의 경우, 요크의 테두리가 이식 된 세포 질량 주위에 볼 수없는 물고기를 제거하십시오.심낭 주입 된 물고기의 경우, 노른자 자루에 세포 질량을 주입 물고기를 제거합니다. 선택한 생선을 96웰 플레이트로 옮기려면 먼저 팁을 200 마이크로리터 파이펫 팁에서 잘라서 4일 동안 수정된 얼룩말 물고기가 들어갈 수 있을 만큼 충분히 커집니다. P200 파이펫을 사용하여 접시에서 얼룩말 물고기 1개를 가진 E3 미디어의 150 마이크로리터를 흡인하고 평평한 바닥 96웰 플레이트의 빈 우물에 추가합니다.얼룩말 물고기 애벌레를 함유한 각 웰에 2X 희석 약물 용액 150마이크로리터를 추가하여 1X 약물 용액을 가진 300 마이크로리터의 최종 부피에 도달하십시오. 섭씨 34도에서 접시를 배양합니다. 매일 죽은 얼룩말 물고기를 확인하십시오.2 일 후, 원하는 경우, E3 미디어에서 1X 약물 용액 또는 DMSO로 각 우물에서 200 마이크로 리터를 교체하여 약물을 새로 고칩니다. Zen blue 소프트웨어에서 이미징 소프트웨어의 원치 않는 모든 형광 채널을 제거하고 Dii 채널을 추가합니다. 원하는 형광 채널을 확인합니다.같은 창에서 이미지를 촬영하는 방법, Z 스택, 자동화, 루프 및 시리즈, 등 세테라를 선택합니다. 약물 처리 물고기 전에 DMSO 제어 물고기를 이미지. 그리고 이미징 소프트웨어에서 적절한 노출 시간을 설정합니다.형광을 정량화하려면 이미지를 엽니다. 원하는 CZI 파일을 파일로 이동하여 열고 선택합니다. 이 소프트웨어는 가져오기 옵션 창을 제공합니다.스택 보기를 위해 하이퍼스택을 선택하고, 열려 있는 파일을 개별적으로 확인하고, 자동 축척을 확인하고, 분할 채널을 확인합니다. 색상 옵션을 보려면 색으로 선택합니다. 그런 다음 플러그인, 매크로, 레코드를 클릭합니다.이미지를 클릭하고 조정하며 임계값을 설정합니다. 임계값 창의 오른쪽에 있는 드롭다운 메뉴에서 이미지 유형을 빨간색으로 선택합니다. 소프트웨어가 형광이 있는 영역만 강조 표시될 때까지 최소 임계값을 조정한 다음 적용을 클릭합니다.이 소프트웨어는 선택한 영역이 검은색으로 사진을 흑백으로 변환합니다. 분석 및 측정을 클릭합니다. 소프트웨어는 해당 이미지에 대한 형광 영역이 포함된 결과 창을 가져옵니다.매크로 레코더 창에서 만들기를 클릭합니다. 이렇게 하면 매크로에 대한 코드가 있는 새 창이 열립니다. 스태킹 보기 또는 색상 옵션에 따라 분석을 위해 원하는 이미지를 모두 강조 표시하고 엽니다.매크로가 있는 창에서 실행을 선택합니다. 이제 결과 창에 각 이미지에 대한 영역이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜에서, 48 시간 후 주입에서, xenografted 물고기는 형광표지 종양 세포를 위해 검열되고 화학요법 또는 DMSO로 취급되었습니다.전반적으로, Vincristine로 취급된 xenografted 물고기는 DMSO 처리된 물고기에 비해 xenografted 세포 질량에 있는 가장 크고 가장 일관된 감소를 보여주었습니다. 덱사메타손 처리된 물고기는 빈크리스틴에 비해 종양 부위의 약 절반 감소를 보였다. 그러나 여전히 DMSO에 비해 종양 부위의 감소를 보였다.이 절차는 각 환자의 종양에 대한 통찰력을 주는 다른 약 또는 특정 표적으로 한 치료에 대한 반응을 위해 어떤 암 세포 주 또는 환자 견본든지를 검열하기 위하여 이용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

종양의 성장과 전이 연구 추적 가능한 기자와 유방암 환자 유래의 이종 이식의 라벨링

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

연구

암 연구학

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

환자에서 파생 된 연 조직 육 종의 기본 문화 설립

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 발하는 세포의 격리 및 특성화

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

비교 약물 평가를 위한 호스트로 Zebrafish 애벌레를 사용하여 췌장암의 환자 유래 이종 이종이식 모형

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

제브라피시 종양 이종이식에서 숙주 혈관조형성 반응의 생체 내 이미징 및 정량화

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Perfused 마이크로 유체 플랫폼에서 환자 유래 제노이식의 Ex vivo 3D 하이드로겔 배양에 대한 향상된 생존력

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...