Name: drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish
Uploaded: 2020-04-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av en V Foundation V Scholar Award og NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (til J.S. Blackburn) og NIH Training Grant T32CA165990 (til M.G. Haney).

Alle prosedyrer beskrevet i denne protokollen er godkjent av University of Kentucky's Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll 2015-2225). Pasientprøver ble samlet inn under University of Kentucky's Institutional Review Board (protokoll 44672). Alle dyreforsøk som utføres etter denne protokollen, må godkjennes av brukerens institutional animal care and use committee.
1. Tining primær pasient akutt lymfoblastiske leukemi celler
<ol><li>Tin primær pasient perifere blod mono...

<ol>
	<li>Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+human+malignant+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+embryos:+assessment+of+migration+and+cell+division+in+the+absence+of+tumor+formation.">The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).</li><li>Topczewska, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+tumorigenic+pathways+converge+via+Nodal+signaling:+role+in+melanoma+aggressiveness.">Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness.</a> Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).</li><li>Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukaemia+xenotransplantation+in+zebrafish--chemotherapy+response+assay+in+vivo.">Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo.</a> British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).</li><li>Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=15+years+of+zebrafish+chemical+screening.">15 years of zebrafish chemical screening.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).</li><li>Ghotra, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole+animal+bio-imaging+assay+for+human+cancer+dissemination.">Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination.</a> PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., W&#228;hlby, C., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).</li><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+automating+the+imaging+of+zebrafish+larvae.">Tools for automating the imaging of zebrafish larvae.</a> Methods. 96, 118-126 (2016).</li><li>Henn, K., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dechorionation+as+a+tool+to+improve+the+fish+embryo+toxicity+test+(FET)+with+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio).</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &amp; Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Embryo+Xenograft+and+Metastasis+Assay.">Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay.</a> Bio-Protocol. 8 (18), (2018).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Cold Spring Harbor Laboratory Press. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+medium+(for+zebrafish+embryos).">E3 medium (for zebrafish embryos).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).</li><li>Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Xenograft+Platform:+Evolution+of+a+Novel+Cancer+Model+and+Preclinical+Screening+Tool.">The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li><li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Engrafted+Human+Cancer+and+Therapy+Responses+in+Immunodeficient+Zebrafish.">Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish.</a> Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li></ol>

I denne studien demonstrerte vi en standardisert metode for tining og injeksjon av primære pasientleukemiceller i sebrafisk som en xenograftmodell. Vi etablerte også en protokoll for høy gjennomstrømning serutt screening av xenografted sebrafisk ved hjelp av et fluorescensmikroskop utstyrt bildeenhet og automatisert sampler enhet. Tidligere har xenografts blitt rapportert med menneskelige cellelinjer, og kvantifisering av xenografted svulster på en høy gjennomstrømning måte har vært en utfordring i feltet. Denne...

Xenografting av primærpasientkreft eller menneskelige kreftcellelinjer i modellorganismer er en mye brukt teknikk for å studere tumorprogresjon og atferd in vivo, tumorrespons på narkotikabehandling og kreftcelleinteraksjon med mikromiljøet, blant andre. Tradisjonelt er celler xenografted til immunkompromitterte mus, og dette er fortsatt standarden i feltet. Dette modellsystemet har imidlertid flere begrensninger, for eksempel høye kostnader, lave replikeringstall, vanskeligheter med nøyaktig kvantifiserende tumorbyrde in vivo, og den utvidede tiden det tar for svulster å engraft og narkotikatesting som skal fullføres. I de senere årene har sebrafisk dukket opp som en alternativ xenograft modell, med den første som ble rapportert i 2005, med grønt fluorescerende protein (GFP)-merket humant melanom cellelinjer transplantert inn blastula-stadium embryoer1,2. Mer nylig, 2 dagers post-befruktning (dpf) sebrafisk larver har blitt brukt som xenograft mottakere for å tillate kontroll av anatomisk injeksjonssted og for bruk i høy oppløsning in vivo avbildning av tumorinteraksjon med det omkringliggende mikromiljøet3,4.
Zebrafish tilbyr mange fordeler som en xenograft modell. For det første kan voksen sebrafisk plasseres og raskt avlet i store mengder til en relativt lav pris. Hvert par voksne sebrafisk kan produsere hundrevis av larvefisk per uke. På grunn av sin lille størrelse kan disse larvesebrafiskenopprettholdes i 96-brønnplater for høy gjennomstrømning av narkotikascreening. Larver trenger ikke å bli matet i løpet av et typisk xenografteksperiment, da deres eggeplommesekk gir næringsstoffene for å opprettholde dem i sin første uke av livet. Videre har sebrafisk ikke et fullt funksjonelt immunsystem før 7 dpf, noe som betyr at de ikke krever bestråling eller immunsuppressive regimer før xenograft injeksjon. Til slutt, optisk klare sebrafisk linjer tillate høyoppløselig avbildning av tumor-mikromiljø interaksjoner.
Kanskje den mest lovende anvendelsen av sebrafisk som en xenograft modell er evnen til å utføre høy gjennomstrømning narkotika screening på menneskelige kreftprøver på en måte som ikke er mulig å bruke noen annen modell organisme. Larver absorberer stoffer fra vannet gjennom huden, og forbedrer brukervennligheten av legemiddeladministrasjon5. Fordi dyr vedlikeholdes i 96-brønnplater, vanligvis i 100-300 μL vann, krever skjermer mindre legemiddelmengder sammenlignet med mus. For tiden er det flere forskjellige metoder for standardisering og kvantifisering av effekten av legemidler på menneskelig tumorbyrde i sebrafisk, hvorav noen er mer praktiske enn andre for skalering av enkeltnarkotikatesting til høy gjennomstrømningsscreening. For eksempel, noen grupper dissosiere fisk i encellede suspensjoner, og kvantifisere fluorescerende merkede eller farget tumorceller ved å bilde individuelle dråper av suspensjon og kvantifisere fluorescens ved hjelp av en semi-automatisert ImageJ makro4. En halvautomatisert hellarver bildemetode ble utviklet der larvefisk ble festet i 96-brønnplater og avbildet ved hjelp av et omvendt fluorescerende mikroskop før omstilling av sammensatte bilder og kvantifisering av tumorcellefoci6. Begge disse påstandene er ganske arbeidsintensive metoder for kvantifisering, noe som har gjort virkelig høy gjennomstrømning narkotika screening i sebrafisk xenograft modeller upraktisk.
Dette problemet har blitt løst av utviklingen av Vertebrate Automated Screening Technology (VAST) Bioimager og Large Particle (LP) Sampler, et fluorescensmikroskop utstyrt bildeenhet og automatisert sampler enhet (Figur 1 og Table of Materials), som er en virkelig automatisert metode for høy gjennomstrømning bildebehandling av sebrafisk larver7,,8,9. Med denne enheten blir fisk bedøvet, samplet automatisk fra en 96-brønnplate, plassert i en kapillær og rotert inn i den innstilte retningen basert på en forhåndsinnstilt brukerpreferanse, avbildet, og deretter enten plassert tilbake i samme brønn av en ny 96-brønnplate for videre studier eller kassert. Kombinere denne bildeteknologi med sebrafisk xenografts kan tillate muligheten for personlig medisin som bruker høy gjennomstrømning narkotika screening av store stoffet sammensatte biblioteker mot individuelle pasientsvulster. Sebrafisk xenografts tilbyr også en storskala og rimelig metode for testing av både toksisitet og effekt av nye forbindelser in vivo. Sebrafisk kan brukes som et foreløpig screeningtrinn før du går videre til mus xenograft modeller.
Vi har utviklet en strømlinjeformet arbeidsflyt for xenografting primære pasient leukemi celler i sebrafisk og utføre høy gjennomstrømning narkotika skjermer med automatisert bildebehandling og kvantifisering, som kan brukes på andre primære pasient tumorceller eller kreft celle linje. Denne arbeidsflyten benyttet en fluorescensmikroskop utstyrt bildeenhet og automatisert samplerenhet for å forbedre på gjeldende standardiserings- og kvantifiseringsmetoder og tilbyr et automatisert alternativ til tidligere, mer arbeidsintensive metoder for kvantifiserende tumormasse in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10x TBE Liquid Concentrate</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:115px;">0658-5L</td>
			<td style="width:360px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">96-well plate, flat bottom</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229195</td>
			<td style="width:360px;">VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Agarose</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Borosilicate Glass Capillary without Filament</td>
			<td style="width:139px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:115px;">B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-EI126-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E3 media</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Femtotips Microloader Tips</td>
			<td style="width:139px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:115px;">930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td>FIJI</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Large Particle (LP) Sampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methotrexate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6770-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral Oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>PBL06-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stage Micrometer (400-Stage)</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>400-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:139px;">Pentair Aquatic</td>
			<td style="width:115px;">TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">VAST Bioimager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vincristine Sulfate</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T117-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vybrant DiI Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>V22885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish

Pasientavledede xenograftmodeller er avgjørende for å definere hvordan ulike kreftformer reagerer på medikamentell behandling i et in vivo-system. Musemodeller er standarden i feltet, men sebrafisk har dukket opp som en alternativ modell med flere fordeler, inkludert evnen til høy gjennomstrømning og lavpris narkotikascreening. Sebrafisk tillater også in vivo narkotikascreening med store replikeringstall som tidligere bare var oppnåelige med in vitro-systemer. Evnen til raskt å utføre store narkotikaskjermer kan åpne opp muligheten for personlig medisin med rask oversettelse av resultater tilbake til klinikken. Zebrafish xenograft modeller kan også brukes til å raskt screene for handlingsbare mutasjoner basert på tumorrespons på målrettede terapier eller for å identifisere nye anti-kreft forbindelser fra store biblioteker. Den nåværende store begrensningen i feltet har vært å kvantifisere og automatisere prosessen slik at narkotikaskjermer kan gjøres i større skala og være mindre arbeidskrevende. Vi har utviklet en arbeidsflyt for xenografting primære pasientprøver i sebrafisk larver og utføre store narkotika skjermer ved hjelp av en fluorescens mikroskop utstyrt bildeenhet og automatisert sampler enhet. Denne metoden gjør det mulig for standardisering og kvantifisering av enpodet tumorområde og respons på narkotikabehandling på tvers av et stort antall sebrafisklarver. Samlet sett er denne metoden en fordel fremfor tradisjonell cellekultur medikamentscreening, da det gir mulighet for vekst av tumorceller i et in vivo-miljø gjennom narkotikabehandling, og er mer praktisk og kostnadseffektiv enn mus for store in vivo-legemiddelskjermer.

Etter protokollen beskrevet ovenfor, sebrafisk ble xenografted i eggeplomme og perikardium med primær pasient PBMCs som opprinnelig ble isolert fra en T-celle akutt lymfoblastisk leukemi (T-ALL) pasient ved diagnose og banket som en levedyktig, frossen prøve. Ved 48 hk i ble xenografted fisk screenet for fluorescerende merkede tumorceller (Figur 2C, D) og behandlet med kjemoterapi (deksametason eller vinkristin) eller DMSO. Fisk ble avbildet ved 7 dpi, etter 3 dager på me...

Watch this Scientific Journal Video about Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish at JoVE.com

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Zebrafish xenograft modeller tillate høy gjennomstrømning narkotika screening og fluorescerende avbildning av menneskelige kreftceller i en in vivo mikromiljø. Vi utviklet en arbeidsflyt for storskala, automatisert legemiddelscreening på pasientavledede leukemiprøver i sebrafisk ved hjelp av et automatisert fluorescensmikroskop utstyrt bildeenhet.

Narkotikascreening av primær pasient avledet tumor xenografts i sebrafisk

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Vår arbeidsflyt for gruppescreening av sebrafisk xenograft gir mulighet for automatisert avbildning og kvantifisering av humane kreftceller og deres respons på narkotikabehandling. Den kan brukes til raskt å teste responsen fra en tålmodighet kreftceller til kjente legemidler eller for å identifisere nye kreftforbindelser. Ved hjelp av sebrafisk xenograph modeller og narkotika screening tillater Inviva replikanttall som tidligere bare var oppnåelig med in vitro systemer.Det er også mye mer kostnadseffektivt enn musemodeller på screening gjennom store biblioteker av forbindelser. Denne arbeidsflyten har flere skritt fra interjection av kreftceller i sebrafisk til avbildning av narkotikarespons som er lært best ved visuell demonstrasjon. Til å begynne, sentrifuge minst to ganger 10 til de sjette cellene i fem millimeter PBS på 200 ganger g i fem minutter, og aspirere supernatant.Resuspend cellepaletten i fem millimeter dii farging løsning. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius beskyttet mot lys i 20 minutter. Deretter virvler forsiktig og inkubere cellene på is i 15 minutter beskyttet mot lys.Sentrifuger deretter cellene ved 200 ganger g i fem minutter og aspirer overnatanten. Vask cellene ved å legge til fem milliliter PBS, sentrifugering på 200 ganger g i fem minutter, og aspirere det overnaturlige. Gjenta vasken en ekstra gang.Gjenoppusst cellene i ett mikroliter PBS per 250 tusen levende celler og overfør dem til et 1,5 millimeter mikro sentrifugerør. Hold de gjenbrukte cellene på isen i mørket. Før farging celler og injeksjon, lage agarose plater for injeksjon ved å helle 25 millileiers av tre prosent oppsto i 1X TBE i en petriskål og la den størkne.Oppbevar platene ved fire grader Celsius i opptil to uker. Også før farging celler og sprøytebruk, deklorere to dagers etter befruktning sebra fisk ved hjelp av tang under et dissekeremikroskop. Trekk fra de motsatte endene av den beskyttende chorion av sebrafisken med tang til chorion tårer og sebrafisken blir uutviklet.For å forhindre klumping av celler under mikroinjeksjon, pre chill non filamentous borosilicate glass nåler på fire grader Celsius eller på is. Umiddelbart etter farging celler, bruk en mikroloader pipette tips for å laste fem mikroliter av fargede celler inn i kjølt nål. Legg nålen i mikroinjektorarmen.Utjevn nålespissen med et sterilt barberblad. Ved hjelp av et stadium mikrometer, måle dråpestørrelsen i mineralolje. Hold dråpevolumet konsekvent ved to nanoliter, som er rundt 1,5 millimeter i diameter.Ett minutt etter anestesi, overfør de bedøvede larver til en forberedt flat overflateinjeksjonsplate med tre prosent agarose, og injiser larver med en pumpe av fargede celler på ønsket injeksjonssted. Alle injeksjoner bør fullføres innen en til tre timer etter farging av cellene for å hindre klumping av nålen. Vask larvene av injeksjonsplaten i en 10 centimeter petriskål som inneholder E3-medier uten metylenblå og inkuber ved 28 grader Celsius i en time gjenopprettingsperiode.Flytt parabolen til de injiserte larver i en 34 graders Celsius inkubator. Med en tom petriskål plassert mellom hyllen og petriskålen av larver for å fungere som en buffer. Ved 48 timers post injeksjon, skjermen sebra fisk larver for fluorescerende tumor celle engraftment og helse.Fjern eventuelle døde eller misformede sebrafisk, og velg sebrafisk med lignende engraftment. Fjern uengraftert sebrafisk. For eggeplomme injisert fisk, fjern fisk der grensene til åket ikke kan sees rundt engrafted cellemasse.For perikard injisert fisk, fjern fisk der injisert cellemasse griper inn i eggeplommesekken. For å overføre den valgte fisken til en 96-brønns tallerken, kutt først spissen av en 200 mikroliter pipettespiss, akkurat stor nok til at en fire dagers post befruktning sebrafisk passer gjennom. Aspirer 150 mikroliter E3-medier med en sebrafisk fra platen ved hjelp av P200-pipetten og legg den til en tom brønn på en flat bunnplate på 96 brønner.Tilsett 150 mikroliter 2X fortynnet legemiddelløsning til hver brønn som inneholder sebrafisklarver for å nå et endelig volum på 300 mikroliter med 1X legemiddelløsning per brønn. Inkuber platen ved 34 grader Celsius. Se etter død sebrafisk daglig.Etter to dager, om ønskelig, oppdatere stoffet ved å erstatte 200 mikroliter væske fra hver brønn med 1X narkotikaløsning eller DMSO i E3 media. I Zen blå-programvaren fjerner du alle uønskede fluorescerende kanaler i bildebehandlingsprogramvaren og legger til Dii-kanalen. Kontroller ønsket fluorescerende kanal.I samme vindu velger du hvordan bildene skal tas, Z-stabler, automatisering, løkker og serier, et cetera. Bilde DMSO kontroll fisk før stoffet behandlet fisk. Og angi riktig eksponeringstid i bildebehandlingsprogramvaren.For å kvantifisere fluorescensen, åpne imagej programvare. Gå til fil, åpne og velg ønsket CZI-fil. Programvaren bringer opp et importalternativer vindu.For stabelvisning velger du hyperstabler, kontrollerer åpne filer individuelt, kontrollerer automatisk skalering og kontrollerer delte kanaler. Velg fargeisert for fargealternativet. Klikk deretter plugins, makroer, post.Klikk på bilde, justering, terskel. Velg bildetype som rød i rullegardinmenyen til høyre i terskelvinduet. Juster minimumsterskelen til programvaren bare uthever områder med fluorescens, og klikk deretter på bruk.Programvaren konverterer bildet til svart-hvitt med det valgte området i svart. Klikk analyser og mål. Programvaren trekker opp et resultatvindu som inneholder det fluorescerende området for det bildet.Klikk opprett i makroopptakervinduet. Dette åpner et nytt vindu med koden for makroen. Fremhev alle de ønskede bildene for analyse og åpne i henhold til stabling visning eller farge alternativ.Velg Kjør i vinduet med makroen. Resultatvinduet inneholder nå området for hvert bilde. I denne protokollen, ved 48 timers etter injeksjon, ble xenografted fisk screenet for fluorescerende merkede tumorceller og behandlet med kjemoterapi eller DMSO.Samlet sett viste xenografted fisk behandlet med Vincristine den største og mest konsistente nedgangen i xenografted cellemasse sammenlignet med DMSO behandlet fisk. Deksametasonbehandlet fisk viste omtrent halvparten av reduksjonen i tumorområdet sammenlignet med Vincristine. Men fortsatt viste en reduksjon i tumorområdet sammenlignet med DMSO.Denne prosedyren kan brukes til å screene enhver kreftcellelinje eller pasientprøve for respons på forskjellige legemidler eller spesifikke målrettede terapier som gir innsikt i hver pasients svulst.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Merking av brystkreftpasient-avledet xenografter med Spor Reporters for tumorvekst og metastase Studier

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Etablering av en primære kultur for pasient-avledede bløtvev sarkom

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow cytometri å anslå leukemi stamceller i primære akutt myelogen leukemi og pasient-avledet-xenografts, diagnose og følge opp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering og karakterisering av tumor-initiere celler fra sarkom pasient-avledet Xenotransplantater

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Pasient-avledet heterogen Xenograft modell av bukspyttkjertelen Cancer bruke sebrafisk larver som verter for sammenlignende Drug Assessment

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologiske pasient avledet 3D Spheroids for anti-neoplastic Drug screening å målrette Cancer stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

I vivo Imaging og kvantifisering av Host angiogenic Response i sebrafisk tumor Xenotransplantater

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering av magekreft pasient-avledet Xenograft modeller og primær celle Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testing av målrettede behandlinger mot kreft ved hjelp av strukturell DNA-endringsanalyse og pasientavledede Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Forbedret levedyktighet for Ex vivo 3D hydrogelkulturer av pasientavledede Xenografts i en perfused mikrofluidisk plattform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...