Name: drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish
Uploaded: 2020-04-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish at JoVE.com

Denna forskning stöddes av en V Foundation V Scholar Award och NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (till JS Blackburn) och NIH Training Grant T32CA165990 (till M.G. Haney).

Alla procedurer som beskrivs i detta protokoll har godkänts av University of Kentucky's Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll 2015-2225). Patientprover samlades in under University of Kentucky's Institutional Review Board (protokoll 44672). Alla djurförsök som utförs enligt detta protokoll måste godkännas av användarens kommitté för institutionsvård och användning av djur.
1. Upptining primär patient akut lymfatisk leukemi celler
<ol><li>Tina primära patienten p...

<ol>
	<li>Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+human+malignant+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+embryos:+assessment+of+migration+and+cell+division+in+the+absence+of+tumor+formation.">The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).</li><li>Topczewska, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+tumorigenic+pathways+converge+via+Nodal+signaling:+role+in+melanoma+aggressiveness.">Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness.</a> Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).</li><li>Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukaemia+xenotransplantation+in+zebrafish--chemotherapy+response+assay+in+vivo.">Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo.</a> British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).</li><li>Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=15+years+of+zebrafish+chemical+screening.">15 years of zebrafish chemical screening.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).</li><li>Ghotra, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole+animal+bio-imaging+assay+for+human+cancer+dissemination.">Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination.</a> PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., W&#228;hlby, C., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).</li><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+automating+the+imaging+of+zebrafish+larvae.">Tools for automating the imaging of zebrafish larvae.</a> Methods. 96, 118-126 (2016).</li><li>Henn, K., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dechorionation+as+a+tool+to+improve+the+fish+embryo+toxicity+test+(FET)+with+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio).</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &amp; Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Embryo+Xenograft+and+Metastasis+Assay.">Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay.</a> Bio-Protocol. 8 (18), (2018).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).</li><li>Cold Spring Harbor Laboratory Press. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+medium+(for+zebrafish+embryos).">E3 medium (for zebrafish embryos).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).</li><li>Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Xenograft+Platform:+Evolution+of+a+Novel+Cancer+Model+and+Preclinical+Screening+Tool.">The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish.">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li><li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Engrafted+Human+Cancer+and+Therapy+Responses+in+Immunodeficient+Zebrafish.">Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish.</a> Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li></ol>

I denna studie visade vi en standardiserad metod för upptining och injektion av primära patienten leukemi celler i zebrafish som en xenograft modell. Vi etablerade också ett protokoll för hög genomströmning drog screening av xenografted zebrafisk med hjälp av en fluorescens mikroskop utrustad bildhantering enhet och automatiserad sampler enhet. Tidigare har xenografts rapporterats med mänskliga cellinjer, och kvantifiering av xenografted tumörer i en hög genomströmning sätt har varit en utmaning i området. D...

Xenografting av primära patientcancer eller mänskliga cancer cellinjer i modellorganismer är en allmänt använd teknik för att studera tumör progression och beteende in vivo, tumör svar på läkemedelsbehandling, och cancer cell interaktion med mikromiljön, bland annat. Traditionellt är celler xenografted i immun-äventyras möss, och detta är fortfarande standard i fältet. Emellertid, denna modell system har flera begränsningar, såsom höga kostnader, låga replikera nummer, svårigheter att exakt kvantifiera tumör börda in vivo, och den förlängda tid som det tar för tumörer att engraft och drogtester som skall slutföras. Under de senaste åren har zebrafiskar vuxit fram som en alternativ xenograft modell, med den första rapporteras i 2005, med grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt humant melanom cellinjer transplanteras till blastula-steg embryon1,2. På senare tid har 2 dagars post-befruktning (dpf) zebrafisklarver använts som xenograft mottagare för att möjliggöra kontroll av anatomisk placering av injektion och för användning i hög upplösning in vivo imaging av tumör interaktion med den omgivande mikromiljö3,4.
Zebrafish erbjuder många fördelar som xenograftmodell. För det första kan vuxna zebrafiskar inhysas och snabbt födas upp i stora mängder till en relativt låg kostnad. Varje parning par vuxna zebrafiskar kan producera hundratals larvfisk per vecka. På grund av sin ringa storlek kan dessa larv zebrafiskar underhållas i 96-brunnsplattor för drogscreening med hög genomströmning. Larver behöver inte matas under loppet av ett typiskt xenograftexperiment, eftersom deras äggula-säck ger näringsämnen för att upprätthålla dem under sin första vecka i livet. Dessutom har zebrafiskar inte ett fullt fungerande immunsystem förrän 7 dpf, vilket innebär att de inte kräver bestrålning eller immunsuppressiva regimer före xenograft injektion. Slutligen, optiskt tydliga zebrafisk linjer möjliggör högupplöst avbildning av tumör-mikromiljö interaktioner.
Kanske den mest lovande tillämpningen av zebrafisk som en xenograft modell är förmågan att utföra hög genomströmning läkemedelsscreening på mänskliga cancerprover på ett sätt som inte är möjligt att använda någon annan modell organism. Larver absorberar droger från vattnet genom huden, vilket ökar nyttan av läkemedelsadministration5. Eftersom djur hålls i 96-brunnsplattor, vanligtvis i 100−300 μl vatten, kräver skärmar mindre läkemedelsmängder jämfört med möss. För närvarande finns det flera olika metoder för standardisering och kvantifiering av effekten av läkemedel på mänskliga tumör börda i zebrafisk, av vilka några är mer praktiska än andra för uppskalning enda drogtester till hög genomströmning screening. Till exempel, vissa grupper separera fisk i encelliga suspensioner, och kvantifiera fluorescerande märkta eller färgade tumörceller genom att avbilda enskilda droppar av suspensionen och kvantifiera fluorescens med hjälp av en halvautomatisk ImageJ makro4. En halvautomatisk hellarv imaging metod utvecklades där larvfisk fastställdes i 96-väl plattor och avbildas med hjälp av en inverterad fluorescerande mikroskop innan omjustering av sammansatta bilder och kvantifiering av tumörcellfoci6. Båda dessa analyser är ganska arbetsintensiva metoder för kvantifiering, vilket har gjort verkligt hög genomströmning drog screening i zebrafish xenograft modeller opraktiskt.
Detta problem har åtgärdats genom utvecklingen av vertebrate automated screening technology (VAST) Bioimager and Large Particle (LP) Sampler, en fluorescensmikroskop utrustad bildenhet och automatiserad provtagare enhet (figur 1 och tabell över material), som är en verkligt automatiserad metod för hög genomströmning imaging av zebrafisk larver7,,8,9. Med denna enhet, fisk sövs, provsatts automatiskt från en 96-brunn platta, placerad i en kapillär och roteras i den inställda orienteringen baserat på en förinställd användarpreferens, avbildas, och sedan antingen placeras tillbaka i samma brunn av en ny 96-brunn platta för ytterligare studier eller kasseras. Kombinera denna bildframställning teknik med zebrafish xenografts kan möjliggöra möjligheten att personlig medicin som använder hög genomströmning drog screening av stora drog sammansatta bibliotek mot enskilda patienttumörer. Zebrafish xenografts erbjuder också en storskalig och billig metod för att testa både toxicitet och effekt av nya föreningar in vivo. Zebrafiskar kan användas som ett preliminärt screeningsteg innan man fortsätter till mus xenograft modeller.
Vi har utvecklat ett strömlinjeformat arbetsflöde för xenografting primära patienten leukemi celler till zebrafisk och utför hög genomströmning läkemedelsskärmar med automatiserad avbildning och kvantifiering, som kan tillämpas på alla andra primära patienttumörceller eller cancer cellinje. Detta arbetsflöde utnyttjas en fluorescens mikroskop utrustade imaging enhet och automatiserad sampler enhet för att förbättra på nuvarande standardisering och kvantifiering metoder och erbjuder ett automatiserat alternativ till tidigare, mer arbetsintensiva metoder för att kvantifiera tumör massa in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10x TBE Liquid Concentrate</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:115px;">0658-5L</td>
			<td style="width:360px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">96-well plate, flat bottom</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229195</td>
			<td style="width:360px;">VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Agarose</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Borosilicate Glass Capillary without Filament</td>
			<td style="width:139px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:115px;">B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-EI126-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E3 media</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Femtotips Microloader Tips</td>
			<td style="width:139px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:115px;">930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td>FIJI</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>36150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Large Particle (LP) Sampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methotrexate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6770-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral Oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>PBL06-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stage Micrometer (400-Stage)</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>400-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:139px;">Pentair Aquatic</td>
			<td style="width:115px;">TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">VAST Bioimager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:360px;">fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vincristine Sulfate</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T117-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vybrant DiI Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>V22885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish

Patientbaserade xenograftmodeller är avgörande för att definiera hur olika cancerformer svarar på läkemedelsbehandling i ett in vivo-system. Musmodeller är standard på området, men zebrafiskar har vuxit fram som en alternativ modell med flera fördelar, bland annat möjligheten till hög genomströmning och billig drogscreening. Zebrafisk möjliggör också in vivo drogscreening med stora replikattal som tidigare endast kunde erhållas med in vitro-system. Förmågan att snabbt utföra storskaliga läkemedelsskärmar kan öppna upp möjligheten för personlig medicin med snabb översättning av resultat tillbaka till kliniken. Zebrafish xenograft modeller kan också användas för att snabbt skärmen för användbara mutationer baserat på tumör svar på riktade terapier eller för att identifiera nya anti-cancer föreningar från stora bibliotek. Den nuvarande stora begränsningen inom området har kvantifierat och automatiserat processen så att läkemedelsskärmar kan göras i större skala och vara mindre arbetsintensiva. Vi har utvecklat ett arbetsflöde för att xenografting primära patientprover i zebrafisklarver och utföra storskaliga läkemedelsskärmar med hjälp av en fluorescensmikroskop utrustad bildenhet och automatiserad sampler enhet. Denna metod möjliggör standardisering och kvantifiering av engrafted tumörområde och svar på läkemedelsbehandling över ett stort antal zebrafisklarver. Sammantaget är denna metod fördelaktigt jämfört med traditionell cellkultur drog screening eftersom det möjliggör tillväxt av tumörceller i en in vivo miljö under hela läkemedelsbehandling, och är mer praktisk och kostnadseffektiv än möss för storskaliga in vivo läkemedelsskärmar.

Efter protokollet som beskrivs ovan, var zebrafish xenografted i äggula och hjärtsäcken med primära patienten PBMCs som ursprungligen isolerades från en T-cells akut lymfatisk leukemi (T-ALL) patient vid diagnos och bankas som en livskraftig, fryst prov. Vid 48 hpi, xenografted fisk screenades för fluorescerande märkta tumör celler (figur 2C,D) och behandlas med kemoterapi (dexametason eller vincristine) eller DMSO. Fisk avbildades vid 7 dpi, efter 3 dagar på läkem...

Watch this Scientific Journal Video about Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish at JoVE.com

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Zebrafish xenograft modeller möjliggör hög genomströmning läkemedelsscreening och fluorescerande avbildning av mänskliga cancerceller i en in vivo mikromiljö. Vi utvecklade ett arbetsflöde för storskalig, automatiserad läkemedelsscreening på patientbaserade leukemiprover i zebrafiskar med hjälp av en automatiserad fluorescensmikroskop utrustad bildenhet.

Läkemedelsscreening av primär patient härledd tumör Xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Vår zebrafisk xenograft drogscreening arbetsflöde möjliggör automatiserad bildbehandling och kvantifiering av mänskliga cancerceller och deras svar på läkemedelsbehandling. Det kan användas för att snabbt testa svaret av ett tålamods cancerceller till kända läkemedel eller för att identifiera nya anticancer föreningar. Använda zebrafish xenograph modeller och drog screening möjliggör Inviva replicant nummer som tidigare endast kan erhållas med in vitro-system.Det är också mycket mer kostnadseffektivt än musmodeller vid screening genom stora bibliotek av föreningar. Detta arbetsflöde har flera steg från interjektion av cancerceller i zebrafisk till bildframställning av läkemedelsrespons som lärs bäst genom visuell demonstration. Till att börja med centrifug minst två gånger 10 till de sjätte cellerna i fem millimeter PBS vid 200 gånger g i fem minuter, och aspirera supernatanten.Resuspend cell paletten i fem millimeter av dii färgning lösning. Inkubera cellerna i 37 grader Celsius skyddas från ljus i 20 minuter. Sedan virvel försiktigt och inkubera cellerna på is i 15 minuter skyddas från ljus.Sedan centrifugera cellerna på 200 gånger g i fem minuter och aspirera supernatanten. Tvätta cellerna genom att lägga till fem milliliter PBS, centrifugera vid 200 gånger g i fem minuter och aspirera supernatanten. Upprepa tvätten en extra gång.Resuspend cellerna i en mikroliter av PBS per 250 tusen levande celler och överföra dem till en 1,5 millimeter mikro centrifug röret. Håll de återanvända cellerna på is i mörkret. Före färgning celler och injicera, gör agaros plattor för injicering genom att hälla 25 millileiers av tre procent uppstod i 1X TBE i en petriskål och låt den stelna.Förvara plattorna i fyra grader Celsius i upp till två veckor. Även före färgning celler och injicera, dechlorinate två dagar efter befruktning zebra fisk med hjälp av tlyktor under en dissekera mikroskop. Dra från de motsatta ändarna av zebrafiskens skyddande chorion med tång tills chorion tårarna och zebrafisken blir outvecklad.För att förhindra klumpar av celler under mikroinjection, pre chill icke fintrådiga borosilikat glasnålar vid fyra grader Celsius eller på is. Omedelbart efter färgning celler, använd en microloader pipett spets för att ladda fem mikroliter av färgade celler i kylda nålen. Ladda nålen i microinjector armen.Jämna nålspetsen med hjälp av ett sterilt rakblad. Med hjälp av en steg mikrometer, mäta droppstorlek i mineralolja. Håll droppvolymen konsekvent vid två nanoliter, vilket är cirka 1,5 millimeter i diameter.En minut efter anestesi, överför de sövda larverna till en förberedd plan yta injektionsplatta med tre procent agarose, och injicera larverna med en pump av färgade celler vid önskat injektionsställe. Alla injektioner ska slutföras inom en till tre timmar efter färgning av cellerna för att förhindra klumpning av nålen. Tvätta larverna av injektionsplattan i en 10 centimeter petriskål som innehåller E3-media utan metylenblått och inkubera vid 28 grader Celsius under en en timmes återhämtningsperiod.Flytta skålen av de injicerade larverna i en 34 grader Celsius inkubator. Med en tom petriskål placerad mellan hyllan och petriskålen av larver för att fungera som en buffert. Vid 48 timmars post injektion, skärm zebra fisk larver för fluorescerande tumör cell engraftment och hälsa.Ta bort alla döda eller missbildade zebrafiskar, och välj zebrafisk med liknande engraftment. Ta bort icke-förankrade zebrafiskar. För äggula injicerad fisk, ta bort fisk där okets gränser inte kan ses runt den engraftade cellmassan.För perikardium injicerad fisk, ta bort fisk där injicerad cellmassa inkräktar i äggulan säcken. För att överföra den valda fisken till en 96-brunnsplatta, skär först spetsen av en 200 mikroliter pipett spets, bara tillräckligt stor för en fyra dagars efter befruktning zebra fisk att passa igenom. Aspirera 150 mikroliter av E3-media med en zebrafisk från plattan med hjälp av P200-pipetten och lägg den i en tom brunn av en platt botten 96-brunnsplatta.Tillsätt 150 mikroliter av 2X utspädd läkemedelslösning till varje brunn som innehåller zebrafisklarver för att nå en slutlig volym på 300 mikroliter med 1X läkemedelslösning per brunn. Inkubera plattan vid 34 grader Celsius. Kolla efter döda zebrafiskar dagligen.Efter två dagar, om så önskas, uppdatera läkemedlet genom att ersätta 200 mikroliter vätska från varje brunn med 1X läkemedelslösning eller DMSO i E3-media. I programvaran Zen blue tar du bort alla oönskade lysrörskanaler i bildhanteringsprogrammet och lägger till Dii-kanalen. Kontrollera önskad fluorescerande kanal.I samma fönster väljer du hur bilderna ska tas, Z-stackar, automatisering, slingor och serier, et cetera. Bild DMSO kontroll fisk innan läkemedlet behandlade fisk. Och ställ in lämplig exponeringstid i bildhanteringsprogrammet.För att kvantifiera fluorescensen, öppna imagej programvara. Gå till fil, öppna och välj önskad CZI-fil. Programvaran tar upp en import alternativ fönster.För stapelvisning väljer du hyperstacks, kontrollerar öppna filer var för sig, kontrollerar automatisk skala och kontrollerar delade kanaler. För färgalternativet väljer du färgat. Klicka sedan på plugins, makron, spela in.Klicka på bild, justera, tröskel. Välj bildtyp som röd i rullgardinsmenyn till höger i tröskelfönstret. Justera minimitröskeln tills programvaran bara framhäver områden med fluorescens och klicka sedan på Tillämpa.Programvaran konverterar fotot till svartvitt med det valda området i svart. Klicka på analysera och mäta. Programvaran drar upp ett resultatfönster som innehåller fluorescerande området för den bilden.Klicka på Skapa på makroinspelaren fönstret. Detta öppnar upp ett nytt fönster med koden för makrot. Markera alla önskade bilder för analys och öppna enligt stapling visning eller färg alternativ.Välj kör på fönstret med makrot. Resultatfönstret innehåller nu området för varje bild. I detta protokoll, vid 48 timmars post injektion, xenografted fisk screenades för fluorescerande märkt tumörceller och behandlas med kemoterapi eller DMSO.Totalt sett visade xenografted fisk behandlas med Vincristine den största och mest konsekventa minskningen i xenografted cell massa jämfört med DMSO behandlade fisk. Dexametason behandlade fisk visade ungefär hälften av minskningen i tumör område jämfört med Vincristine. Men ändå visade en minskning av tumör område jämfört med DMSO.Detta förfarande kan användas för att screena någon cancer cellinje eller patientprov för svar på olika läkemedel eller specifika riktade terapier ger insikt i varje patients tumör.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Märkning av bröstcancerpatient som härrör xenografter med spår Reportrar för tumörtillväxt och metastas studier

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Inrättandet av en primär kultur av patientderiverade mjukdelssarkom

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flödescytometri för att uppskatta leukemi stamceller i primär akut myeloisk leukemi och i Patient-härrör-xenograft, vid diagnos och följa upp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering och karakterisering av tumör-initiera celler från sarkom patient-derived xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-derived heterogena xenograft modell av pankreascancer med Zebrafish larver som värdar för jämförande drog bedömning

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisk patient härledda 3D spheroids för anti-neoplastisk drog screening för att rikta cancer stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

In vivo avbildning och kvantifiering av värdens angiogena respons i Zebrafish Tumörxenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Inrättande av patienter med Ventrikelhärledd xenograft-modell och primära cellinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testa riktade terapier i cancer med strukturell DNA-ändringsanalys och patientbaserade Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Förbättrad livskraft för Ex vivo 3D Hydrogel Kulturer av patient-derived Xenografts i en Perfused mikrofluidisk plattform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...