Name: impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion
Uploaded: 2020-04-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion at JoVE.com

Wij danken Olivia Funk voor haar technische hulp bij de real-time cel analyse systeem gegevens. We danken ook het Medical Writing Center van Children's Mercy Kansas City voor het bewerken van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (to TP) en door Children's Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board financiering (to TP).

LET OP: Alle celkweekmaterialen moeten steriel zijn en het hele experiment moet onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast worden uitgevoerd.
1. Cultuur en elektroporatie van de U-118MG Glioblastoom Cell Line
<ol><li>Kweek de U-118MG cellijn in 5% foetaal runderserum (FBS) met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (kweekmedium) en Houd op 37 °C in een vochtige atmosfeer met 5% CO2 incubator (kweekomstandigheden).</li>
	<li>Gebruik 70– 80% conflue...

<ol>
	<li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+Growth+Requires+CT10+Regulator+of+Kinase+(Crk)+and+Crk-like+(CrkL).">Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Mudduluru, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Axl+receptor+tyrosine+kinase+expression+by+miR-34a+and+miR-199a/b+in+solid+cancer.">Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer.</a> Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).</li><li>Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+zinc+finger+1+induces+migration,+invasion,+and+in+vivo+metastasis+through+Axl+gene+expression+in+solid+cancer.">Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer.</a> Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).</li><li>Khalili, A. A., Ahmad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Cell+Adhesion+Studies+for+Biomedical+and+Biological+Applications.">A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).</li><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Tumor+Models:+Advantages,+Disadvantages,+Variables,+and+Selecting+the+Right+Platform.">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+xCELLigence+RTCA+Instrument+to+Measure+Cell+Adhesion.">Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion.</a> Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).</li><li>Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+xCELLigence+system+for+real-time+analysis+of+changes+in+cellular+motility+and+adhesion+in+physiological+conditions.">Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+Tyrosine+Phosphorylation+Regulates+PDGF-BB-inducible+Src+Activation+and+Breast+Tumorigenicity+and+Metastasis.">Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).</li><li>Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+method+for+detection+of+endothelial+cell+shape+change+in+real+time:+assessment+of+endothelial+barrier+function.">Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).</li><li>Collins, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+proteins+transduce+FGF+signaling+to+promote+lens+fiber+cell+elongation.">Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Fathers, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+adaptor+proteins+act+as+key+signaling+integrators+for+breast+tumorigenesis.">Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis.</a> Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).</li><li>Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+CrkL+are+required+for+cell+transformation+by+v-fos+and+v-ras.">Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras.</a> Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).</li><li>Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+adapter+proteins+promote+an+epithelial-mesenchymal-like+transition+and+are+required+for+HGF-mediated+cell+spreading+and+breakdown+of+epithelial+adherens+junctions.">Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility.">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li><li>Rodrigues, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrkI+and+CrkII+function+as+key+signaling+integrators+for+migration+and+invasion+of+cancer+cells.">CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells.</a> Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).</li><li>Feller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+family+adaptors-signalling+complex+formation+and+biological+roles.">Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles.</a> Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).</li><li>Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+and+craniofacial+defects+in+Crk-null+mice.">Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway.">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li><li>Hallock, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dok-7+regulates+neuromuscular+synapse+formation+by+recruiting+Crk+and+Crk-L.">Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L.</a> Genes &amp; Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).</li></ol>

De real-time meting van celmigratie en -invasie met behulp van het real-time celanalysesysteem is een eenvoudig, snel en continu bewakingsproces met meerdere, significante voordelen ten opzichte van de traditionele methoden die gegevens op één enkel tijdspunt leveren. Net als bij de traditionele methoden moeten experimentele omstandigheden worden geoptimaliseerd voor elke cellijn voor het real-time celanalysesysteem, omdat elke cellijn kan verschillen in termen van hechting aan het substraat, de groei, de cel-naar-celc...

Kanker is een dodelijke ziekte als gevolg van zijn vermogen om uitzaaiingen naar verschillende organen. Het bepalen van kanker genotypes en fenotypes is van cruciaal belang voor het begrijpen en ontwerpen van effectieve therapeutische strategieën. Decennia van kankeronderzoek hebben geleid tot de ontwikkeling en aanpassing van verschillende methoden om kankergenotypes en fenotypes te bepalen. Een van de laatste technische ontwikkelingen is real-time meting van celmigratie en invasie op basis van celimpedantie. Celhechting aan substraten en celcelcontacten speelt een belangrijke rol bij cel-naar-cel communicatie en regulatie, ontwikkeling en onderhoud van weefsels. Afwijkingen in celhechting leiden tot het verlies van celcelcontact, afbraak van extracellulaire matrix (ECM) en winst van migratie- en binnenvallende vermogens door cellen, die allemaal bijdragen aan metastase van kankercellen naar verschillende organen1,2. Er zijn verschillende methoden beschikbaar om celmigratie (wondgenezing en Boyden-kamertesten) en invasie (Matrigel-Boyden kamertest)3,4,5te bepalen. Deze conventionele methoden zijn semikwantitatief omdat cellen moeten worden gelabeld met een fluorescerende kleurstof of andere kleurstoffen, hetzij voor of na het experiment om celfenotypes te meten. Bovendien zijn mechanische verstoringen in sommige gevallen nodig voor het maken van een wond voor het meten van de migratie van cellen naar de wondplaats. Bovendien zijn deze bestaande methoden tijdrovend, arbeidsintensief en meten ze de resultaten op slechts één eenmalig punt. Bovendien zijn deze methoden gevoelig voor het maken van onjuiste metingen als gevolg van inconsistente behandeling tijdens de experimentele procedure6.
In tegenstelling tot conventionele methoden meet het real-time celanalysesysteem celimpedantie in real-time zonder pre- of poststaining en mechanische schade van cellen. Wat nog belangrijker is, kan de duur van een experiment worden uitgebreid zodat de biologische gevolgen op een tijd-afhankelijke manier kunnen worden bepaald. Het uitvoeren van het experiment is tijdefficiënt en niet arbeidsintensief. Het analyseren van gegevens is relatief eenvoudig en nauwkeurig. In vergelijking met andere methoden is deze methode een van de beste real-time metingen om celmigratie en invasie6,7,8,9te meten .
Giaever en Keese waren de eersten die de impedantie-gebaseerde meting van een celpopulatie op het oppervlak van elektroden10beschreven. Het real-time celanalysesysteem werkt volgens hetzelfde principe. Het gebied van elke microplaat put is ongeveer 80% bedekt met een array van gouden micro-elektroden. Wanneer het elektrodeoppervlak door cellen wordt bezet als gevolg van hechting of verspreiding van de cellen, verandert de elektrische impedantie. Deze impedantie wordt weergegeven als de celindex, die direct evenredig is met de cellen die het elektrodeoppervlak bedekken nadat ze het microporeuze membraan binnendringen (de mediane poriegrootte van dit membraan is 8 μm)11.
Crk en CrkL zijn adaptereiwitten die SH2- en SH3-domeinen bevatten en spelen een belangrijke rol in verschillende cellulaire functies, zoals cytoskeletregulatie, celtransformatie, proliferatie, hechting, epitheel-mesenchymale overgang, migratie, invasie en metastase door te bemiddelen eiwit-eiwit interacties in vele signaleringstrajecten1,12,1313,14,15,16,17, 18. Daarom is het belangrijk om de Crk /CrkL-afhankelijke migratie- en invasieve vermogens van kankercellen te bepalen. Real-time celanalyse werd uitgevoerd om de migratie- en invasieve vermogens van glioblastoomcellen te bepalen bij genknockdown van Crk en CrkL.
Deze methode paper beschrijft gedetailleerde metingen van Crk- en CrkL-gemedieerde migratie en invasie van menselijke glioblastoom cellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1140px;" width="1140">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:339px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:235px;">1300 Series Class II, Type A2</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CIM plates</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>5665825001</td>
			<td>Cell invasion and migration plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Crk siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>J-010503-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CrkL siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>ID: 3522 and ID: 3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modified eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302002</td>
			<td>Culture medium used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>DPBS used to wash the cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Matrigel</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix gel</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neon electroporation system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neon transfection system 10 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001810-01</td>
			<td>siRNA for non targated control</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey CLx (Imaging system)</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Western blot imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RTCA software</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for experiment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scepter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C85360</td>
			<td>Handheld automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">U-118MG</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB15</td>
			<td>Cell lines used for experiments</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">xCELLigence RTCA DP</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>380601050</td>
			<td>Instrument used for experiment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion

Kanker ontstaat als gevolg van ongecontroleerde proliferatie van cellen geïnitieerd door genetische instabiliteit, mutaties, en milieu-en andere stressfactoren. Deze verworven afwijkingen in complexe, meerlaagse moleculaire signaleringsnetwerken veroorzaken afwijkende celproliferatie en overleving, extracellulaire matrixafbraak en metastase naar verre organen. Naar schatting wordt ongeveer 90% van de sterfgevallen ten gevolge van kanker veroorzaakt door de directe of indirecte effecten van de uitgezaaide verspreiding. Daarom is het belangrijk om een zeer betrouwbaar, uitgebreid systeem op te zetten om het gedrag van kankercellen te karakteriseren bij genetische en milieumanipulaties. Een dergelijk systeem kan een duidelijk inzicht geven in de moleculaire regulatie van kankermetastase en de mogelijkheid voor een succesvolle ontwikkeling van gelaagde, nauwkeurige therapeutische strategieën. Vandaar, nauwkeurige bepaling van kankercel gedrag zoals migratie en invasie met winst of verlies van functie van gen(en) maakt beoordeling van de agressieve aard van kankercellen. Het real-time meetsysteem op basis van celimpedantie stelt onderzoekers in staat om tijdens een heel experiment voortdurend gegevens te verzamelen en de resultaten direct te vergelijken en te kwantificeren onder verschillende experimentele omstandigheden. In tegenstelling tot conventionele methoden vereist deze methode geen fixatie, kleuring en monsterverwerking om cellen te analyseren die migreren of binnenvallen. Deze methode papier benadrukt gedetailleerde procedures voor real-time bepaling van migratie en invasie van glioblastoom kankercellen.

Er is gesuggereerd dat Crk en CrkL belangrijk zijn voor celmigratie en invasie in verschillende kankercellenlijnen 13,17. Hoewel Crk en CrkL eiwitten zijn structureel en functioneel op elkaar en spelen essentiële overlappende functies16,19,20,21, veel gen knockdown studies voor Crk en CrkL hebben niet duidelijk aangepakt of de knockdow...

Watch this Scientific Journal Video about Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion at JoVE.com

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Kanker is een dodelijke ziekte als gevolg van zijn vermogen om uitzaaiingen naar verschillende organen. Het bepalen van het vermogen van kankercellen om te migreren en binnen te vallen onder verschillende behandelingsvoorwaarden is cruciaal voor het beoordelen van therapeutische strategieën. Dit protocol presenteert een methode om de real-time gemetastaseerde vermogens van een glioblastoom kanker cellijn te beoordelen.

Impedantie-gebaseerde Real-time meting van kanker cel migratie en invasie

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Met behulp van dit protocol, cel migratie en invasie kan worden onthuld onder real-time omstandigheden waardoor celkinetiek onder verlies of winst van genfunctie en drugs worden bepaald. In tegenstelling tot andere methoden, geen vlekken, mechanische cel schade, of tl-markers nodig. Het belangrijkste is dat de real-time celkinetiek op een effectieve manier kan worden bepaald.Wanneer de U-118MG cellijn cultuur bereikt 70 tot 80%samenvloeiing, was de cellen met PBS voor de behandeling van de cellen met twee milliliters van 0,5% trypsine-EDTA. Na 30 seconden bij 37 graden Celsius, stop de reactie met 10 milliliter vers kweekmedium en breng de vrijstaande cellen over naar een 15 milliliter conische buis. Na het tellen, verzamel de cellen door centrifugatie en resuspend de pellet in een zes keer 10 tot de vijfde cellen per conditieconcentratie in het juiste volume van vers medium.Breng zes keer 10 naar de vijfde cellen in een microcentrifuge buis per aandoening en voeg 800 microliters van Dulbecco's PBS aan elke buis. Na centrifugatie, resuspend elke pellet in 60 microliters van resuspensie buffer R en zes micromolar van het siRNA van belang. Meng elke buis met zachte tikken voordat elektroporating 10 microliter aliquots van elke cel suspensie met drie 10-milliseconde 1, 350 volt pulsen.Na elke behandeling, pool de geëlektreerde cellen van elke aandoening in individuele vijf milliliter aliquots van verse cultuur medium. Dan zaad de cellen in twee 35 millimeter cultuur schotels per aandoening en plaats de cellen in de cel cultuur incubator voor drie dagen. Vijf tot zes uur voor de real-time celanalyse, plaats het real-time celanalysesysteem in de celkweek incubator.Om een invasietest op te zetten, gebruikt u reverse pipetting om 50 microliter DMEM te plaatsen, aangevuld met 0,1 microgram per milliliter extracellulaire matrixgel in elke put van de bovenste kamer van een celinvasieplaat. Verwijder onmiddellijk na het beplating 30 microliter van de extracellulaire matrixoplossing uit elke put en plaats de plaat vier uur in de celkweek incubator. Voor het opzetten van een impedantie meetprogramma, zes uur voor de meting, vervang het medium in alle geëlektreerde celculturen door een laag serummedium.Selecteer onder het tabblad Indeling in de bijbehorende impedantiemetingssoftware de optie viervoudige putten voor elke biologische aandoening. Stel onder het tabblad Planning een eenmalige veegstap voor basislijnmeting in met een interval van één minuut en stel een tweede stap in om de celimpedantie in de respectievelijke afzonderlijke wiegen voor het eigenlijke experiment te meten. Voeg een uur voor het begin van de celimpedantiemeting 160 microliter medium toe, aangevuld met 10%foetaal runderserum als chemoattractant in de putten van de onderste kamer van de celinvasie en migratieplaat.Om invasie te meten, monteer de bovenste kamer met de extracellulaire matrix gel gecoate putten. Om migratie te meten, gebruik je ongecoate putten in de bovenkamer. Voor beide soorten experimenten, vul de putten in de bovenste kamer met 50 microliter van laag serum medium en plaats de kamers in de wieg van het systeem.Klik op het tabblad Bericht in de software om te bepalen of alle putten worden herkend door de besturingseenheid. Als het bericht wordt weergegeven zoals verwacht, is de plaat in de houder klaar voor het experiment. Plaats vervolgens de volledig verpakte platen in de celcultuur incubator in de real-time cel analyse systeem wieg voor een uur om de plaat te acclimatiseren aan de cel cultuur voorwaarden.Terwijl de platen zijn evenwicht, oogst de glioblastoom cellen zoals aangetoond en resuspend de cellen van elke aandoening op een acht keer 10 tot de vijfde cellen per 800 microliter van lage serum medium concentratie. Bovendien, opzij een drie keer 10 tot de vijfde cellen in twee milliliter van cultuur medium voor het zaaien in een 35 millimeter schotel voor downstream westerse vlek analyse. Als u de basislijn voor migratie wilt meten, klikt u aan het einde van de acclimatisatie op de knop Start van de wieg.Nadat de nulmeting is verkregen, breng je de migratie en de invasieplaten van hun respectievelijke wiegen over naar een bioveiligheidskast. Omgekeerde pipet 100 microliters van cellen in viervoudige bovenste kamer putten voor elke biologische aandoening in de juiste put van de cel invasie en migratie platen zoals geprogrammeerd in de controle-eenheid van de wieg. Na het zaaien, houd de platen in de bioveiligheidskast gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de cellen gelijkmatig op de plaatbodem te laten nestelen voordat de platen naar hun respectievelijke wiegen worden overgebracht.Klik op de knop Cradle om te beginnen met het meten met het meten. Als u de wijzigingen in celimpedantie wilt visualiseren als de celindex op een tijdafhankelijke manier tijdens of na voltooiing van het experiment, opent u het tabblad Gegevensanalyse. Als u de gegevens voor elk van de respectieve voorwaarden afzonderlijk of als gemiddelden en/of standaarddeviaties wilt visualiseren, klikt u op de optievakken voor gemiddelde en standaarddeviatie.Als u de celindexgegevens wilt exporteren naar een spreadsheetbestand, plaatst u de cursor in het midden van het venster voor gegevensanalyse en klikt u met de rechtermuisknop. Selecteer in het dialoogvenster dat wordt weergegeven de optie Gegevens kopiëren naar lijstindeling en plak de gegevens in een geopende spreadsheet. Als u het experiment wilt vrijgeven, klikt u op de knop Loslaten in elke houder.Crk adapter eiwit knockdown vermindert Crk1 en Crk2 eiwitniveaus met respectievelijk 85% en 86%zonder crk-achtige eiwitniveaus te induceren. De knockdown van Crk-achtige vermindert Crk-achtige eiwitexpressie met 85%met een lichte vermindering van Crk1 en Crk2 eiwitniveaus. Het combineren van beide siRNAs vermindert Crk1, Crk2, en Crk-achtige expressie met meer dan 80%, terwijl noch Vinculin, noch alpha-Tubulin expressie wordt beïnvloed door een combinatie van Crk of Crk-achtige knockdown.Menselijke hersenen glioblastoom cellen migreren langs een gradiënt in reactie op hoge serumconcentraties het bereiken van het maximale niveau van migratie op 13 uur. In knockdowncellen van Crk, hoewel de migratie in eerste instantie wordt vertraagd, bleven de cellen migreren tot 23 uur. Crk-achtige knockdown vermindert de celmigratie aanzienlijk met de glioblastoomcellijn die hun migratievermogen volledig verliest bij knockdown van zowel Crk als Crk-achtige suggereert dat Crk en Crk-achtige spelen essentiële overlappende rollen in kanker cel migratie.Echter, wanneer celinvasie wordt gecontroleerd over meerdere dagen, de Crk knockdown cellen bereiken een vergelijkbaar maximum niveau van celinvasie in vergelijking met controle glioblastoom cellen op 60 uur met Crk-achtige cellen gedeeltelijk herstellen van hun invasieve vermogen door 90 uur en dubbele Crk-Crk cellen waaruit blijkt een verminderd vermogen om binnen te vallen na 40 uur. De resultaten ondersteunen duidelijk de suggestie dat celinvasie over de gehele periode van het experiment moet worden geanalyseerd. Het zaaien van het juiste aantal cellen en het vermijden van de luchtbellen tijdens het opnemen van de extracellulaire matrix voor invasietest en zaaiende cellen zijn belangrijke punten voor succes van dit experiment.Volgens soortgelijke procedure, maar met behulp van e-platen, celhechting en cel proliferatie kinetiek kan worden bepaald.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Een Model voor perineurale invasie in hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de Video Microscoop gebaseerde kras wond Assay en de bepaling van Boyden kamer

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Met behulp van de Dot-Assay voor het analyseren van de migratie van cel bladen

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum en Plasma kopiëren nummer detectie met behulp van PCR in real time

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3D-celcultuur voor het bestuderen van de invasie en evalueren van Therapeutics in blaaskanker

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Real-time monitoring van menselijke Glioom Celmigratie op Rugwortel ganglion axon-oligodendrocyte co-culturen

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...