Name: impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion
Uploaded: 2020-04-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion at JoVE.com

Nous remercions Olivia Funk pour son assistance technique aux données du système d’analyse cellulaire en temps réel. Nous remercions également le Medical Writing Center de Children’s Mercy Kansas City d’avoir édité ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (à TP) et par children’s Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Council funding (to TP).

REMARQUE: Tous les matériaux de culture cellulaire doivent être stériles et toute l’expérience doit être effectuée dans une armoire de biosécurité dans des conditions stériles.
1. Culture et électroporation de la lignée cellulaire U-118MG Glioblastoma
<ol><li>Culture la lignée cellulaire U-118MG dans le sérum bovin fœtal (FBS) à 5 % contenant le medium d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco (milieu culturel) et maintenue à 37 oC dans une atmosphère humide c...

<ol>
	<li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+Growth+Requires+CT10+Regulator+of+Kinase+(Crk)+and+Crk-like+(CrkL).">Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Mudduluru, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Axl+receptor+tyrosine+kinase+expression+by+miR-34a+and+miR-199a/b+in+solid+cancer.">Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer.</a> Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).</li><li>Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+zinc+finger+1+induces+migration,+invasion,+and+in+vivo+metastasis+through+Axl+gene+expression+in+solid+cancer.">Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer.</a> Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).</li><li>Khalili, A. A., Ahmad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Cell+Adhesion+Studies+for+Biomedical+and+Biological+Applications.">A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).</li><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Tumor+Models:+Advantages,+Disadvantages,+Variables,+and+Selecting+the+Right+Platform.">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+xCELLigence+RTCA+Instrument+to+Measure+Cell+Adhesion.">Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion.</a> Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).</li><li>Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+xCELLigence+system+for+real-time+analysis+of+changes+in+cellular+motility+and+adhesion+in+physiological+conditions.">Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+Tyrosine+Phosphorylation+Regulates+PDGF-BB-inducible+Src+Activation+and+Breast+Tumorigenicity+and+Metastasis.">Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).</li><li>Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+method+for+detection+of+endothelial+cell+shape+change+in+real+time:+assessment+of+endothelial+barrier+function.">Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).</li><li>Collins, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+proteins+transduce+FGF+signaling+to+promote+lens+fiber+cell+elongation.">Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Fathers, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+adaptor+proteins+act+as+key+signaling+integrators+for+breast+tumorigenesis.">Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis.</a> Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).</li><li>Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+CrkL+are+required+for+cell+transformation+by+v-fos+and+v-ras.">Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras.</a> Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).</li><li>Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+adapter+proteins+promote+an+epithelial-mesenchymal-like+transition+and+are+required+for+HGF-mediated+cell+spreading+and+breakdown+of+epithelial+adherens+junctions.">Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility.">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li><li>Rodrigues, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrkI+and+CrkII+function+as+key+signaling+integrators+for+migration+and+invasion+of+cancer+cells.">CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells.</a> Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).</li><li>Feller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+family+adaptors-signalling+complex+formation+and+biological+roles.">Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles.</a> Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).</li><li>Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+and+craniofacial+defects+in+Crk-null+mice.">Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway.">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li><li>Hallock, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dok-7+regulates+neuromuscular+synapse+formation+by+recruiting+Crk+and+Crk-L.">Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L.</a> Genes &amp; Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).</li></ol>

La mesure en temps réel de la migration cellulaire et de l’invasion à l’aide du système d’analyse cellulaire en temps réel est un processus de surveillance simple, rapide et continu avec des avantages multiples et significatifs par rapport aux méthodes traditionnelles qui fournissent des données à un moment donné. Comme pour les méthodes traditionnelles, les conditions expérimentales doivent être optimisées pour chaque lignée cellulaire pour le système d’analyse cellulaire en temps réel, car chaque...

Le cancer est une maladie mortelle en raison de sa capacité à métastaser à différents organes. La détermination des génotypes et des phénotypes du cancer est essentielle à la compréhension et à la conception de stratégies thérapeutiques efficaces. Des décennies de recherche sur le cancer ont mené au développement et à l’adaptation de différentes méthodes pour déterminer les génotypes et les phénotypes du cancer. L’un des derniers développements techniques est la mesure en temps réel de la migration cellulaire et l’invasion basée sur l’impédance cellulaire. L’adhérence cellulaire aux substrats et aux contacts cellulaires joue un rôle important dans la communication et la régulation des cellules à cellule, le développement et l’entretien des tissus. Les anomalies dans l’adhérence cellulaire conduisent à la perte de contact cellule-cellule, la dégradation de la matrice extracellulaire (ECM), et le gain des capacités migratrices et envahissantes par les cellules, qui contribuent tous à la métastase des cellules cancéreuses à différents organes1,2. Diverses méthodes sont disponibles pour déterminer la migration cellulaire (cicatrisation des plaies et les essais de chambre Boyden) et l’invasion (Matrigel-Boyden chamber assay)3,4,5. Ces méthodes conventionnelles sont semi-quantitatives parce que les cellules doivent être étiquetées avec un colorant fluorescent ou d’autres colorants avant ou après l’expérience pour mesurer les phénotypes cellulaires. En outre, des perturbations mécaniques sont nécessaires dans certains cas pour créer une plaie pour mesurer la migration des cellules vers le site de la plaie. En outre, ces méthodes existantes sont longues, à forte intensité de main-d’œuvre, et mesurent les résultats à un moment donné. En outre, ces méthodes sont sujettes à faire des mesures inexactes en raison de la manipulation incohérente au cours de la procédure expérimentale6.
Contrairement aux méthodes conventionnelles, le système d’analyse cellulaire en temps réel mesure l’impédance cellulaire en temps réel sans nécessiter de dommages pré- ou post-posts et mécaniques des cellules. Plus important encore, la durée d’une expérience peut être prolongée afin que les effets biologiques puissent être déterminés d’une manière dépendante du temps. L’exécution de l’expérience est efficace dans le temps et n’est pas exigeante en main-d’œuvre. L’analyse des données est relativement simple et précise. Par rapport à d’autres méthodes, cette méthode est l’une des meilleures mesures en temps réel pour mesurer la migration cellulaire et l’invasion6,7,8,9.
Giaever et Keese ont été les premiers à décrire la mesure basée sur l’impedance d’une population cellulaire à la surface des électrodes10. Le système d’analyse cellulaire en temps réel fonctionne sur le même principe. La superficie de chaque puits de microplaque est couverte à environ 80 % d’une gamme de microélectrtrodes en or. Lorsque la surface de l’électrode est occupée par des cellules en raison de l’adhérence ou de la propagation des cellules, l’obstacle électrique change. Cet obstacle est affiché comme l’indice cellulaire, qui est directement proportionnel aux cellules couvrant la surface de l’électrode après qu’ils pénètrent dans la membrane microporous (la taille médiane de pores de cette membrane est de 8 m)11.
Crk et CrkL sont des protéines adaptatrices contenant des domaines SH2 et SH3 et jouent des rôles importants dans diverses fonctions cellulaires, telles que la régulation du cytosquelette, la transformation cellulaire, la prolifération, l’adhérence, la transition épithéliale-mésenchymale, la migration, l’invasion et la métastase en médiateur des interactions protéines-protéines dans de nombreuses voies de signalisation1,12,13,14,15,16 ,16, 17, 18. Par conséquent, il est important de déterminer les capacités migratrices et invasives dépendantes de Crk/CrkL des cellules cancéreuses. L’analyse de cellules en temps réel a été effectuée pour déterminer les capacités migratrices et invasives des cellules de glioblastoma sur le knockdown de gène de Crk et de CrkL.
Ce document de méthode décrit des mesures détaillées de la migration et de l’invasion de cellules de glioblastome humain.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1140px;" width="1140">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:339px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:235px;">1300 Series Class II, Type A2</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CIM plates</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>5665825001</td>
			<td>Cell invasion and migration plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Crk siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>J-010503-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CrkL siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>ID: 3522 and ID: 3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modified eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302002</td>
			<td>Culture medium used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>DPBS used to wash the cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Matrigel</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix gel</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neon electroporation system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neon transfection system 10 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001810-01</td>
			<td>siRNA for non targated control</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey CLx (Imaging system)</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Western blot imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RTCA software</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for experiment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scepter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C85360</td>
			<td>Handheld automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">U-118MG</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB15</td>
			<td>Cell lines used for experiments</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">xCELLigence RTCA DP</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>380601050</td>
			<td>Instrument used for experiment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion

Le cancer survient en raison de la prolifération incontrôlée des cellules initiées par l’instabilité génétique, les mutations, et l’environnement et d’autres facteurs de stress. Ces anomalies acquises dans les réseaux de signalisation moléculaire complexes et multicouches induisent la prolifération et la survie aberrantes de cellules, la dégradation extracellulaire de matrice, et la métastase aux organes éloignés. On estime qu’environ 90 % des décès liés au cancer sont causés par les effets directs ou indirects de la dissémination métastatique. Par conséquent, il est important d’établir un système très fiable et complet pour caractériser les comportements des cellules cancéreuses sur les manipulations génétiques et environnementales. Un tel système peut donner une compréhension claire de la régulation moléculaire des métastases cancéreuses et la possibilité de développer avec succès des stratégies thérapeutiques stratifiées et précises. Par conséquent, une détermination précise des comportements des cellules cancéreuses telles que la migration et l’invasion avec gain ou perte de fonction du gène(s) permet d’évaluer la nature agressive des cellules cancéreuses. Le système de mesure en temps réel basé sur l’impédance cellulaire permet aux chercheurs d’acquérir continuellement des données au cours d’une expérience entière et de comparer et de quantifier instantanément les résultats dans diverses conditions expérimentales. Contrairement aux méthodes conventionnelles, cette méthode ne nécessite pas de fixation, de coloration et de traitement d’échantillon pour analyser les cellules qui migrent ou envahissent. Ce document de méthode met l’accent sur les procédures détaillées pour la détermination en temps réel de la migration et l’invasion des cellules cancéreuses de glioblastome.

Il a été suggéré que Crk et CrkL sont importants pour la migration cellulaire et l’invasion dans différentes lignées de cellules cancéreuses13,17. Bien que les protéines Crk et CrkL soient structurellement et fonctionnellement semblables les unes aux autres et jouent les fonctions de chevauchement essentielles16,19,20,21, beau...

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Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Le cancer est une maladie mortelle en raison de sa capacité à métastaser à différents organes. Déterminer la capacité des cellules cancéreuses à migrer et à envahir dans diverses conditions de traitement est crucial pour évaluer les stratégies thérapeutiques. Ce protocole présente une méthode pour évaluer les capacités métastatiques en temps réel d’une lignée de cellules cancéreuses de glioblastome.

Mesure en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules cancéreuses

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

En utilisant ce protocole, la migration cellulaire et l’invasion peuvent être dévoilées dans des conditions en temps réel permettant de déterminer la cinétique cellulaire sous perte ou gain de fonction génétique et de médicaments. Contrairement à d’autres méthodes, aucune coloration, dommages cellulaires mécaniques, ou marqueurs fluorescents nécessaires. Plus important encore, la cinétique cellulaire en temps réel peut être déterminée d’une manière efficace.Lorsque la culture de la lignée cellulaire U-118MG atteint 70 à 80% de confluence, laver les cellules avec PBS avant de traiter les cellules avec deux millilitres de 0,5% trypsine-EDTA. Après 30 secondes à 37 degrés Celsius, arrêter la réaction avec 10 millilitres de milieu de culture frais et transférer les cellules détachées à un tube conique de 15 millilitres. Après comptage, recueillir les cellules par centrifugation et résuspendre la pastille dans un six fois 10 à la cinquième cellule par concentration de condition dans le volume approprié de milieu frais.Transférer six fois 10 à la cinquième cellule dans un tube de microcentrifugeuse par condition et ajouter 800 microlitres de PBS de Dulbecco à chaque tube. Après centrifugation, resuspendez chaque granulé dans 60 microlitres de r tampon de resuspension et six micromolaires du siRNA d’intérêt. Mélanger chaque tube avec un taraudage doux avant d’électroporer 10 aliquots microlitres de chaque suspension cellulaire avec trois impulsions de 10 millisecondes 1, 350 volts.Après chaque traitement, mettre en commun les cellules électroporées de chaque condition dans des aliquots individuels de cinq millilitres de milieu de culture frais. Ensuite, ensemencer les cellules en deux plats de culture de 35 millimètres par condition et placer les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois jours. Cinq à six heures avant l’analyse cellulaire en temps réel, placez le système d’analyse cellulaire en temps réel dans l’incubateur de culture cellulaire.Pour mettre en place un test d’invasion, utilisez le pipetage inversé pour placer 50 microlitres de DMEM complétés par 0,1 microgramme par millilitre de gel matriciel extracellulaire dans chaque puits de la chambre haute d’une plaque d’invasion cellulaire. Immédiatement après le placage, retirez 30 microlitres de la solution de matrice extracellulaire de chaque puits et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre heures. Pour mettre en place un programme de mesure de l’impédance, six heures avant la mesure, remplacez le milieu dans toutes les cultures cellulaires électroporées par un milieu sérique faible.Sous l’onglet Mise en page dans le logiciel de mesure d’impédance associé, sélectionnez des puits quadruplicate pour chaque condition biologique. Sous l’onglet Annexe, définissez une étape unique de balayage de mesure de base avec un intervalle d’une minute et définissez une deuxième étape pour mesurer l’impedance cellulaire dans les berceaux individuels respectifs pour l’expérience proprement dite. Une heure avant le début de la mesure de l’impédance cellulaire, ajouter 160 microlitres de milieu complétés par 10% de sérum bovin fœtal comme chimioattractant dans les puits de la chambre inférieure de la plaque d’invasion cellulaire et de migration.Pour mesurer l’invasion, assemblez la chambre haute contenant les puits enduits de gel matriciel extracellulaire. Pour mesurer la migration, utilisez des puits non encoated dans la chambre haute. Pour l’un ou l’autre type d’expérience, remplissez les puits de la chambre haute de 50 microlitres de milieu sérique faible et placez les chambres dans le berceau du système.Cliquez sur l’onglet Message dans le logiciel pour déterminer si tous les puits sont reconnus par l’unité de contrôle. Si le message s’affiche comme prévu, la plaque dans le berceau est prête pour l’expérience. Ensuite, placez les plaques complètement emballées dans l’incubateur de culture cellulaire dans le berceau du système d’analyse cellulaire en temps réel pendant une heure pour acclimater la plaque aux conditions de culture cellulaire.Pendant que les plaques équilibrent, récoltez les cellules de glioblastome comme démontré et résuspendez les cellules de chaque condition à huit fois 10 à la cinquième cellule par 800 microlitres de faible concentration moyenne de sérum. En outre, réserver trois fois 10 à la cinquième cellule en deux millilitres de milieu de culture pour l’ensemencement dans un plat de 35 millimètres pour l’analyse des taches occidentales en aval. Pour mesurer la lecture de base avant la migration, à la fin de l’acclimatation, cliquez sur le bouton Démarrer du berceau.Une fois la mesure de base acquise, transférez les plaques de migration et d’invasion de leurs berceaux respectifs dans un cabinet de biosécurité. Pipette inverse 100 microlitres de cellules dans les puits de chambre supérieure quadruplicate pour chaque condition biologique dans le puits approprié des plaques d’invasion et de migration cellulaires tel que programmé dans l’unité de contrôle du berceau. Après l’ensemencement, conserver les plaques dans l’armoire de biosécurité pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre aux cellules de s’installer uniformément sur le fond de la plaque avant de transférer les plaques à leurs berceaux respectifs.Cliquez sur le bouton démarrer du berceau pour commencer à mesurer l’impédance cellulaire. Pour visualiser les changements dans l’impedance cellulaire en tant qu’index cellulaire d’une manière dépendante du temps pendant ou après la fin de l’expérience, ouvrez l’onglet Analyse de données. Pour visualiser les données pour chacune des conditions respectives individuellement ou en moyenne et/ou en écarts types, cliquez sur les boîtes d’options pour obtenir un écart moyen et type.Pour exporter les données de l’index cellulaire vers un fichier de feuille de calcul, placez le curseur au milieu de la fenêtre d’analyse des données et cliquez à droite. Dans la boîte de dialogue qui apparaît, sélectionnez les données de copie dans l’option format liste et coller les données dans une feuille de calcul ouverte. Pour libérer l’expérience, cliquez sur le bouton Libération dans chaque berceau.Crk adaptateur protéine knockdown diminue les niveaux de protéines Crk1 et Crk2 de 85% et 86%, respectivement, sans induire des niveaux de protéines crk-like. Le knockdown de Crk-like réduit l’expression de protéine crk-like de 85%avec de légères réductions des niveaux de protéine de Crk1 et de Crk2. La combinaison des deux siRNAs réduit l’expression crk1, crk2 et crk-like de plus de 80%, tandis que ni vinculin ni expression alpha-tubulin n’est affectée par n’importe quelle combinaison de Crk ou Crk-like knockdown.Les cellules du glioblastome cérébral humain migrent le long d’un gradient en réponse à des concentrations élevées de sérum atteignant le niveau maximum de migration à 13 heures. Dans les cellules knockdown Crk, bien que la migration soit initialement retardée, les cellules ont continué à migrer jusqu’à 23 heures. Crk-like knockdown réduit considérablement la migration cellulaire avec la lignée cellulaire du glioblastome complètement perdre leur capacité migratoire à la fois crk et crk-like suggérant que Crk et Crk-like jouent des rôles essentiels chevauchement dans la migration des cellules cancéreuses.Cependant, lorsque l’invasion cellulaire est surveillée sur plusieurs jours, les cellules knockdown Crk atteindre un niveau maximum similaire d’invasion cellulaire par rapport aux cellules de contrôle du glioblastome à 60 heures avec crk-like cellules partiellement récupérer leur capacité invasive de 90 heures et double cellules Crk-Crk démontrant une capacité réduite d’envahir après 40 heures. Les résultats appuient clairement la suggestion selon laquelle l’invasion cellulaire devrait être analysée pendant toute la durée de l’expérience. L’ensemencement du bon nombre de cellules et l’éviter les bulles d’air tout en enregistrant la matrice extracellulaire pour l’essai d’invasion et les cellules d’ensemencement sont des points clés pour le succès de cette expérience.Suivant la procédure semblable mais utilisant des e-plaques, l’adhérence cellulaire et la cinétique de prolifération cellulaire peuvent être déterminées.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Un modèle pour périneural Invasion en tête et du cou Carcinome épidermoïde

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Évaluation de l’Invasion des cellules et le processus de Migration : une comparaison de la rayure axée sur le Microscope vidéo blessure test et le test de chambre de Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Utilisant le test de Dot pour analyser la Migration des cellules feuilles

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Sérum et Plasma copie numéro détection par PCR en temps réel

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Déplacement vers le haut : Un Simple et Flexible In Vitro Invasion en trois dimensions Assay protocole

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Épreuves d’imagerie de cellules vivantes pour étude glioblastome Brain Tumor Stem Cell Migration et Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Système de Culture cellulaire 3D pour étudier l’Invasion et l’évaluation thérapeutique dans le Cancer de la vessie

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Détection en temps réel de dans l’apoptose des cellules tumorales in Vitro induite par CD8+ T Cells pour étudier les fonctions immunitaires de suppresseurs de tumeur-infiltration de cellules myéloïdes

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Un Workflow Simple Migration/Invasion à l’aide d’un imageur automatisé de cellules vivantes

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Surveillance en temps réel de la migration cellulaire des gliomes humains sur les co-cultures d'Axon-Oligodendrocyte de Ganglion de racine dorsal

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...