Name: impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion
Uploaded: 2020-04-02T15:00:00
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Wir danken Olivia Funk für ihre technische Unterstützung bei den Echtzeit-Zellanalysesystemdaten. Wir danken auch dem Medical Writing Center bei Children es Mercy Kansas City für die Bearbeitung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde von Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (to TP) und von Children es Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board (to TP) unterstützt.

HINWEIS: Alle Zellkulturmaterialien müssen steril sein und das gesamte Experiment muss in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
1. Kultur und Elektroporation der U-118MG Glioblastom-Zelllinie
<ol><li>Kultur die U-118MG-Zelllinie in 5% fetalem Rinderserum (FBS), das Dulbeccoes Modified Eagle Medium (DMEM) (Kulturmedium)2 enthält, und Bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre halten, die 5% CO2-Inkubator (Kulturbedingungen) en...

<ol>
	<li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+Growth+Requires+CT10+Regulator+of+Kinase+(Crk)+and+Crk-like+(CrkL).">Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Mudduluru, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Axl+receptor+tyrosine+kinase+expression+by+miR-34a+and+miR-199a/b+in+solid+cancer.">Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer.</a> Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).</li><li>Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+zinc+finger+1+induces+migration,+invasion,+and+in+vivo+metastasis+through+Axl+gene+expression+in+solid+cancer.">Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer.</a> Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).</li><li>Khalili, A. A., Ahmad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Cell+Adhesion+Studies+for+Biomedical+and+Biological+Applications.">A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).</li><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Tumor+Models:+Advantages,+Disadvantages,+Variables,+and+Selecting+the+Right+Platform.">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+xCELLigence+RTCA+Instrument+to+Measure+Cell+Adhesion.">Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion.</a> Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).</li><li>Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+xCELLigence+system+for+real-time+analysis+of+changes+in+cellular+motility+and+adhesion+in+physiological+conditions.">Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+Tyrosine+Phosphorylation+Regulates+PDGF-BB-inducible+Src+Activation+and+Breast+Tumorigenicity+and+Metastasis.">Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).</li><li>Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+method+for+detection+of+endothelial+cell+shape+change+in+real+time:+assessment+of+endothelial+barrier+function.">Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).</li><li>Collins, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+proteins+transduce+FGF+signaling+to+promote+lens+fiber+cell+elongation.">Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Fathers, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+adaptor+proteins+act+as+key+signaling+integrators+for+breast+tumorigenesis.">Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis.</a> Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).</li><li>Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+CrkL+are+required+for+cell+transformation+by+v-fos+and+v-ras.">Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras.</a> Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).</li><li>Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+adapter+proteins+promote+an+epithelial-mesenchymal-like+transition+and+are+required+for+HGF-mediated+cell+spreading+and+breakdown+of+epithelial+adherens+junctions.">Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility.">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li><li>Rodrigues, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrkI+and+CrkII+function+as+key+signaling+integrators+for+migration+and+invasion+of+cancer+cells.">CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells.</a> Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).</li><li>Feller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+family+adaptors-signalling+complex+formation+and+biological+roles.">Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles.</a> Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).</li><li>Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+and+craniofacial+defects+in+Crk-null+mice.">Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway.">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li><li>Hallock, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dok-7+regulates+neuromuscular+synapse+formation+by+recruiting+Crk+and+Crk-L.">Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L.</a> Genes &amp; Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).</li></ol>

Die Echtzeitmessung der Zellmigration und -invasion mit hilfe des Echtzeit-Zellanalysesystems ist ein einfacher, schneller und kontinuierlicher Überwachungsprozess mit mehreren, signifikanten Vorteilen gegenüber den herkömmlichen Methoden, die Daten zu einem einzigen Zeitpunkt bereitstellen. Wie bei den herkömmlichen Methoden müssen die experimentellen Bedingungen für jede Zelllinie für das Echtzeit-Zellanalysesystem optimiert werden, da jede Zelllinie hinsichtlich ihrer Haftung auf dem Substrat, dem Wachstum, den...

Krebs ist eine tödliche Krankheit aufgrund seiner Fähigkeit, auf verschiedene Organe metastasieren. Die Bestimmung von Krebsgenotypen und Phänotypen ist entscheidend für das Verständnis und die Entwicklung wirksamer therapeutischer Strategien. Jahrzehnte der Krebsforschung haben zur Entwicklung und Anpassung verschiedener Methoden zur Bestimmung von Krebsgenotypen und Phänotypen geführt. Eine der neuesten technischen Entwicklungen ist die Echtzeitmessung der Zellmigration und -invasion auf der Grundlage der Zellimpedanz. Die Zellhaftung an Substraten und Zell-Zell-Kontakten spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-zu-Zell-Kommunikation und -Regulierung, Entwicklung und Pflege von Geweben. Anomalien in der Zelladhäsion führen zum Verlust des Zell-Zell-Kontakts, zum Abbau der extrazellulären Matrix (ECM) und zur Verstärkung von Migrations- und Invasionsfähigkeiten durch Zellen, die alle zur Metastasierung von Krebszellen in verschiedene Organe beitragen1,2. Verschiedene Methoden stehen zur Verfügung, um die Zellmigration (Wundheilung und Boyden-Kammer-Assays) und Invasion (Matrigel-Boyden Chamber Assay)3,4,5zu bestimmen. Diese konventionellen Methoden sind semiquantitativ, da Zellen vor oder nach dem Experiment mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder anderen Farbstoffen gekennzeichnet werden müssen, um Zellphänotypen zu messen. Darüber hinaus sind in einigen Fällen mechanische Störungen erforderlich, um eine Wunde zur Messung der Migration von Zellen an die Wundstelle zu bilden. Darüber hinaus sind diese bestehenden Methoden zeitaufwändig, arbeitsintensiv und messen die Ergebnisse nur zu einem Zeitpunkt. Darüber hinaus sind diese Methoden anfällig für ungenaue Messungen aufgrund inkonsistenter Handhabung während des experimentellen Verfahrens6.
Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden misst das Echtzeit-Zellanalysesystem die Zellimpedanz in Echtzeit, ohne dass eine Vor- oder Nachfärbung und mechanische Beschädigung von Zellen erforderlich ist. Noch wichtiger ist, dass die Dauer eines Experiments verlängert werden kann, so dass biologische Effekte zeitabhängig bestimmt werden können. Die Durchführung des Experiments ist zeiteffizient und nicht arbeitsintensiv. Die Analyse von Daten ist relativ einfach und genau. Im Vergleich zu anderen Methoden ist diese Methode eine der besten Echtzeitmessungen zur Messung der Zellmigration und Invasion6,7,8,9.
Giaever und Keese waren die ersten, die die Impedanz-basierte Messung einer Zellpopulation auf der Oberfläche von Elektroden10 beschrieben. Das Echtzeit-Zellanalysesystem arbeitet nach dem gleichen Prinzip. Die Fläche jedes Mikroplattenbrunnens ist zu ca. 80% mit einer Reihe von Goldmikroelektroden bedeckt. Wenn die Elektrodenoberfläche aufgrund der Haftung oder Desasion der Zellen von Zellen belegt wird, ändert sich die elektrische Impedanz. Diese Impedanz wird als Zellindex angezeigt, der direkt proportional zu den Zellen ist, die die Elektrodenoberfläche abdecken, nachdem sie die mikroporöse Membran durchdrungen haben (die mittlere Porengröße dieser Membran beträgt 8 m)11.
Crk und CrkL sind Adapterproteine, die SH2- und SH3-Domänen enthalten und spielen eine wichtige Rolle in verschiedenen zellulären Funktionen, wie Zytoskelettregulation, Zelltransformation, Proliferation, Adhäsion, epithelialer-mesenchymaler Übergang, Migration, Invasion und Metastasierung durch Vermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vielen Signalwegen1,12,13,14,15,16,17, 18. Daher ist es wichtig, die Crk/CrkL-abhängigen Migrations- und invasiven Fähigkeiten von Krebszellen zu bestimmen. Die Echtzeit-Zellanalyse wurde durchgeführt, um die migrations- und invasiven Fähigkeiten von Glioblastomzellen nach dem Gen-Knockdown von Crk und CrkL zu bestimmen.
Dieses Methodenpapier beschreibt detaillierte Messungen der crk- und CrkL-vermittelten Migration und Invasion menschlicher Glioblastomzellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1140px;" width="1140">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:339px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:235px;">1300 Series Class II, Type A2</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CIM plates</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>5665825001</td>
			<td>Cell invasion and migration plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Crk siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>J-010503-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CrkL siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>ID: 3522 and ID: 3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modified eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302002</td>
			<td>Culture medium used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>DPBS used to wash the cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Matrigel</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix gel</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neon electroporation system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neon transfection system 10 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001810-01</td>
			<td>siRNA for non targated control</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey CLx (Imaging system)</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Western blot imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RTCA software</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for experiment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scepter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C85360</td>
			<td>Handheld automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">U-118MG</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB15</td>
			<td>Cell lines used for experiments</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">xCELLigence RTCA DP</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>380601050</td>
			<td>Instrument used for experiment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion

Krebs entsteht durch unkontrollierte Proliferation von Zellen, die durch genetische Instabilität, Mutationen sowie Umwelt- und andere Stressfaktoren ausgelöst werden. Diese erworbenen Anomalien in komplexen, mehrschichtigen molekularen Signalnetzwerken induzieren aberrante Zellproliferation und Überleben, extrazellulären Matrixabbau und Metastasierung enferner Organe. Schätzungen zufolge werden etwa 90 % der krebsbedingten Todesfälle durch die direkten oder indirekten Auswirkungen der metastasierenden Verbreitung verursacht. Daher ist es wichtig, ein hochzuverlässiges, umfassendes System zur Charakterisierung des Verhaltens von Krebszellen bei genetischen und Umweltmanipulationen zu etablieren. Ein solches System kann ein klares Verständnis der molekularen Regulation von Krebsmetastasen und die Möglichkeit für eine erfolgreiche Entwicklung geschichteter, präziser therapeutischer Strategien vermitteln. Daher ermöglicht eine genaue Bestimmung von Krebszellverhalten wie Migration und Invasion mit Gewinn oder Verlust der Funktion der Gene(n) die Beurteilung der aggressiven Natur von Krebszellen. Das auf Derimpedanz basierende Echtzeit-Messsystem ermöglicht es Forschern, während eines ganzen Experiments kontinuierlich Daten zu erfassen und die Ergebnisse unter verschiedenen experimentellen Bedingungen sofort zu vergleichen und zu quantifizieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden erfordert diese Methode keine Fixierung, Färbung und Probenverarbeitung, um Zellen zu analysieren, die migrieren oder eindringen. Dieses Methodenpapier legt den Schwerpunkt auf detaillierte Verfahren zur Echtzeitbestimmung der Migration und Invasion von Glioblastom-Krebszellen.

Es wurde vorgeschlagen, dass Crk und CrkL sind wichtig für die Zellmigration und Invasion in verschiedenen Krebszelllinien13,17. Obwohl Crk- und CrkL-Proteine strukturell und funktional einander ähnlich sind und wesentliche überlappende Funktionen16,19,20,21spielen, haben viele Gen-Knockdown-Studien für Crk und CrkL nicht klar anges...

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Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Krebs ist eine tödliche Krankheit aufgrund seiner Fähigkeit, auf verschiedene Organe metastasieren. Die Bestimmung der Fähigkeit von Krebszellen, unter verschiedenen Behandlungsbedingungen zu wandern und einzudringen, ist entscheidend für die Beurteilung therapeutischer Strategien. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der metastasierenden Fähigkeiten einer Glioblastom-Krebszelllinie in Echtzeit dar.

Impedanzbasierte Echtzeitmessung der Krebszellmigration und -invasion

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Mit diesem Protokoll können Zellmigration und Invasion unter Echtzeitbedingungen enthüllt werden, so dass die Zellkinetik unter Verlust oder Gewinn der Genfunktion und der Medikamente bestimmt werden kann. Im Gegensatz zu anderen Methoden sind keine Färbungen, mechanische Zellschäden oder fluoreszierende Marker erforderlich. Am wichtigsten ist, dass die Echtzeit-Zellkinetik effektiv bestimmt werden kann.Wenn die U-118MG-Zelllinienkultur 70 bis 80 % Konfluenz erreicht, waschen Sie die Zellen mit PBS, bevor Sie die Zellen mit zwei Millilitern 0,5% Trypsin-EDTA behandeln. Nach 30 Sekunden bei 37 Grad Celsius, stoppen Sie die Reaktion mit 10 Milliliter frisches Kulturmedium und übertragen Sie die abgetrennten Zellen in ein 15 Milliliter konisches Rohr. Nach dem Zählen die Zellen durch Zentrifugation sammeln und das Pellet in sechsmal 10 bis fünf Zellen pro Konditionskonzentration im entsprechenden Volumen des frischen Mediums wieder aufsetzen.Übertragen Sie sechsmal 10 in die fünfte Zelle in ein Mikrozentrifugenrohr pro Zustand und fügen Sie 800 Mikroliter Dulbeccos PBS zu jedem Rohr hinzu. Nach der Zentrifugation jedes Pellet in 60 MikroliterResuspensionspuffer R und sechs Mikromolaren der siRNA von Interesse wieder aufsetzen. Mischen Sie jedes Rohr mit sanftem Klopfen, bevor Sie 10 Mikroliter Aliquots jeder Zellsuspension mit drei 10-Millisekunden-Pulsen von 350 Volt elektropoieren.Nach jeder Behandlung die elektropoierten Zellen aus jedem Zustand in einzelnen fünf Milliliter-Aliquots des frischen Kulturmediums bündeln. Dann säen Sie die Zellen in zwei 35-Millimeter-Kulturgerichte pro Zustand und legen Sie die Zellen für drei Tage in den Zellkultur-Inkubator. Legen Sie das Echtzeit-Zellanalysesystem fünf bis sechs Stunden vor der Echtzeit-Zellanalyse in den Zellkultur-Inkubator.Um einen Invasionstest einzurichten, verwenden Sie Reverse Pipetting, um 50 Mikroliter DMEM, ergänzt mit 0,1 Mikrogramm pro Milliliter extrazellulärem Matrixgel, in jeden Brunnen der oberen Kammer einer Zellinvasionsplatte zu platzieren. Unmittelbar nach der Beschichtung 30 Mikroliter der extrazellulären Matrixlösung aus jedem Brunnen entfernen und vier Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator legen. Um ein Impedanzmessprogramm einzurichten, ersetzen Sie sechs Stunden vor der Messung das Medium in allen elektroporated Zellkulturen durch ein niedriges Serummedium.Wählen Sie unter der Registerkarte Layout in der zugehörigen Impedanzmesssoftware Quadruplicate-Bohrungen für jeden biologischen Zustand aus. Legen Sie unter der Registerkarte Zeitplan einen einmaligen Basismess-Sweep-Schritt mit einem Ein-Minuten-Intervall fest, und legen Sie einen zweiten Schritt fest, um die Zellimpedanz in den jeweiligen einzelnen Wiegen für das eigentliche Experiment zu messen. Eine Stunde vor Beginn der Zellimpedanzmessung 160 Mikroliter Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, als Chemoattraktionin in die Brunnen der unteren Kammer der Zellinvasions- und Migrationsplatte geben.Um die Invasion zu messen, montieren Sie die obere Kammer mit den extrazellulären Matrix-Gel-beschichteten Brunnen. Um die Migration zu messen, verwenden Sie unbeschichtete Brunnen in der oberen Kammer. Für beide Arten von Experimenten, füllen Sie die Brunnen in der oberen Kammer mit 50 Mikroliter low serum Medium und legen Sie die Kammern in die Wiege des Systems.Klicken Sie auf die Registerkarte Nachricht in der Software, um zu ermitteln, ob alle Bohrungen von der Steuereinheit erkannt werden. Wenn die Meldung wie erwartet angezeigt wird, ist die Platte in der Wiege für das Experiment bereit. Dann legen Sie die komplett verpackten Platten in den Zellkultur-Inkubator im Echtzeit-Zellanalysesystem Wiege für eine Stunde, um die Platte an die Zellkulturbedingungen zu akklimatisieren.Während die Platten ausgeglichen sind, ernten Sie die Glioblastomzellen wie gezeigt und suspendieren Sie die Zellen aus jedem Zustand mit acht mal 10 bis fünf Zellen pro 800 Mikroliter niedriger Serummittelkonzentration. Zusätzlich legen Sie eine drei mal 10 bis die fünften Zellen in zwei Milliliter Kulturmedium für die Aussaat in einer 35-Millimeter-Schale für die nachgelagerte Western Blot-Analyse beiseite. Um den Basiswert vor der Migration zu messen, klicken Sie am Ende der Akklimatisierung auf die Schaltfläche Start in der Wiege.Nachdem die Basismessung erworben wurde, übertragen Sie die Migrations- und Invasionsplatten von ihren jeweiligen Wiegen in einen Biosicherheitsschrank. Reverse Pipetten 100 Mikroliter Zellen in quadruplicate oberen Kammerbrunnen für jeden biologischen Zustand in der entsprechenden Bohrung der Zellinvasion und Migrationsplatten, wie in der Steuereinheit der Wiege programmiert. Nach dem Aussaat die Platten im Biosicherheitsschrank 30 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren, damit sich die Zellen gleichmäßig auf dem Plattenboden absetzen können, bevor sie die Platten in ihre jeweiligen Wiegen überführen.Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" in der Wiege, um mit der Messung der Zellimpedanz zu beginnen. Um die Änderungen der Zellimpedanz als Zellindex während oder nach Abschluss des Experiments zeitabhängig zu visualisieren, öffnen Sie die Registerkarte Datenanalyse. Um die Daten für jede der jeweiligen Bedingungen einzeln oder als Mittelwerte und/oder Standardabweichungen zu visualisieren, klicken Sie auf die Optionsfelder für Durchschnitts- und Standardabweichungen.Um die Zellenindexdaten in eine Tabellenkalkulationsdatei zu exportieren, platzieren Sie den Cursor in der Mitte des Datenanalysefensters, und klicken Sie mit der rechten Maustaste. Wählen Sie im angezeigten Dialogfeld die Option Daten in Listenformat kopieren aus, und fügen Sie die Daten in eine geöffnete Kalkulationstabelle ein. Um das Experiment freizugeben, klicken Sie in jeder Wiege auf die Schaltfläche Freigabe.Crk Adapter Protein Knockdown verringert Crk1 und Crk2 Proteinspiegel um 85% bzw. 86%, ohne Crk-ähnliche Proteinspiegel zu induzieren. Der Knockdown von Crk-like reduziert die Crk-ähnliche Proteinexpression um 85% mit leichten Reduktionen des Crk1- und Crk2-Proteinspiegels. Durch die Kombination beider siRNAs wird der Crk1-, Crk2- und Crk-ähnliche Ausdruck um über 80 % reduziert, während weder Vinculin noch Alpha-Tubulin-Expression durch eine Kombination von Crk- oder Crk-ähnlichem Knockdown beeinflusst wird.Glioblastomzellen des menschlichen Gehirns wandern entlang eines Gradienten als Reaktion auf hohe Serumkonzentrationen, die das maximale Migrationsniveau von 13 Stunden erreichen. In Crk-Knockdown-Zellen wurde die Migration zwar zunächst verzögert, aber die Zellen wanderten bis zu 23 Stunden weiter. Crk-like knockdown reduziert die Zellmigration erheblich, wobei die Glioblastom-Zelllinie ihre Migrationsfähigkeit vollständig verliert, wenn crk und Crk-like darauf hindeuten, dass Crk und Crk-like wesentliche überlappende Rollen bei der Migration von Krebszellen spielen.Wenn jedoch die Zellinvasion über mehrere Tage überwacht wird, erreichen die Crk-Knockdown-Zellen ein ähnliches maximales Maß an Zellinvasion im Vergleich zur Kontrolle von Glioblastomzellen nach 60 Stunden, wobei Crk-ähnliche Zellen ihre invasive Fähigkeit teilweise um 90 Stunden wiederherstellen und doppelte Crk-Crk-Zellen eine verminderte Fähigkeit zeigen, nach 40 Stunden einzudringen. Die Ergebnisse stützen eindeutig den Vorschlag, dass die Zellinvasion über den gesamten Zeitraum des Experiments analysiert werden sollte. Die richtige Anzahl von Zellen auszusäen und die Luftblasen zu vermeiden, während die extrazelluläre Matrix für Invasions-Assay und Saatzellen aufgezeichnet wird, sind Schlüsselpunkte für den Erfolg dieses Experiments.Nach einem ähnlichen Verfahren, aber mit E-Platten, Zellhaftung und Zellproliferation Skinetik kann bestimmt werden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Ein Modell für Perineurale Invasion in Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinom

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Forschung

Krebsforschung

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Bewertung der Zelle Invasion und Migration-Prozess: ein Vergleich des Video Mikroskop-basierte Kratzers Wunde Assay und der Boyden Kammer-Test

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Mit Hilfe der Dot-Assay, Migration der Zelle Blätter zu analysieren

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum und Plasma Kopie Nummer Erkennung mittels Real-Time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live Cell Imaging-Assays Studie Glioblastom Gehirn Tumor Stammzellen Migration und Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Eine einfache Migration/Invasion Workflow mit einer automatisierten Leben-Zelle-Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Echtzeit-Überwachung der Migration menschlicher Gliom-Zell auf Dorsalwurzel Ganglion Axon-Oligodendrozyten-Ko-Kulturen

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...