Name: impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion
Uploaded: 2020-04-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion at JoVE.com

Olivia Funk'a gerçek zamanlı hücre analiz sistemi verilerine yaptığı teknik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Bu el yazması düzenleme için Çocuk Mercy Kansas City Tıp Yazma Merkezi teşekkür ederiz. Bu çalışma Tom Keaveny Endowed Fonu Pediatrik Kanser Araştırma (TP için) ve Çocuk Mercy Hastanesi Midwest Kanser İttifakı Ortak Danışma Kurulu fon (TP) tarafından desteklenmiştir.

NOT: Tüm hücre kültürü materyalleri steril olmalı ve tüm deney steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.
1. U-118MG Glioblastoma Hücre Hattının Kültürü ve Elektroporasyonu
<ol><li>Kültür U-118MG hücre hattı 5% fetal sığır serumu (FBS) Dulbecco's Modifiye Kartal Orta (DMEM) içeren ve 37 °C nemli bir atmosferde% 5 CO2 kuluçka (kültür koşulları) içeren koruyun.</li>
	<li>Elektroporasyon için %70-80 eşzamanlı...

<ol>
	<li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+Growth+Requires+CT10+Regulator+of+Kinase+(Crk)+and+Crk-like+(CrkL).">Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Mudduluru, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Axl+receptor+tyrosine+kinase+expression+by+miR-34a+and+miR-199a/b+in+solid+cancer.">Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer.</a> Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).</li><li>Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+zinc+finger+1+induces+migration,+invasion,+and+in+vivo+metastasis+through+Axl+gene+expression+in+solid+cancer.">Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer.</a> Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).</li><li>Khalili, A. A., Ahmad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Cell+Adhesion+Studies+for+Biomedical+and+Biological+Applications.">A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).</li><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Tumor+Models:+Advantages,+Disadvantages,+Variables,+and+Selecting+the+Right+Platform.">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+xCELLigence+RTCA+Instrument+to+Measure+Cell+Adhesion.">Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion.</a> Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).</li><li>Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+xCELLigence+system+for+real-time+analysis+of+changes+in+cellular+motility+and+adhesion+in+physiological+conditions.">Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+Tyrosine+Phosphorylation+Regulates+PDGF-BB-inducible+Src+Activation+and+Breast+Tumorigenicity+and+Metastasis.">Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).</li><li>Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+method+for+detection+of+endothelial+cell+shape+change+in+real+time:+assessment+of+endothelial+barrier+function.">Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).</li><li>Collins, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+proteins+transduce+FGF+signaling+to+promote+lens+fiber+cell+elongation.">Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Fathers, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+adaptor+proteins+act+as+key+signaling+integrators+for+breast+tumorigenesis.">Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis.</a> Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).</li><li>Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+CrkL+are+required+for+cell+transformation+by+v-fos+and+v-ras.">Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras.</a> Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).</li><li>Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+adapter+proteins+promote+an+epithelial-mesenchymal-like+transition+and+are+required+for+HGF-mediated+cell+spreading+and+breakdown+of+epithelial+adherens+junctions.">Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility.">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li><li>Rodrigues, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrkI+and+CrkII+function+as+key+signaling+integrators+for+migration+and+invasion+of+cancer+cells.">CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells.</a> Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).</li><li>Feller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+family+adaptors-signalling+complex+formation+and+biological+roles.">Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles.</a> Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).</li><li>Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+and+craniofacial+defects+in+Crk-null+mice.">Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway.">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li><li>Hallock, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dok-7+regulates+neuromuscular+synapse+formation+by+recruiting+Crk+and+Crk-L.">Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L.</a> Genes &amp; Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).</li></ol>

Gerçek zamanlı hücre analiz sistemi kullanılarak hücre geçişi ve istilasının gerçek zamanlı ölçümü, tek bir zaman noktasında veri sağlayan geleneksel yöntemlere göre birden fazla, önemli avantajlara sahip basit, hızlı ve sürekli bir izleme işlemidir. Geleneksel yöntemlerde olduğu gibi, her hücre hattı gerçek zamanlı hücre analiz sistemi için her hücre hattı için en iyi duruma getirilmelidir, çünkü her hücre hattı substrat, büyüme, hücre-hücre temasları ve göç ve invaziv yete...

Kanser, farklı organlara metastaz yeteneği nedeniyle ölümcül bir hastalıktır. Kanser genotipleri ve fenotiplerinin belirlenmesi, etkili tedavi stratejilerinin anlaşılması ve tasarlanması açısından önemlidir. Onlarca yıllık kanser araştırmaları, kanser genotipleri ve fenotiplerini belirlemek için farklı yöntemlerin geliştirilmesine ve uyarlanındı. En son teknik gelişmelerden biri hücre empedansı dayalı hücre göçü ve invazyonu gerçek zamanlı ölçüm. Hücre adezyonu substratlar ve hücre-hücre temasları hücre-hücre iletişimi ve düzenlenmesi, geliştirilmesi ve dokuların bakımında önemli bir rol oynar. Hücre adezyonu anormallikleri hücre-hücre teması nın kaybına yol açar, hücre dışı matriks bozulması (ECM), ve hücreler tarafından göç ve işgal yetenekleri kazanç, hepsi farklı organlara kanser hücrelerinin metastazıkatkıda1,2. Çeşitli yöntemler hücre göçü belirlemek için kullanılabilir (yara iyileşmesi ve Boyden odası tahlilleri) ve invazyon (Matrigel-Boyden oda tahlil)3,4,5. Hücre fenotiplerini ölçmek için deneyden önce veya sonra hücrelerin floresan boya veya diğer boyalarla etiketlenmeleri gerektiğinden, bu geleneksel yöntemler yarı kantitatiftir. Buna ek olarak, bazı durumlarda hücrelerin yara bölgesine geçişini ölçmek için bir yara oluşturmak için mekanik bozulmalara ihtiyaç vardır. Ayrıca, bu mevcut yöntemler zaman alıcı, emek yoğun ve sadece bir zaman noktada sonuçları ölçmek. Buna ek olarak, bu yöntemler deneysel prosedür6sırasında tutarsız işleme nedeniyle yanlış ölçümler yapmaya eğilimlidir.
Geleneksel yöntemlerin aksine, gerçek zamanlı hücre analiz sistemi hücrelerin ön veya poststaining ve mekanik hasar gerektirmeden gerçek zamanlı hücre empedansını ölçer. Daha da önemlisi, biyolojik etkilerin zamana bağlı bir şekilde belirlenebilmeleri için bir deneyin süresi uzatılabilir. Denemenin yürütülmesi zaman etkindir ve emek yoğun değildir. Verileri analiz etmek nispeten basit ve doğrudur. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem hücre göç ve invazyonuölçmekiçin en iyi gerçek zamanlı ölçümler biridir 6,7,8,9.
Giaever ve Keese elektrotlar yüzeyinde bir hücre popülasyonunun empedans tabanlı ölçüm tanımlamak için ilk10. Gerçek zamanlı hücre analiz sistemi aynı prensipte çalışır. Her mikroplaka kuyunun alanı yaklaşık % 80 altın mikroelektrotlar bir dizi ile kaplıdır. Elektrot yüzey alanı, hücrelerin yapışması veya yayılması nedeniyle hücreler tarafından işgal edildiğinde, elektriksel empedans değişir. Bu empedans, mikro gözenekli membrana girdikten sonra elektrot yüzey alanını kaplayan hücrelerle doğru orantılı olan hücre indeksi olarak görüntülenir (bu zarın ortanca gözenek boyutu 8 μm'dir)11.
Crk ve CrkL, SH2 ve SH3 etki alanlarını içeren adaptör proteinlerdir ve sitoiskelet düzenlemesi, hücre dönüşümü, çoğalma, yapışma, epitel-mezenkimal geçiş, göç, invazyon ve metastaz gibi çeşitli hücresel fonksiyonlarda önemli rol oynayan birçok sinyal yolu 1,12,13,14,15,16,17,17 18 yaşında. Bu nedenle, kanser hücrelerinin Crk/CrkL'ye bağımlı göçmen ve invaziv yeteneklerini belirlemek önemlidir. Crk ve CrkL'nin gen nakavtı üzerine glioblastoma hücrelerinin göçmen ve invaziv yeteneklerini belirlemek için gerçek zamanlı hücre analizi yapıldı.
Bu yöntem ödevinde Crk ve CrkL aracılı göç ve insan glioblastom hücrelerinin invazyonunun ayrıntılı ölçümleri açıklanmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1140px;" width="1140">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:339px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:235px;">1300 Series Class II, Type A2</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CIM plates</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>5665825001</td>
			<td>Cell invasion and migration plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Crk siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>J-010503-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CrkL siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>ID: 3522 and ID: 3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modified eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302002</td>
			<td>Culture medium used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>DPBS used to wash the cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Matrigel</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix gel</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neon electroporation system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neon transfection system 10 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001810-01</td>
			<td>siRNA for non targated control</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey CLx (Imaging system)</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Western blot imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RTCA software</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for experiment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scepter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C85360</td>
			<td>Handheld automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">U-118MG</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB15</td>
			<td>Cell lines used for experiments</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">xCELLigence RTCA DP</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>380601050</td>
			<td>Instrument used for experiment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion

Kanser genetik istikrarsızlık, mutasyonlar ve çevresel ve diğer stres faktörleri tarafından başlatılan hücrelerin kontrolsüz çoğalması nedeniyle ortaya çıkar. Karmaşık, çok katmanlı moleküler sinyal ağlarında elde edilen bu anormallikler anormal hücre çoğalması ve sağkalım, hücre dışı matriks bozulması ve uzak organlara metastaz neden olur. Kansere bağlı ölümlerin yaklaşık %90'ının metastatik yayılmanın doğrudan veya dolaylı etkilerinden kaynaklandığı tahmin edilmektedir. Bu nedenle, genetik ve çevresel manipülasyonlar üzerine kanser hücresi davranışlarını karakterize etmek için son derece güvenilir, kapsamlı bir sistem kurmak önemlidir. Böyle bir sistem kanser metastazımoleküler düzenleme ve tabakalı, hassas tedavi stratejilerinin başarılı gelişimi için fırsat net bir anlayış verebilir. Bu nedenle, gen (ler) kazanç veya fonksiyon kaybı ile göç ve invazyon gibi kanser hücresi davranışlarının doğru belirlenmesi kanser hücrelerinin agresif doğasının değerlendirilmesini sağlar. Hücre empedansına dayalı gerçek zamanlı ölçüm sistemi, araştırmacıların tüm deney sırasında sürekli olarak veri edinmelerine ve çeşitli deneysel koşullar altında sonuçları anında karşılaştırmalarına ve ölçmelerine olanak tanır. Geleneksel yöntemlerin aksine, bu yöntem göç eden veya istila eden hücreleri analiz etmek için fiksasyon, boyama ve numune işleme gerektirmez. Bu yöntem kağıt göç ve glioblastoma kanser hücrelerinin invazyonu gerçek zamanlı belirlenmesi için ayrıntılı prosedürleri vurgulamaktadır.

Bu Crk ve CrkL farklı kanser hücre hatları13,,17hücre göçü ve invazyonu için önemli olduğu ileri sürülmüştür . Crk ve CrkL proteinleri yapısal ve işlevsel olarak birbirine benzer ve temel örtüşen fonksiyonlar oynamak rağmen16,19,20,21, Crk ve CrkL için birçok gen yıkılması çalışmaları açıkça knockdown ya...

Watch this Scientific Journal Video about Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion at JoVE.com

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Kanser, farklı organlara metastaz yeteneği nedeniyle ölümcül bir hastalıktır. Kanser hücrelerinin çeşitli tedavi koşulları altında göç ve işgal yeteneğini belirlemek terapötik stratejilerin değerlendirilmesi için çok önemlidir. Bu protokol glioblastoma kanser hücre hattının gerçek zamanlı metastatik yeteneklerini değerlendirmek için bir yöntem sunar.

Empedans tabanlı Gerçek Zamanlı Kanser Hücre Göçü ve İstilası Ölçümü

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Bu protokol kullanılarak hücre göçü ve istilası, hücre kinetiklerinin gen fonksiyonu nun ve ilaçların kaybı veya kazanımı altında belirlenmesini sağlayan gerçek zamanlı koşullar altında açıklanabilir. Diğer yöntemlerin aksine, hiçbir boyama, mekanik hücre hasarı, ya da floresan belirteçleri gerekli. En önemlisi, gerçek zamanlı hücre kinetik etkili bir şekilde belirlenebilir.U-118MG hücre hattı kültürü %70 ila %80 biraraya geldiğinde, hücreleri %0,5 tripsin-EDTA'nın iki mililitresi ile tedavi etmeden önce hücreleri PBS ile yıkayın. 37 santigrat derecede 30 saniye sonra, 10 mililitre taze kültür ortamı ile reaksiyonu durdurun ve müstakil hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Sayma sonra, santrifüj ile hücreleri toplamak ve taze orta uygun hacimde durum konsantrasyonu başına beşinci hücrelere altı kez 10 pelet resuspend.Beşinci hücrelere altı kez 10'u her koşulda bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve her tüpe 800 mikrolitre Dulbecco'nun PBS'sini ekleyin. Santrifüjden sonra, her peletin 60 mikrolitre resuspension tampon R'sinde ve siRNA'nın altı mikromonunda yeniden askıya alınması. Üç 10 milisaniyelik 1, 350 volt darbeler ile her hücre süspansiyon 10 mikrolitre aliquots elektroporating önce nazik dokunarak her tüp karıştırın.Her tedaviden sonra, taze kültür ortamının tek tek beş mililitre aliquots her durumdan elektroporated hücreleri havuz. Daha sonra hücreleri her koşulda 35 milimetrelik iki kültür yemeğine yerleştirin ve hücreleri üç gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Gerçek zamanlı hücre analizinden 5-6 saat önce, gerçek zamanlı hücre analiz sistemini hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.Bir istila teşpini ayarlamak için, hücre istilası plakasının üst haznesinin her bir kuyusuna hücre dışı matris jelin mililitrebaşına 0,1 mikrogram ile takviye edilmiş 50 mikrolitre DMEM yerleştirmek için ters pipetleme kullanın. Kaplamadan hemen sonra, her kuyudan hücre dışı matris çözeltisinin 30 mikrolitresini çıkarın ve plakayı dört saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Bir empedans ölçüm programı kurmak için, ölçümden altı saat önce, elektrohaplı hücre kültürlerinin tümlerinde ortamı düşük serum ortamıile değiştirin.İlişkili empedans ölçüm yazılımındaki Düzen sekmesi altında, her biyolojik durum için dört lü kuyuları seçin. Zamanlama sekmesinin altında, bir dakika arayla bir kerelik temel ölçüm tarama adımı ayarlayın ve gerçek deneme için ilgili tek beşikteki hücre empedansını ölçmek için ikinci bir adım ayarlayın. Hücre empedansı ölçümübaşlamadan bir saat önce, hücre istilası ve göç plakasının alt odasının kuyularına kemoattractant olarak %10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş 160 mikrolitre orta ekleyin.İstilayı ölçmek için, ekstrasellüler matris jel kaplı kuyular içeren üst oda monte. Geçişi ölçmek için, üst bölmede kaplamasız kuyular kullanın. Her iki deney türü için de üst odadaki kuyuları 50 mikrolitre düşük serum ortamıyla doldurun ve odaları sistemin beşiğine yerleştirin.Tüm kuyuların denetim birimi tarafından tanınıp tanınmadığını belirlemek için yazılımdaki İleti sekmesini tıklatın. İleti beklendiği gibi görüntülerse, beşikteki plaka deneme için hazırdır. Daha sonra hücre kültürü koşullarına uygun bir saat için gerçek zamanlı hücre analiz sistemi beşiği nde hücre kültürü kuluçka içine tamamen paketlenmiş plakalar yerleştirin.Plakalar dengelenirken, glioblastoma hücrelerini gösterildiği gibi hasat edin ve düşük serum orta konsantrasyonuna sahip 800 mikrolitredeki 5 0'dan 5'e kadar her durumdan hücreleri sekiz kez 10'a kadar yeniden askıya alın. Ayrıca, aşağı Batı leke analizi için 35 milimetrelik bir çanak tohumlama için kültür orta iki mililitre beşinci hücrelere üç kez 10 bir kenara koyun. Temel geçiş öncesi okumayı ölçmek için, alışma sonunda, beşik Başlat düğmesini tıklatın.Temel ölçüm alındıktan sonra, göç ve istila plakalarını beşiklerinden bir biyogüvenlik kabine aktarın. Ters pipet 100 mikrolitre hücre nin dört katına kadar üst hazne kuyuları her biyolojik durum için hücre istilası ve göç plakaları uygun kuyuda beşiğin kontrol ünitesinde programlanmış olarak. Tohumlamadan sonra, hücreleri kendi beşiklerine aktarmadan önce plakaları plaka alt eşit yerleşmek için izin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca biyogüvenlik kabininde plakaları tutun.Hücre empedansını ölçmeye başlamak için beşik Başlat düğmesini tıklatın. Denemenin tamamlanması sırasında veya tamamlanmasından sonra zamana bağlı bir şekilde hücre indeksi olarak hücre empedansı değişiklikleri görselleştirmek için Veri Analizi sekmesini açın. İlgili koşulların her biri için verileri tek tek veya ortalamalar ve/veya standart sapmalar olarak görselleştirmek için, ortalama ve standart sapma için seçenek kutularını tıklatın.Hücre dizini verilerini elektronik tablo dosyasına dışa aktarmak için imleci veri çözümleme penceresinin ortasına yerleştirin ve sağ tıklatın. Görünen diyalog kutusunda, verileri liste biçimi seçeneğine kopyala seçeneğini belirleyin ve verileri açık bir elektronik tabloya yapıştırın. Denemeyi serbest bırakmak için, her beşikteki Serbest Bırakma düğmesini tıklatın.Crk adaptörü protein nakavt Crk1 ve Crk2 protein düzeylerini sırasıyla% 85 ve% 86 oranında Crk benzeri protein düzeyleri indüklemeden azaltır. Crk benzeri nakavt Crk1 ve Crk2 protein düzeylerinde hafif azalmalar ile% 85 Crk benzeri protein ekspresyonu azaltır. Her iki siRNA'nın birleştirilmesi Crk1, Crk2 ve Crk benzeri ifadeyi %80'in üzerinde azaltırken, ne Vinculin ne de alfa-Tubulin ifadesi Crk veya Crk benzeri nakavtın herhangi bir kombinasyonundan etkilenmez.İnsan beyni glioblastom hücreleri 13 saat en yüksek göç seviyesine ulaşan yüksek serum konsantrasyonlarına yanıt olarak bir degrade boyunca göç ederler. Crk knockdown hücrelerinde, geçiş başlangıçta gecikmiş olsa da, hücreler 23 saate kadar göç etmeye devam etti. Crk benzeri nakavt, glioblastoma hücre hattının hem Crk hem de Crk benzeri bir şekilde yıkılması üzerine göçmenlik yeteneğini tamamen kaybetmesi ile hücre göçlerini önemli ölçüde azaltır ve crk ve Crk benzeri kanser hücresi göçünde temel örtüşen rolleri oynar.Ancak, hücre istilası birkaç gün içinde izlendiğinde, Crk knockdown hücreleri crk benzeri hücreler kısmen 90 saat ve çift Crk-Crk hücreleri 40 saat sonra işgal yeteneğini azaltılmış gösteren ile 60 saat glioblastoma hücreleri kontrol ile karşılaştırıldığında hücre invazyonu benzer bir maksimum seviyeye ulaşır. Sonuçlar, hücre istilasının deney boyunca analiz edilmesi gerektiği önerisini açıkça desteklemez. Doğru sayıda hücre tohumlama ve istila için ekstrasellüler matris kaydederken hava kabarcıkları kaçınarak ve tohum hücreleri bu deneyin başarısı için önemli noktalardır.Benzer prosedürü takip ancak e-plakalar kullanılarak hücre adezyonu ve hücre çoğalması kinetikleri belirlenebilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Baş ve Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu içinde perinöral invazyon İçin Bir Model

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Geçiş hücre yaprak analiz etmek için nokta tahlil kullanarak

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum ve plazma kopya sayı algılama gerçek zamanlı PCR kullanarak

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3-b hücre kültür sistemi istila eğitim ve Mesane kanserinde tedavi değerlendirmek için

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Dorsal Kök Ganglion Akson-Oligodendrocyte Co-Kültürler İnsan Glioma Hücre Göç Gerçek Zamanlı İzleme

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...