Name: a 3d spheroid model for glioblastoma
Uploaded: 2020-04-09T13:00:00
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Diese Arbeit wurde unterstützt von Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon ist Stipendiat des Universitätsklinikums Toulouse (CHU Toulouse).

Von allen Patienten (vom Haukeland Hospital, Bergen, Norwegen gemäß den Vorschriften der örtlichen Ethikkommission) wurde eine schriftliche Schriftliche Zustimmung eingeholt. Unser Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung unserer Institution.
1. Erzeugung von tumorsphäroiden in einheitlicher Größe
HINWEIS: Stem-ähnliche Zellen werden in neurobasalen Medium speziert, ergänzt durch B27-Ergänzung, Heparin, FGF-2, Penicillin und Str...

<ol>
	<li>Pelissier, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+dysfunction+in+mechanotransduction+impairs+differentiation+of+human+mammary+epithelial+progenitors.">Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors.</a> Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).</li><li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+spheroids:+Relevance+to+cancer+stem+cells+and+clinical+applications.">Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications.</a> Cancer Science. 108, 283-289 (2017).</li><li>Sutherland, R. 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A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+migration+and+invasion+uncoupled:+increased+migration+is+not+an+inexorable+consequence+of+epithelial-to-mesenchymal+transition.">Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).</li><li>de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Experimenter's+Guide+to+Glioblastoma+Invasion+Pathways.">An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways.</a> Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).</li><li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+invasive+proteome+of+glioblastoma+revealed+by+laser-capture+microdissection.">The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection.</a> Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029 (2019).</li></ol>

Tumor-Sphäroid-Assays sind gut geeignet, um Tumoreigenschaften wie Proliferation, Invasion und Migration sowie Zelltod und Medikamentenreaktion zu untersuchen. Krebszellen dringen in die 3D-Matrix ein und bilden einen invasiven Mikrotumor, wie in Abbildung 4B,Czu sehen ist. Während des invasiven Prozesses können Matrix-Metalloproteinasen (MMP) Matrizen, die Tumorzellen13umgeben, und MMP-Inhibitoren (z. B. GM6001 oder Rebimastat) die Zellinvasion be...

In den meisten Studien mit primären oder kommerziell erhältlichen Zelllinien werden Assays an Zellen durchgeführt, die auf Kunststoffoberflächen als Monolayer-Kulturen angebaut werden. Das Verwalten der Zellkultur in 2D stellt Nachteile dar, da sie keine in vivo 3D-Zellenumgebung imitiert. In 2D-Kulturen ist die gesamte Zelloberfläche direkt mit dem Medium in Kontakt, verändert das Zellwachstum und verändert die Verfügbarkeit von Medikamenten. Darüber hinaus löst die nichtphysiologische Kunststoffoberfläche die Zelldifferenzierung1aus. Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, wurden dreidimensionale Kulturmodelle entwickelt. Sie haben den Vorteil, die multizelluläre Architektur und Heterogenität von Tumoren2nachzuahmen, und könnten daher als relevanteres Modell für solide Tumoren betrachtet werden3. Die komplexe Morphologie von Sphäroiden trägt zur besseren Beurteilung von Medikamentendurchschlagskraft und Resistenzbei 4. Die Tumorheterogenität im Sphäroid wirkt sich auf die Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen und die Reaktion auf pharmakologische Wirkstoffe aus (Abbildung 1A). Die Diffusion von Sauerstoff wird verändert, wenn die Sphäroidgröße 300 m erreicht, was eine hypoxische Umgebung in der Mitte des Sphäroids induzieren diniert (Abbildung 1A,C). Metaboliten sind auch weniger durch die Zellschichten eindringen und kompensierenmetabolische Reaktionen stattfinden5. Wenn der Durchmesser des Sphäroids zunimmt, können nekrotische Kerne beobachtet werden, die weitere Imitieren von Eigenschaften bei vielen festen Krebsarten, einschließlich des aggressiven Hirntumorglioblastoms (GBM)6.
Mehrere 2D- oder 3D-Invasions-Assays für Glioblastom wurden in der Literatur7,8berichtet. Zweidimensionale Assays sind hauptsächlich für die Untersuchung der Invasion in einer horizontalen Ebene auf einer dünnen Matrixschicht oder in einem Boyden-Kammer-Assay9. Dreidimensionale Assays wurden mit 3D-Sphäroidkulturen mit klassischen Glioblastom-Zelllinien10beschrieben. Komplexere Varianten werden durch die Invasion von Hirnorganoiden durch Tumorsphäride in Konfrontationskulturendargestellt 11. Dennoch ist es wichtig, einen benutzerfreundlichen und reproduzierbaren Assay zu entwickeln, der jedem Labor zur Verfügung steht. Wir haben ein Protokoll entwickelt, um glioblastom-Stammzellen aus Patientenproben zu erzeugen. Die Quantifizierung dieser Assays ist leicht zu handhaben und erfordert nur Open-Access-Online-Software. Kurz gesagt, Tumorstücke werden in kleine Stücke geschnitten und enzymatisch verdaut. Einzelne Zellen, die aus der Verdauung gewonnen werden, werden in neurobasalen Medien kultiviert. Nach 4-7 Tagen bilden sich spontan Sphäroidstrukturen. Bei der intrakraniellen Implantation in Mäusemodellen bilden sie Tumore, die einen nekrotischen Kern aufweisen, der von Pseudo-Palisading-Zellen umgeben ist12. Dies ähnelt den Merkmalen von GBM-Patienten.
In diesem Artikel beschreiben wir unser Protokoll zur Herstellung von Sphäroiden aus einer bestimmten Anzahl von Zellen, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Dazu können zwei komplementäre Matrizen verwendet werden: Matrigel und Kollagen Typ I. Matrigel ist mit Wachstumsfaktoren angereichert und imitiert die für die Zellanhaftung und Migration erforderliche Säugetierbasalmembran. Auf der anderen Seite ist Kollagen Typ I, ein strukturelles Element von Stroma, die häufigste fibrilläre extrazelluläre Matrix und wird in Zellinvasions-Assays verwendet. Hierin veranschaulichen wir unser GBM Sphäroid-Modell, indem wir Migrations- und Proliferationstests durchführen. Die Analyse erfolgte nicht nur zu festen Zeitpunkten, sondern auch durch die Überwachung der Sphäroidexpansion und Zellbewegung durch Live-Bildgebung. Darüber hinaus wurde die Elektronenmikroskopie durchgeführt, um morphologische Details zu visualisieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well round-bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C, sphere dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10X</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-53-500</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Used to analyze pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 75 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10497302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Diluted in NBM for a 2% final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Used to cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I Collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d spheroid model for glioblastoma

Zweidimensionale (2D) Zellkulturen imitieren das In-vivo-Tumorwachstum nicht zufriedenstellend. Daher wurden dreidimensionale (3D) Kultursphäroidmodelle entwickelt. Diese Modelle können im Bereich der Neuroonkologie besonders wichtig sein. Tatsächlich haben Hirntumoren die Tendenz, in die gesunde Gehirnumgebung einzudringen. Wir beschreiben hierin einen idealen 3D-Glioblastom-Sphäroid-basierten Assay, den wir entwickelt haben, um Tumorinvasionen zu untersuchen. Wir stellen ihnen alle technischen Details und Analysewerkzeuge zur Verfügung, um diesen Test erfolgreich durchzuführen.

Sphäroide wurden wie im Protokollabschnitt beschrieben vorbereitet und Beobachtungen in Bezug auf Migration, Invasion, Proliferation und Mikroskopie gemacht. Zur Messung der Hypoxie in verschiedenen Bereichen der sphärischen Struktur wurde zur Bestimmung der hypoxischen Aktivität die karboxische Anhydrase IX-Färbung verwendet (Abbildung 1A-C). Weitere CAIX-positive Zellen wurden im Sphäroidzentrum beobachtet (Abbildu...

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A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Hier beschreiben wir einen einfach zu bedienenden Invasionstest für Glioblastom. Dieser Test eignet sich für glioblastom-Stammzellen. Ein Fidschi-Makro zur einfachen Quantifizierung von Invasion, Migration und Proliferation wird ebenfalls beschrieben.

Ein 3D Spheroid Modell für Glioblastom

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Zweidimensionale Zellkulturen imitieren das In-vivo-Tumorwachstum nicht ausreichend. Zur Verbesserung wurden 3D-Verfahren mit Sphäroiden entwickelt. Unser 3D-Glioblastom-Sphäroid-basierter Assay eignet sich besonders gut, um die Invasion von Hirntumoren in die gesunde Hirntumorumgebung zu untersuchen.Dreidimensionale Kulturmodelle können verwendet werden, um eine multizelluläre Architektur, Heterogenität und metabolischen Zustand von Tumoren zu rekapitulieren, was eine strengere Bewertung der Arzneimittelwirkungen ermöglicht. Achten Sie darauf, nicht den Boden des Brunnens zu berühren oder den Überstand vollständig zu entfernen, um das Gel auf Eis zu halten, und die Zellen schnell zum Gel hinzuzufügen. Um einheitlich große Tumorsphäride zu erzeugen, waschen Sie zunächst die Tumorzellkultur von Interesse mit fünf MilliliterPBS und behandeln die Zellen mit 0,5 bis einem Milliliter Dissoziationsenzym.Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius die Reaktion mit vier bis 4,5 Milliliter PBS stoppen und die abgetrennten Zellen in ein 15 Milliliter konisches Rohr mit 10 Millilitern komplettem Wachstumsmedium übertragen. Nach dem Zählen die Zellen um ein mal 10 bis sechs Milliliter komplettes Wachstumsmedium, ergänzt um zwei Milliliter 2%Methylcellulose-Konzentration, wieder aussetzen und die Suspension in einen sterilen Systembehälter übertragen. Dann fügen Sie 100 Mikroliter Zellen zu jedem Brunnen einer 96-gut runden Bodenplatte und legen Sie die Platte in einem 37 Grad Celsius 5%Kohlendioxid-Inkubator für drei bis vier Tage.Um einen Invasionstest durchzuführen, wenn die Tumorzellen gleichmäßig große Sphäroide gebildet haben, übertragen Sie jede Zellstruktur in ein 500-Mikroliter-Rohr und waschen Die Sphäroide einmal mit 200 Mikroliter PBS. Nach dem zweiten Waschen die Sphäroide vorsichtig in 100 Mikroliter frisch zubereitete Kollagenmatrix geben und jede Sphäroidsuspension in die Mitte jedes Brunnens einer flachen 96-Well-Platte geben. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius, fügen Sie 100 Mikroliter komplettes Wachstumsmedium auf dem Gel in jedem Brunnen.Achten Sie darauf, alle Sphäroide in der Mitte jedes Brunnens für die beste Bildgebung der Tumorzellinvasion zu platzieren. Um einen Migrationstest durchzuführen, wenn die Tumorzellen gleichmäßig große Sphäroide gebildet haben, beschichten Sie eine Sechs-Well-Platte mit 0,2 Milligramm pro Milliliter Matrigel im Wachstumsmedium für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation entfernen Sie das Matrigel und fügen Sie jedem Brunnen zwei Milliliter komplettes Wachstumsmedium hinzu.Die Sphäroide von der runden Bodenplatte in 50 Mikroliter Volumen in einzelne Brunnen der Sechs-Brunnen-Platte übertragen und 24 Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator legen. Am nächsten Tag färben Sie die Sphäroide mit 10 Nanogramm pro Milliliter Hoechst für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Zur Bildaufnahme nach einer Invasion oder Migrationsuntersuchung legen Sie die Platte auf die Bühne eines Brightfield Konfokalmikroskops, das mit einer Videokamera ausgestattet ist, und erhalten Sie Bilder über den entsprechenden Versuchszeitraum.Um die Bilder halbautomatisch zu analysieren, importieren Sie die Bilder nach Fidschi und klicken Sie auf Plugins, Makros, Interaktiver Interpreter. Kopieren und fügen Sie die angepasste violette Schleife ein. Halten Sie die violetten Sätze und fügen Sie die grünen Sätze von Interesse nach Bedarf.Klicken Sie dann auf Analysieren und Messen, um die Fläche jedes Sphäroids zu messen. Um Hypoxie in verschiedenen Bereichen der sphärischen Struktur zu messen, kann Kohlensäure-Anhydrase-IX-Färbung verwendet werden, um die hypoxische Aktivität zu bestimmen. In dieser repräsentativen Analyse wurden weitere kohlensäurehaltige Anhydrase IX-positive Zellen im Sphäroidzentrum beobachtet.Hypoxische Zellen im Sphäroidkern neigen dazu, glykolytischer zu sein als die Zellen, die den Kern umgeben. Mitochondrien können durch Elektronenmikroskopie zur weiteren Analyse abgebildet werden. Der Sphäroiddurchmesser steht in direktem Zusammenhang mit der Dichte der Zellen, aus denen die 3D-Zellstruktur besteht, und Fidschi-Makros können verwendet werden, um die Proliferation, Invasion oder Migration der Zellen innerhalb jedes Sphäroids oder die Migration der Zellen innerhalb jedes Sphäroids zu quantifizieren.Erhöhungen des Sphäroidkerns spiegeln die Stimulation der Zellproliferation wider. Nach der Hemmung des Komplexes I der mitochondrialen Atmungskette wird die überwiegende Mehrheit der ATP-Produktion in den Mitochondrien beeinträchtigt, wodurch die Proliferation nach 72 Stunden um 20 % reduziert wird. Die Behandlung von Chlorwasserstoff verbessert die Kollagen-Invasion Typ I über einen Zeitraum von 24 Stunden, reduziert aber den Migrationsbereich der Sphäroide 1,5-fach im Vergleich zu unbehandelten Sphäroiden.Wie durch Live-Bildgebung beurteilt, zeigen die Sphäroide eine hohe innere Dynamik und bewegen sich schnell. Die Größe der Sphäroide sollte relativ gleichmäßig sein und darauf geachtet werden, die Sphäroide in der Mitte der Brunnen zu manipulieren, um die besten Bildergebnisse zu erzielen. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die Proliferation von Tumorzellen, Migration und Tod sowie die Expression von extrazellulären Matrix, Zellrezeptoren oder intrazellulären Proteinen von Interesse zu untersuchen.Die Sphäroide können auch verkapselt werden und die Wirkung einer erhöhten Zelloberflächenspannung kann bei Entfernung der Kapseln untersucht werden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Forschung

Krebsforschung

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET und MRT geführte Bestrahlung von einem Glioblastom Rattenmodell mit einer Mikro-Moorpackung

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Therapie, die Tests in einem Sphäroid-basierten 3D Kultur Zellmodell für Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für die In-Vivo Bildgebung des Glioblastoms Xenotransplantate

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Ein 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identifikation, histologische Charakterisierung und Dissektion der Maus Prostata Lappen für In-vitro-3D Sphäroid Kultur Modelle

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Ein Sphäroid Tötung Assay von Auto-T-Zellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroidkulturen von Krebszellen

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Charakterisierung der Auswirkungen von Migrastatischen Inhibitoren auf die 3D-Tumorsphäroid-Invasion durch hochauflösende Konfokalmikroskopie

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...