Name: a 3d spheroid model for glioblastoma
Uploaded: 2020-04-09T13:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon è un ricevente di borsa di studio presso l'Ospedale Universitario di Tolosa (CHU Tolosa).

Il consenso scritto informato è stato ottenuto da tutti i pazienti (dall'Ospedale Haukeland, Bergen, Norvegia secondo i regolamenti del comitato etico locale). Il nostro protocollo segue le linee guida del comitato etico della ricerca umana della nostra istituzione.
1. Generazione di sferoidi tumorali di dimensioni uniformi
NOTA: Le cellule staminali sono coltivate in mezzi neurobasali completati con supplemento B27, eparina, FGF-2, penicillina e streptomicina, come ...

<ol>
	<li>Pelissier, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+dysfunction+in+mechanotransduction+impairs+differentiation+of+human+mammary+epithelial+progenitors.">Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors.</a> Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).</li><li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+spheroids:+Relevance+to+cancer+stem+cells+and+clinical+applications.">Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications.</a> Cancer Science. 108, 283-289 (2017).</li><li>Sutherland, R. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+SPARC+expression+promotes+U87+glioblastoma+invasion+in+vitro.">Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).</li><li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development.">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146 (2019).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+travel:+the+role+of+proteases+in+individual+and+collective+cancer+cell+invasion.">Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion.</a> Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).</li><li>Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP+proteolytic+activity+regulates+cancer+invasiveness+by+modulating+integrins.">MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins.</a> Scientific Reports. 7, 14219 (2017).</li><li>Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+migration+and+invasion+uncoupled:+increased+migration+is+not+an+inexorable+consequence+of+epithelial-to-mesenchymal+transition.">Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).</li><li>de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Experimenter's+Guide+to+Glioblastoma+Invasion+Pathways.">An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways.</a> Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).</li><li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+invasive+proteome+of+glioblastoma+revealed+by+laser-capture+microdissection.">The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection.</a> Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029 (2019).</li></ol>

I saggi dello sferoide tumorale sono ben adattati per studiare le caratteristiche tumorali tra cui la proliferazione, l'invasione e la migrazione, così come la morte cellulare e la risposta ai farmaci. Le cellule tumorali invadono la matrice 3D formando un microtumore invasivo, come si vede nella Figura 4B,C. Durante il processo invasivo, matrici digeriste digeriscono matrici digerite a matrice (MMP) che circondano le cellule tumorali13e gli inibitor...

Nella maggior parte degli studi che utilizzano linee cellulari primarie o disponibili in commercio, i saggi vengono eseguiti su cellule coltivate su superfici plastiche come colture monostratori. La gestione della coltura cellulare in 2D rappresenta uno svantaggio, in quanto non imita un ambiente cellulare 3D in vivo. Nelle colture 2D, l'intera superficie cellulare è direttamente in contatto con il mezzo, alterando la crescita cellulare e modificando la disponibilità di farmaci. Inoltre, la superficie plastica non fisiologica innesca la differenziazione cellulare1. Sono stati sviluppati modelli di coltura tridimensionali per superare queste difficoltà. Hanno il vantaggio di imitare l'architettura multicellulare e l'eterogeneità dei tumori2, e quindi potrebbe essere considerato un modello più rilevante per i tumori solidi3. La complessa morfologia degli sferoidi contribuisce a valutare meglio la penetrazione e la resistenza dei farmaci4. L'eterogeneità tumorale nello sferoide influisce sulla diffusione di ossigeno e sostanze nutritive e la risposta agli agenti farmacologici (Figura 1A). La diffusione dell'ossigeno viene alterata quando la dimensione dello sferoide raggiunge i 300 m, inducendo un ambiente ipossico al centro dello sferoide (Figura 1A,C). I metaboliti sono anche meno penetranti attraverso gli strati cellulari e compensando le reazioni metaboliche avvengono5. Quando il diametro dello sferoide aumenta, i nuclei necrotici possono essere osservati, imitando ulteriormente le caratteristiche che si trovano in molti tipi di cancro solido, tra cui il cancro al cervello aggressivo glioblastoma (GBM)6.
Diversi saggi di invasione 2D o 3D per il glioblastoma sono stati riportati nella letteratura7,8. I saggi bidimensionali sono principalmente per studiare l'invasione in un piano orizzontale su uno strato sottile di matrice o in un assaggio della camera di Boyden9. I saggi tridimensionali sono stati descritti con colture di sferoidi 3D utilizzando classiche linee cellulari glioblastoma10. Varianti più complesse sono rappresentate dall'invasione degli organoidi cerebrali da parte di sferoidi tumorali nelle colture di confronto11. Tuttavia, è ancora importante sviluppare un saggio facile da usare e riproducibile a disposizione di qualsiasi laboratorio. Abbiamo sviluppato un protocollo per generare cellule staminali del glioblastoma da campioni di pazienti. La quantificazione di questi saggi è facilmente gestibile e richiede solo software online ad accesso aperto. In breve, i pezzi tumorali vengono tagliati in piccoli pezzi e eviticamente digeriti. Le cellule singole derivate dalla digestione sono coltivate nel mezzo neurobasale. Dopo 4-7 giorni, le strutture sferoidi si formano spontaneamente. Al momento dell'impianto intracranico nei modelli di topi, formano tumori che presentano un nucleo necrotico circondato da cellule pseudo-palizzate12. Questo è molto simile alle caratteristiche che si trovano nei pazienti GBM.
In questo articolo, descriviamo il nostro protocollo per produrre sferoidi da un determinato numero di cellule per garantire la riproducibilità. A questo scopo possono essere utilizzate due matrici complementari: Matrigel e collagene di tipo I. Matrigel è arricchito in fattori di crescita e imita la membrana basale dei mammiferi necessaria per l'attaccamento cellulare e la migrazione. D'altra parte, il collagene I, un elemento strutturale dello stroma, è la matrice extracellulare fibrillare più comune ed è usato nei saggi di invasione cellulare. Qui illustriamo il nostro modello di sferoide GBM eseguendo analisi su migrazione e proliferazione. L'analisi è stata effettuata non solo in momenti fissi, ma anche monitorando l'espansione degli sferoidi e il movimento cellulare mediante imaging dal vivo. Inoltre, la microscopia elettronica è stata fatta per visualizzare i dettagli morfologici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well round-bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C, sphere dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, defrost before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10X</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P04-53-500</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Used to analyze pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 75 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10497302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td>Diluted in NBM for a 2% final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Used to cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I Collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d spheroid model for glioblastoma

Le colture cellulari bidimensionali (2D) non imitano la crescita del tumore in vivo in modo soddisfacente. Pertanto, sono stati sviluppati modelli di sferoidcoltura tridimensionale (3D). Questi modelli possono essere particolarmente importanti nel campo della neuro-oncologia. Infatti, i tumori cerebrali hanno la tendenza a invadere l'ambiente cerebrale sano. Descriviamo qui in un saggio ideale basato sul glioblastoma sferoide 3D che abbiamo sviluppato per studiare l'invasione tumorale. Forniamo tutti i dettagli tecnici e gli strumenti analitici per eseguire con successo questo saggio.

Gli sferoidi sono stati preparati come descritto nella sezione protocolli e sono state fatte osservazioni riguardanti la migrazione, l'invasione, la proliferazione e la microscopia. Per misurare l'ipossia in aree distinte della struttura sferica, l'colorazione iX di anidera carboxica è stata utilizzata per determinare l'attività ipossica (Figura 1A-C). Sono state osservate più cellule CAIX-positive nel centro sferoide (<strong class="xfig"...

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A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Qui, descriviamo un assaggio di invasione facile da usare per il glioblastoma. Questo test è adatto per cellule staminali del glioblastoma. Viene descritta anche una macro Fiji per una facile quantificazione dell'invasione, della migrazione e della proliferazione.

Un modello spheroid 3D per Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Le colture cellulari bidimensionali non imitano adeguatamente la crescita tumorale in vivo. Per migliorare, le procedure 3D sono state sviluppate utilizzando sferoidi. Il nostro test 3D a base di glioblastoma sferoide è particolarmente adatto per indagare l'invasione del tumore al cervello nell'ambiente tumorale cerebrale sano.I modelli di coltura tridimensionale possono essere utilizzati per ricapitolare un'architettura multicellulare, l'eterogeneità e lo stato metabolico dei tumori consentendo una valutazione più rigorosa degli effetti farmacologici. Assicurati di non toccare il fondo del pozzo o di rimuovere completamente il supernatante, di mantenere il gel sul ghiaccio e di aggiungere rapidamente le cellule al gel. Per generare sferoidi tumorali di dimensioni uniformi, lavare prima la coltura cellulare tumorale di interesse con cinque millilitri di PBS e trattare le cellule con 0,5 a un millilitro di enzima dissociazione.Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, interrompere la reazione con quattro-4,5 millilitri di PBS e trasferire le cellule staccate in un tubo conico da 15 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo di crescita completo. Dopo il conteggio, rimorsi le cellule a una volta 10 alla sesta cella per otto millilitri di mezzo di crescita completo integrato con due millilitri di concentrazione di metilcellulosa al 2% e trasferire la sospensione in un contenitore di sistema sterile. Quindi aggiungere 100 microlitri di cellule a ciascun pozzo di una piastra inferiore rotonda da 96 po 'e posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica del 5% di 37 gradi Celsius per tre o quattro giorni.Per eseguire un saggio di invasione, quando le cellule tumorali hanno formato sferoidi di dimensioni uniformi, trasferire ogni struttura cellulare in un tubo di 500 microlitri e lavare gli sferoidi una volta con 200 microlitri di PBS. Dopo il secondo lavaggio, trasferire accuratamente gli sferoidi in 100 microlitri di matrice di collagene preparata al momento e aggiungere ogni sospensione sferoide al centro di ogni pozzo di una piastra piatta a 96 poggiasaggio. Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere 100 microlitri di mezzo di crescita completo sopra il gel in ogni pozzo.Assicurati di posizionare tutti gli sferoidi al centro di ogni pozzo per la migliore imaging dell'invasione delle cellule tumorali. Per eseguire un saggio di migrazione, quando le cellule tumorali si sono formate sferoidi di dimensioni uniformi, rivestire una piastra a sei pozzetti con 0,2 milligrammi per millilitro di Matrigel nel mezzo di crescita per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, rimuovere il Matrigel e aggiungere due millilitri di mezzo di crescita completo ad ogni pozzo.Trasferire gli sferoidi dalla piastra inferiore rotonda in 50 volumi di microliter in singoli pozzi della piastra a sei pozzetti e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per 24 ore. Il giorno dopo, macchiare gli sferoidi con 10 nanogrammi per millilitro di Hoechst per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Per l'acquisizione di immagini dopo un test di invasione o migrazione, posizionare la lastra sul palco di un microscopio confocale Brightfield dotato di una videocamera e ottenere immagini durante l'appropriato periodo sperimentale.Per analizzare le immagini in modo semi-automatizzato, importare le immagini nelle Fiji e fare clic su Plugin, Macro, Interprete interattivo. Copiare e incollare il ciclo viola adattato. Mantieni le frasi viola e aggiungi le frasi verdi di interesse se necessario.Quindi, per misurare l'area di ogni sferoide, fare clic su Analizza e misura. Per misurare l'ipossia in aree distinte della struttura sferica, la colorazione carbonica anidrasi IX può essere usata per determinare l'attività ipossica. In questa analisi rappresentativa, nel centro dello sferoide sono state osservate cellule positive più carboniche dell'anidrasi IX.Le cellule ipossiche situate nel nucleo dello sferoide tendono ad essere più glicolitiche delle cellule che circondano il nucleo. I mitocondri possono essere immagini mediante microscopia elettronica per ulteriori analisi. Il diametro dello sferoide è direttamente correlato alla densità delle cellule che compongono la struttura cellulare 3D e le macro delle Fiji possono essere utilizzate per quantificare la proliferazione, l'invasione o la migrazione delle cellule all'interno di ogni sferoide o migrazione delle cellule all'interno di ogni sferoide.Gli aumenti del nucleo dello sferoide riflettono la stimolazione della proliferazione cellulare. Dopo l'inibizione del complesso I della catena respiratoria mitocondriale, la stragrande maggioranza della produzione di ATP nei mitocondri è compromessa riducendo la proliferazione del 20% dopo 72 ore. Il trattamento con cloruro di idrogeno migliora l'invasione del collagene di tipo I per un periodo di 24 ore, ma riduce l'area migratoria degli sferoidi di 1,5 volte rispetto agli sferoidi non trattati.Come valutato dall'imaging dal vivo, gli sferoidi dimostrano un'alta dinamica interna e si muovono rapidamente. La dimensione degli sferoidi dovrebbe essere relativamente uniforme e si dovrebbe fare attenzione a manipolare gli sferoidi al centro dei pozzi per ottenere i migliori risultati di imaging. Questo metodo può anche essere utilizzato per indagare la proliferazione, la migrazione e la morte delle cellule tumorali, nonché l'espressione di matrice extracellulare, recettori cellulari o proteine intracellulari di interesse.Anche gli sferoidi possono essere incapsulati e l'effetto dell'aumento della tensione superficiale cellulare può essere studiato al momento della rimozione delle capsule.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture saggi per studiare macrofagi e microglia stimolazione del glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

PET and MRI Guided Irradiation of a Glioblastoma Rat Model Using a Micro-irradiator

PET e MRI guidate irradiazione di un modello del ratto di Glioblastoma utilizzando un Micro-irradiatore

For decades, small animal radiation research was mostly performed using fairly crude experimental setups applying simple single-beam techniques without ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapia test in un modello di coltura cellulare 3D basati su sferoide per testa e collo a cellule squamose

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescenza tomografia molecolare per l'Imaging In Vivo di Glioblastoma xenotrapianti

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Un modello di pelle sferoide 3D Organotypic Melanoma

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identificazione, caratterizzazione istologica e dissezione dei lobi della prostata Mouse per In Vitro sferoide 3D modelli di coltura

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Un'analisi di uccisione di sferoide dalle cellule di T di auto

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Valutare la vitalità cellulare e la morte nelle colture di sferoidi 3D delle cellule tumorali

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caratterizzazione degli effetti degli inibitori espastatici sull'invasione 3D dello spheroid del tumore mediante microscopia confocale ad alta risoluzione

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...