Name: measurements of physiological stress responses in c. elegans
Uploaded: 2020-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

R.BZ، R.BZ، مدعومة من قبل زمالة EMBO على المدى الطويل ومؤسسة لاري إل هيلبلوم. يتم دعم R.H.S من خلال منحة 5F32AG032023-02 من خلال المعهد الوطني للشيخوخة (NIA) ومؤسسة جلين للبحوث الطبية زمالة ما بعد الدكتوراه. ويدعم A.F. من قبل منحة F32AG051355 من خلال NIA. يتم دعم H.K.G. من خلال منحة DGE1752814 من خلال برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا للمؤسسة الوطنية للعلوم. يتم دعم M.G.M. من قبل 1F31AG060660-01 من خلال NIA. يتم دعم A.D. من قبل مؤسسة توماس وستايسي سيبل، ومعهد هوارد هيوز الطبي، و4R01AG042679-04 و 5R01AG055891-02 من NIA، و 5R01ES021667-09 من NIEHS. نشكر لاري جو، ميليسا سانشيز، نامكيت، وأنيل إسكيفل على المساعدة التقنية الكبيرة. نشكر مختبر موريموتو وCGC (بتمويل من مكتب المعاهد القومية للصحة لبرنامج البنية التحتية للبحوث P40 OD010440) على السلالات.

1. ظروف النمو القياسية لدرجات الحرارة وOP50 مقابل HT115
<ol><li>النمو القياسي والتوسع<ol>
<li>تنمو ثقافة OP50 في LB(الجدول 1)أو ما يعادلها وسائل الإعلام المفضلة ل24-48 ساعة في درجة الحرارة المحيطة (~ 22-25 درجة مئوية). تنمو البكتيريا في درجة حرارة الغرفة كما OP50 هو auxotroph uracil وهناك ارتفاع معدل عودة (على س...

هنا ، يتم وصف طرق استجواب استجابات الإجهاد الخلوي في C. elegans، وذلك باستخدام المراسلين النسخ الفلوري ومقالات البقاء على قيد الحياة الإجهاد الفسيولوجي. يستخدم جميع المراسلين تعبير GFP مدفوعًا تحت مروج هدف النسخ التنازلي لعوامل النسخ المشاركة في استجابات الإجهاد الخلوي المتصاعدة. استخدا...

إن قدرة الكائن الحي على الاستجابة للتغيرات في البيئة داخل الخلايا وداخلها أمر بالغ الأهمية لبقائه والتكيف معه. ويتم ذلك على المستوى الخلوي من خلال العديد من المسارات الوقائية التي تضمن سلامة الخلية. في حين أن العديد من المكونات الخلوية تخضع للضرر المرتبط بالإجهاد ، فإن إحدى المشاركات الرئيسية لاستجابات الإجهاد الخلوي هي إصلاح وحماية التوازن في البروتيوم الخلوي. ومع ذلك ، فإن تقسيم البروتينات إلى هياكل خاصة ، تسمى العضيات ، يشكل تحديًا للخلية ، حيث لا يمكنها الاعتماد على شكل مركزي واحد من مراقبة جودة البروتين لضمان طي جميع البروتينات داخل الخلية بشكل صحيح ووظيفية. لذلك ، للتعامل مع الاضطرابات في بروتيناتها ، طورت العضيات آليات مخصصة لمراقبة الجودة ، والتي يمكن أن تشعر بالبروتينات المطوية وتنشط استجابة الإجهاد في محاولة لتخفيف التوتر داخل تلك المقصورة. على سبيل المثال، يعتمد السيتوسول على استجابة الصدمات الحرارية (HSR)، في حين يعتمد التتشني الإندوسليعلى الإندوبلازمي (ER) والميتوكوندريا على استجابات البروتين المتكشفة الخاصة بالمقصورة (UPR). يعمل OxSR على تخفيف الآثار السامة لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). يتم تشغيل كل استجابة الإجهاد في وجود تحديات الخلوية والشتائم البيئية ويحفز استجابة النسخ مصممة خصيصا. وتشمل السمات المميزة لهذه الاستجابات توليف الجزيئات التي تعيد طي البروتينات المطوية (مثل المرافقين) التي تستهدف العضية المناسبة، أو بدلا ً من ذلك، إزالة البروتينات التالفة بسبب تدهور البروتين. الفشل في تنشيط هذه الاستجابات الإجهاد يؤدي إلى تراكم البروتينات التالفة، والخلل الخلوي نشرها إلى فشل الجهازية من الأنسجة، والموت في نهاية المطاف من الكائن الحي. يتم مراجعة وظيفة وتنظيم استجابات الإجهاد المختلفة في مكان آخر1.
وقد نسبت العديد من الأفكار المتعلقة بتنظيم ونشاط استجابات الإجهاد الخلوي إلى النيماتودا، Caenorhabditis elegans،وهو كائن حي نموذج متعدد الخلايا في البحوث الوراثية. الديدان الخيطية لا تسمح فقط دراسة تفعيل استجابات الإجهاد على المستوى الخلوي، ولكن أيضا على مستوى الكائن الحي. وقد استخدمت الديدان الخيطية لدراسة آثار الاضطرابات الوراثية أو التعرض للأدوية والملوثات على نموها وبقائها. فوقت الجيل السريع، والايزوجيني، والشفافية، وقابلية القابلية للاستبصاء الوراثي، وسهولة الاستخدام أثناء التجريب تجعلها مثالية لمثل هذه الدراسات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاستجابة الفسيولوجية السريعة نسبيًا للإجهاد (بين ساعات وبضعة أيام) والحفاظ التطوري على المسارات الخلوية تجعل الديدان الخيطية أداة بارزة في دراسة مقاومة الإجهاد.
هناك نوعان من سلالات القولونية شائعة الاستخدام المستخدمة كمصدر غذائي لزراعة C. elegans: OP50 القياسية ، وهي سلالة B التي تم تنفيذ معظم التجارب تاريخيا2 و HT115 ، سلالة K - 12 التي تستخدم تقريبا لجميع تجارب RNAI3،4. من المهم أن نلاحظ أن هناك اختلافات كبيرة بين OP50 وHT115 الوجبات الغذائية البكتيرية. وقد ثبت أن النمو على هذه المصادر البكتيرية المختلفة يسبب اختلافات كبيرة في التشكيل الجانبي الأيضي ، وعدد نسخة الحمض النووي الميتوكوندريا ، والعديد من الأنماط الظاهرية الرئيسية ، بما في ذلك عمر5. وتعزى بعض هذه الاختلافات إلى نقص فيتامين B12 المرتبطة بالنمو على بكتيريا OP50, التي يمكن أن تؤدي إلى عيوب في التوازن الميتوكوندريا وزيادة الحساسية لمسببات الأمراض والضغوط. وقد ثبت أن جميع هذه الأنماط الظاهرية خففت من النمو على البكتيريا HT115, التي لديها مستويات أعلى من فيتامين B126. لذلك ، يوصى بإجراء جميع التجارب على استجابات الإجهاد الفسيولوجي على بكتيريا HT115 ، بغض النظر عن ضرورة ظروف RNAi. ومع ذلك ، نظرا لسهولة الحفاظ على الحيوانات على OP50 ، يمكن إجراء جميع النمو القياسي (أي صيانة وتضخيم الحيوانات) على OP50 ، حيث لم يتم اكتشاف اختلافات كبيرة في النماذج التجريبية الموصوفة هنا في الديدان التي يتم الحفاظ عليها على OP50 طالما تم نقلها إلى مزامنة HT115 بعد (أي من فتحة ما بعد التبييض مع أو بدون L1 الاعتقال) حتى التجريب.
هنا ، وصف توصيف نشاط استجابات الإجهاد الخلوي باستخدام طريقتين وظيفيتين. تجدر الإشارة إلى أن البروتوكولات المعروضة تركز في المقام الأول على استجابات الإجهاد الخلوي وتأثيرها على التوازن البروتيني. أولاً، يتم استخدام المراسلين الفلوريين النسخي، والتي يتم تنظيمها من قبل مروجي الجينات الذاتية التي يتم تنشيطها على وجه التحديد استجابة لضغوط خلوية مختلفة. ويستند هؤلاء المراسلين النسخ الفلوري ة على الحث النسخي لجينات محددة التي هي في الأصل جزء من استجابة الإجهاد. على سبيل المثال، يتم تنشيط HSP-4، وهو بروتين صدمة حرارية تقويم العظام إلى hSPA5/BiP المرافق البشري، على ER-stress وlocalizes إلى ER لتخفيف التوتر. في ظروف الإجهاد ER (على سبيل المثال، التعرض لتونيمايسين)، يتم تصنيع بروتين فلورسنت أخضر (GFP)، وضعت تحت تنظيم المروج hsp-4، في مستويات عالية كما يمكن تقييمها عن طريق المجهر الفلورسنت أو قياسها كميا باستخدام قياس خلايا تدفق الجسيمات الكبيرة من النيماتودا7. وبالمثل، يستخدم المروج للمرافق الميتوكوندريا، hsp-6 (orthologous لالثدييات HSPA9)، لرصد تفعيلMT8الاستعراض الدوري الشامل ، ويستخدم المروج للsperone ssp-16.2 (orthologous لجينات ألفا البلورية البشرية) لتقييم نشاط HSR9. ويسمح هؤلاء المراسلون بتوصيف سريع للمسارات التي يتم تفعيلها استجابة لمختلف الاضطرابات.
في كثير من الأحيان ، يتم تصوير المراسلين المعروضين هنا باستخدام المجهر ، والذي يوفر إخراجًا نوعيًا لتفعيل استجابات الإجهاد. ومع ذلك، في حين توفر تقنيات التصوير معلومات عن كثافة المراسلين المذكورين أعلاه وموقع نسيجهم، فإن قياسها الكمي ليس دائماً دقيقاً أو قوياً. في حين أنه من الممكن قياس تنشيط الفلورسنت باستخدام أدوات تحليل التصوير ، فإن هذه الطرق منخفضة الإنتاجية نسبيًا وحجم العينة صغير ، نظرًا للعدد المنخفض نسبيًا من الحيوانات المصوّرة. سهولة والقدرة على الحصول على كميات كبيرة من الحيوانات بسرعة جعل C. elegans نظام نموذج مثالي لقياس تفعيل المراسلين الإجهاد الفلورسنت من خلال استخدام مقياس تدفق الجسيمات الكبيرة. مقياس تدفق الجسيمات الكبيرة قادر على التسجيل والتحليل والفرز استنادًا إلى الحجم والفلورسال من العديد من الحيوانات الحية. باستخدام هذه الطريقة ، من الممكن الحصول على كثافة الفلورسنت ، وحجمها ، وكذلك المعلومات المكانية (2D) لآلاف الديدان. يتم التحكم في النظام باستخدام FlowPilot ، والذي يسمح بالحصول على البيانات في الوقت الحقيقي وتحليل المعلمات المقاسة. هنا ، يتم تقديم طرق لكل من التصوير المجهري والتحليل الكمي باستخدام مقياس تدفق الجسيمات الكبيرة كطرق لقياس تنشيط استجابات الإجهاد.
أبعد من تحليل المراسل ، يمكن قياس حساسية أو مقاومة الحيوانات للإجهاد باستخدام مقيس الإجهاد الفسيولوجي. ويتحقق ذلك من خلال تعريض الحيوانات لبيئات مجهدة تنشط مسارات إجهاد خلوي محددة. هنا ، يتم توفير العديد من الطرق لقياس حساسية الحيوانات بأكملها لأنواع محددة من الضغوطات.
يتم تطبيق الإجهاد ER إلى C. elegans باستخدام العامل الكيميائي, tunicamycin, الذي يمنع N المرتبطة glycosylation, مما تسبب في تراكم البروتينات أضعاف في ER10. في C. elegans, النمو عند التعرض لتونيماشين النتائج في اضطرابات كبيرة في وظيفة الطوارئ, وانخفاض كبير في عمر11. من خلال قياس بقاء الحيوانات على لوحات تحتوي على تونياميسين ، يمكن قياس حساسية الإجهاد ER للحيوانات. على سبيل المثال، الحيوانات مع الحث UPRER خارج الرحم، وبالتالي زيادة المقاومة للبروتين الإجهاد misfolding في ER لديها زيادة البقاء على قيد الحياة على التعرض تونيماشين مقارنة مع الحيوانات البرية من النوع12.
يتم تطبيق الإجهاد التأكسدي والميتوكوندريا على C. elegans عن طريق تعريض الحيوانات للعامل الكيميائي، الباراكوات. الباراكوات هو مبيد أعشاب شائع الاستخدام ، والذي يسبب تكوين أكسيد فائق على وجه التحديد في الميتوكوندريا13. نظرًا للتوطين المحدد لأنواع الأكسجين التفاعلية المشتقة من الميتوكوندريا (ROS) ، غالبًا ما تستخدم المقالات الباراكوات كقياس الإجهاد "الميتوكوندريا". ومع ذلك، يتم تحويل أكسيد فائق بسرعة إلى بيروكسيد الهيدروجين بواسطة ديزموتاس سوبر أكسيد الميتوكوندريا (SODs)14. يمكن أن ينتشر بيروكسيد الهيدروجين لاحقًا من الميتوكوندريا ويسبب الإجهاد التأكسدي في مقصورات أخرى من الخلية. لذلك ، فإننا نصف المقالات البقاء على قيد الحياة الباراكوات وقياس الحساسية لكل من الميتوكوندريا والأكسدة (يمكن العثور على غيرها من المؤكسدات المؤكسدة الكم15).
يتم تنفيذ المقالات الحرارية في C. elegans عن طريق وضع الحيوانات في درجات حرارة مرتفعة. درجات الحرارة المحيطة للنيماتودا ~ 15-20 درجة مئوية ويتم حث الإجهاد الحراري في درجات حرارة أعلى من 25 درجة مئوية16،17. يتم تنفيذ المقالات الحرارية عموما في درجات حرارة تتراوح بين 30-37 درجة مئوية، كما تظهر الحيوانات العيوب الخلوية الرئيسية في هذه الحرارة، ويتم الانتهاء من المقالات البقاء على قيد الحياة في غضون 24 ساعة16،,18. هنا، يتم توفير طريقتين بديلتين لأداء المقالات الحرارية: النمو عند 34 درجة مئوية والنمو عند 37 درجة مئوية. معا، يمكن استخدام البروتوكولات المعروضة هنا لأداء شاشات واسعة النطاق عند دمجها مع الجينات القياسية بالضربة القاضية باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي أو مكتبات الأدوية الكيميائية.
ويمكن تقسيم البروتوكول إلى 4 إجراءات واسعة - نمو C. elegans والتحضير للتصوير (القسمين 1 و 2)، وتصوير المراسلين النسخباستخدام المجهر الفلوري (الأقسام 3-5)، والقياسات الكمية للمراسلين الذين يستخدمون مقياس تدفق الجسيمات الكبيرة (القسم 6)، والمقاييس الفسيولوجية لقياس حساسية الإجهاد في C. elegans (القسم 7).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>for mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118072</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco granulated agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-782</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>C0051-25</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>350-5000-000</td>
			<td>equipped with a 488 nm light source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Cleaning Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5072-000</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Sheath Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5070-100</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG dioxane free</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>CI8280-4</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426500</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M205FA stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450040</td>
			<td>equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0070-3</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>75990-514</td>
			<td>equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289-50G</td>
			<td>for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tert-butyl hydroperoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>458139</td>
			<td>for oxidative stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660-5G</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurements of physiological stress responses in c. elegans

وغالبا ما تتعرض الكائنات الحية لبيئات متقلبة والتغيرات في التوازن داخل الخلايا، والتي يمكن أن يكون لها آثار ضارة على البروتيوم وعلم وظائف الأعضاء. وهكذا، تطورت الكائنات الحية استجابات محددة ومحددة للإجهاد مخصصة لإصلاح الأضرار والحفاظ على التوازن. وتشمل هذه الآليات استجابة البروتين تكشفت من التبائص التليسفي (UPRER),استجابة البروتين تكشفت من الميتوكوندريا (الاستعراض الدوري الشاملMT),استجابة الصدمة الحرارية (HSR), واستجابة الإجهاد التأكسدي (OxSR). البروتوكولات المعروضة هنا تصف طرق الكشف عن وتوصيف تفعيل هذه المسارات وعواقبها الفسيولوجية في النيماتودا، C. elegans. أولاً، يتم وصف استخدام المراسلين الفلورسنتالنسخي ينفين على المسارات الخاصة بتوصيف خلوي سريع، أو فحص المخدرات، أو الفحص الجيني على نطاق واسع (على سبيل المثال، المكتبات RNAi أو المتحولة). بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف المقالات الفسيولوجية التكميلية والقوية ، والتي يمكن استخدامها لتقييم حساسية الحيوانات مباشرة لإجهادات محددة ، وتعمل كتحقق وظيفي من المراسلين النسخة. معا، تسمح هذه الأساليب لتوصيف سريع للآثار الخلوية والفسيولوجية من اضطرابات البروتيوات السمية الداخلية والخارجية.

استخدام المراسلين النصوص لقياس تفعيل استجابات الإجهاد هنا، يتم استخدام المراسلين النسخ الفلورية، والتي بمثابة أدوات قوية لقياس تفعيل معظم استجابات الإجهاد في C. elegans. يتم دفع تعبير GFP تحت مروج الأهداف الكنسية للمنظمين الأساسيين النسخ المشاركين في الاستج?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

هنا ، نحن نميز استجابات الإجهاد البرودوسلي الخلوي في النيماتودا C. elegans من خلال قياس تنشيط المراسلين النسخ الفلوريو وحساسية الإجهاد الفسيولوجي.

قياسات استجابات الإجهاد الفسيولوجي في C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

ويمكن استخدام هذه الطرق لتوصيف استجابات الإجهاد في C.elegans وتحديد ما إذا كانت الاضطرابات الوراثية أو الدوائية تؤثر على تنشيط الممرات الخلوية الواقية. هذه الطرق تسمح بإجراء اختبارات سريعة وعالية الإنتاجية لمئات الانزعاجات مثل الانزعاج الجيني على المستويين الجزيئي والفسيولوجي. لضمان إجراء الفحص بشكل صحيح، وتشمل الضوابط الإيجابية والسلبية.مزامنة الحيوانات الصحية التي تتغذى جيدا على المرحلة المناسبة واستخدام لوحات جديدة للتجربة. التصور من micromanipulation من الديدان مع اختيار يمكن أن تساعد المستخدمين الجدد على فهم كيف يمكن اصطفا ديدان وتقييمها لقابلية البقاء. إثبات الإجراءات سيكون فرانكينو، هولي غيلديا، وميليسا ميتكالف، طلاب الدراسات العليا في مختبرنا.لاستخدام الحيوانات التي تعبر عن GFP تحت المروج للبروتين صدمة الحرارة أربعة لتفعيل reticulum endoplasmic كشف استجابة البروتين، وتنمو الحيوانات مراسل متزامنة في 20 درجة مئوية حتى مرحلة L4 وغسل الديدان قبالة لوحة باستخدام M9 المتوسطة ونقلها إلى أنبوب. بعد جمع الديدان عن طريق الطرد المركزي، استبدال M9 مع 25 نانوغرام لكل ملليلتر من المخدرات ذات الأهمية في M9 أو ثنائي الميثيل سلفوكسيد في M9 في أنابيب الحيوان التحكم. ثم ضع الديدان على منصة دوارة لمدة ثلاث إلى أربع ساعات عند 20 درجة مئوية.في نهاية الحضانة، الطرد المركزي الديدان لتسوية قبل استبدال محلول المعالجة مع 15 ملليلتر من M9 وحدها. بعد غسل اثنين، نقل الحيوانات إلى لوحات NGM أو لوحات تدخل الحمض النووي الريبي NGM حسب الاقتضاء والسماح للدودة لاسترداد بين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية. عندما تعافى الديدان، إضافة خمسة إلى 10 ميكرولترات من 100 ملليمولار الصوديوم أزيميد على لوحة NGM القياسية دون البكتيريا ووضع لوحة من الديدان تحت مجهر تشريح.نقل 10 إلى 20 الحيوانات من لوحة في بقعة من أزيد الصوديوم. وينبغي أن الحيوانات الاستيلاء على الحركة بعد وقت قصير من الهبوط في محلول الملح. مرة واحدة قد تبخرت azide الصوديوم، يصطف الحيوانات في الإعداد التصوير المطلوب مع الجانبين الأمامي والخلفي في نفس التوجه لجميع الحيوانات ووضع على الفور لوحة من الحيوانات تحت مجهر ستيريو.إطلاق برنامج التصوير المجهر ستيريو وتحت علامة التبويب المقتنيات، انقر فوق فتح المشاريع والمجلد لفتح مشروع جديد. انقر بزر الماوس الأيمن ثم حدد إعادة تسمية لإعادة تسمية المجلد. ضع عينة الفيروس المتنقل تحت هدف المجهر واستخدم الإعداد Brightfield لتحديد موقع النقطة المحورية الصحيحة للدود لتقليل تبييض الفلورسنت.وسيكون مركز العينة النقطة التي يكون فيها خط البيض مرئيًا بوضوح وليس غامضًا. حدد وقت التعرض للتأكد من عدم تشبع البيكسلات وكذلك لضمان أن الإشارة أعلى من حد الكشف. بعد تعيين وقت التعرض والتكبير و التركيز و مكثفات Brightfield إلى الإعدادات المناسبة، انقر فوق زر التقاط الصورة للحصول على صورة.للتصوير باستخدام مجهر نطاق واسع مركب، ضع لوحة معالجة التحكم الأساسية على مرحلة المجهر واسعة المجال المركبة واستخدم لوحة اللمس لإطلاق برنامج التحكم. إنشاء ألبوم جديد واسم الملف ووضع لوحة تحت عدسة الهدف. استخدم التحكم الأساسي ولوحات التحكم الإيجابية لضبط وقت التعرض وشدة الفلورنس بحيث تكون الإشارة مرئية ولكنها غير مشبعة.ثم احفظ صور Brightfield و GFP FITC. لتحديد كمي التعريفي للمراسل بواسطة الجسيمات الكبيرة تدفق القياس، أولا بدوره على الليزر cytometer وفتح برنامج مقياس الجُل. انقر فوق بدء تشغيل الليزر في نافذة البرنامج وانقر فوق تشغيل لبدء الليزر في إطار التحكم بالليزر الأرجون.عندما يصل الليزر إلى حوالي 12 مللي واط ويصل مستوى مصدر الضوء 488 إلى حوالي 12 ، انقر فوق done والتحقق من قيم الضغط الأربعة. إذا كانت القيم تبدو مشابهة لتلك التي تمت ملاحظتها في الإعداد الأصلي، فتحقق من مربع موافق الضغط. المقبل، للتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء أو الحطام عرقلة تدفق اأشاء وعينة من خلال خلية تدفق، انقر فوق تنظيف عدة مرات.ثم إيقاف تشغيل الفرز وعلى اطفئ على إعادة تشغيل تدفق. للتحقق من معدل التدفق، جمع اجمد لمدة 60 ثانية. جمع اغرم في أنبوب 15 ملليلتر لمدة 60 ثانية.وينبغي أن يكون معدل التدفق من 9 إلى 10 ملليلتر في الدقيقة. لتشغيل العينات، قم بضبط طاقة المضاعفة الضوئية بالليزر إلى مستوى عالٍ بما يكفي بحيث تكون الإشارة أعلى من حد الكشف ولكن ليس أعلى من حد التشبع. أداء حجم الغات لاستبعاد فقاعات، والحطام، والبيض، وغيرها من الجزيئات الصغيرة غير المرغوب فيها، وتشمل فقط الحيوانات ذات الأهمية مثل البالغين.عندما تم تعيين المعلمات الفرز، إضافة الديدان المعدة إلى كوب وانقر فوق الحصول على. ووتش للتأكد من أن كل من السائل لا يتم تناولها في الجهاز لأن هذا سوف يسبب تدفق مقياس الهواء لاتخاذ في الهواء وخلق فقاعات داخل كاشف. عندما تكون العينة منخفضة و / أو ما يكفي من الحيوانات قد تم جمعها، انقر فوق إيقاف.لتخزين البيانات المُسورة استناداً إلى قيود الحجم فقط، انقر فوق الإعداد، تخزين البيانات، فقط مسور، ومخزن مسور لحفظ البيانات. ثم شطف كوب جمع مع المياه الأيونية وإزالة الغسيل عن طريق الفراغ ثلاث مرات قبل تكرار التحليل مع العينة التالية. لقياس حساسية الاجهاد الميتوكوندريا والأكسدة، إضافة 50 إلى 75 ميكرولترات من الباراكوات في M9 إلى 8 إلى 10 آبار لكل حالة من لوحة مسطحة أسفل 96 جيدا ونقل ثمانية إلى 10 الديدان لكل حالة إلى كل بئر من الباراكوات.كل ساعتين، اضغط على لوحة بلطف للتسبب في الحيوانات الحية لسحق أو الانحناء للسماح بتسجيل عدد من الحيوانات النافقة في البئر. لقياس حساسية درجة حرارة الحيوانات، احتضان الديدان لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام في 20 درجة مئوية قبل الطلاء 10 إلى 15 الحيوانات لكل صفيحة لكل حالة ما مجموعه أربعة إلى ستة لوحات. ثم ضع اللوحات في حاضنة درجة 34 أو 37 درجة مئوية وسجل بقاء الدودة كل ساعتين كما هو موضح للتو.مراسل Hsp-4 لديه انطباع القاعدي الحد الأدنى في غياب الإجهاد ولكن معارض تعبير GFP قوية عندما تتعرض الحيوانات للإجهاد إندوبلاسميكي ريكولوم باستخدام المخدرات Tunicamycin. ويمكن أيضا أن تكون هذه الاختلافات كميا باستخدام مقياس تدفق الجسيمات الكبيرة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون تحريض transgene تحت الإجهاد التشنجي endoplasmic supressed تماما بالضربة القاضية من XBP-1 عن طريق تدخل الجيش الملكي النيبالي.ويمكن إجراء عمليات قياس مماثلة لقياس الإجهاد الميتوكوندريا، والإجهاد التأسدي، والإجهاد الحراري. يمكن أيضًا قياس الاستجابات الفسيولوجية الحيوانية الكاملة للإجهاد باستخدام العديد من مقايسات البقاء على قيد الحياة. على سبيل المثال، يتم استخدام التعرض لTunicamycin لقياس حساسية الإجهاد التشنجية.يؤدي الضربة القاضية لجين XBP-1 إلى زيادة كبيرة في الحساسية تجاه تونيكاميسين. وعلاوة على ذلك، يستخدم التعرض للعامل الكيميائي Paraquat لقياس حساسية الإجهاد التأسدي والميتوكوندريا. ينتج عن النافلة للجين DAF-2 زيادة كبيرة في مقاومة Paraquat.يمكن قياس الحرارة عن طريق تحديد بقاء الحيوانات في درجات حرارة مرتفعة ويمكن رسمها كنحن للبقاء على قيد الحياة. وينبغي أن يتم تنفيذ هذه المقايسات ما لا يقل عن أربع إلى ست مرات وجميع النسخ المتماثلات ينبغي أن تكون تآمر ضد بعضها البعض كما يدل على تقلب الحرارة عالية بشكل لا يصدق بالمقارنة مع غيرها من المقايسات الإجهاد. عند تصوير الحيوانات، من المهم تعيين المعلمات بحيث لا يكون هناك أكثر من أو تحت تشبع الإشارة وضمان استخدام نفس المعلمات طوال التجربة.بروتوكولات التصوير المذكورة هنا قابلة للفحص على نطاق واسع بما في ذلك الشاشات على نطاق الجينوم وهي كبيرة لكل من الدراسات الاستكشافية والتأكيدية التي يمكن بعد ذلك متابعتها من قبل الاختبارات الفسيولوجية الموصوفة.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

الهرمونات النباتية خلال رصد استجابات التوتر

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

ربط المخاطر الافتراس، والإجهاد الفسيولوجي آكل النبات والتحلل الميكروبي للنباتات القمامة

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. ايليجانس الانجذاب الكيميائي الفحص

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

تلوين الأجسام المضادة في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; عن طريق &quot;تجميد تكسير&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

نموذج نقص الأكسجين المجاعة لنقص التروية / ضخه في<em&gt; C. ايليجانس</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

طرق للبشرة إصابة وفحوصات لالردود الجرح في<em&gt; C. ايليجانس</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

طرق لتقييم التحت خلوية من المقصورات في العضلات<em&gt; C. ايليجانس</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...