Name: measurements of physiological stress responses in c. elegans
Uploaded: 2020-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

R.BZ. støttes af EMBO's langsigtede stipendium og Larry L. Hillblom Foundation. R.H.S er støttet af tilskud 5F32AG032023-02 gennem National Institute of Aging (NIA) og Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship. A.F. understøttes af tilskud F32AG051355 gennem NIA. H.K.G. er støttet af tilskud DGE1752814 gennem National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. understøttes af 1F31AG060660-01 gennem NIA. AD er støttet af Thomas og Stacey Siebel Foundation, Howard Hughes Medical Institute, og 4R01AG042679-04 og 5R01AG055891-02 fra NIA, og 5R01ES021667-09 fra NIEHS. Vi takker Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet og Anel Esquivel for betydelig teknisk bistand. Vi takker Morimoto lab og CGC (finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) for stammer.

1. Standard vækstbetingelser for temperaturer og OP50 vs HT115
<ol><li>Standardvækst og -ekspansion<ol>
<li>Der dyrkes en op50-kultur i LB (tabel 1)eller tilsvarende foretrukne medier for 24-48 timer ved omgivelsestemperatur (~22-25 °C). Vokse bakterier ved stuetemperatur som OP50 er en uracil auxotroph og der er en højere forekomst af revertants (f.eks suppressor mutanter), når de dyrkes ved 37 °C. Langtidsopbevaring af OP50-kulturer anbefales ikke (maks. 1 uge ved 4 °C).</li>
		<li>Der frøs e...

Her beskrives metoder til afhøring af cellulære stressreaktioner i C. elegans- ved hjælp af fluorescerende transskriptionelle journalister og fysiologiske stressoverlevelsesanalyser. Journalisterne alle udnytteR GFP udtryk drevet under initiativtager til en downstream transskriptionelle mål for transskription faktorer, der er involveret i montering cellulære stress reaktioner. Anvendelse af hsp-4p::GFP moduleret af XBP-1s-medieret UPRER, hsp-6p::GFP kontrolleret af ATFS-1-medier...

En organismes evne til at reagere på ændringer i det intra- og ekstracellulære miljø er afgørende for dens overlevelse og tilpasning. Dette opnås på et cellulært niveau gennem mange beskyttende veje, der sikrer integriteten af cellen. Mens mange cellulære komponenter er genstand for stress-associerede skader, en større inddragelse af cellulære stress reaktioner er at reparere og beskytte homøostase af cellulære proteom. Men opdelingen af proteiner i særlige strukturer, kaldet organeller, udgør en udfordring for cellen, da den ikke kan stole på en centraliseret form for proteinkvalitetskontrol for at sikre, at alle proteiner i cellen er korrekt foldet og funktionelt. Derfor, at beskæftige sig med forstyrrelser til deres proteiner, organeller har udviklet dedikerede kvalitetskontrol mekanismer, som kan fornemme fejlfoldede proteiner og aktivere en stress respons i et forsøg på at lindre stress i dette rum. For eksempel er cytosolen afhængig af varmechokresponsen (HSR), mens det endoplasmatiske reticulum (ER) og mitokondrier er afhængige af deres rumspecifikke udfoldede proteinrespons (UPR). OxSR tjener til at lindre de toksiske virkninger af reaktive iltarter (ROS). Hver stress respons udløses i overværelse af cellulære udfordringer og miljømæssige fornærmelser og inducerer en skræddersyet transskriptionel reaktion. Kendetegnende for disse reaktioner omfatter syntese molekyler, der re-fold fejlfoldede proteiner (såsom chaperoner) målrettet til den rette organelle, eller alternativt fjerne beskadigede proteiner ved protein nedbrydning. Undladelse af at aktivere disse stress reaktioner resulterer i ophobning af beskadigede proteiner, cellulære dysfunktion formeret til systemisk svigt af væv, og i sidste ende død af organismen. Funktionen og reguleringen af de forskellige stressreaktioner gennemgås andetsteds1.
Mange indsigter om regulering og aktivitet af cellulære stress reaktioner er blevet tilskrevet nematoden, Caenorhabditis elegans, en flercellet model organisme i genetisk forskning. Nematoder ikke kun tillade at studere aktivering af stress reaktioner på celleniveau, men også på organismeniveau; nematoder er blevet anvendt til at undersøge virkningerne af genetiske forstyrrelser eller eksponering for narkotika og forurenende stoffer på deres vækst og overlevelse. Deres hurtig generation tid, isogeni, gennemsigtighed, genetiske tractability, og brugervenlighed under eksperimenter gør dem ideelle til sådanne undersøgelser. Derudover gør den relativt hurtige fysiologiske reaktion på stress (mellem timer og et par dage) og den evolutionære bevarelse af cellulære veje nematoder til et fremtrædende redskab til at studere stressresistens.
Der er to almindeligt anvendte E. coli stammer, der anvendes som en fødekilde til at vokse C. elegans: standard OP50, en B-stamme, hvor de fleste eksperimenter er blevet historisk udført2 og HT115, en K-12 stamme, der bruges til næsten alle RNAi eksperimenter3,4. Det er vigtigt at bemærke, at der er betydelige forskelle mellem OP50 og HT115 bakteriel kost. Vækst på disse forskellige bakterielle kilder har vist sig at forårsage store forskelle i metabolisk profil, mitokondriel DNA kopi nummer, og flere store fænotyper, herunder levetid5. Nogle af disse forskelle tilskrives Vitamin B12-mangel forbundet med vækst på OP50 bakterier, hvilket kan resultere i defekter i mitokondrier homøostase og øget følsomhed over for patogener og belastninger. Alle disse fænotyper har vist sig at være lettet ved vækst på HT115 bakterier, som har højere niveauer af Vitamin B126. Det anbefales derfor, at alle forsøg med fysiologiske stressreaktioner udføres på HT115-bakterier, uanset nødvendigheden af RNAi-tilstande. Men på grund af den lethed at opretholde dyr på OP50, alle standard vækst (dvs. vedligeholdelse og forstærkning af dyr) kan udføres på OP50, som betydelige forskelle i de eksperimentelle paradigmer beskrevet her ikke blev påvist i orme opretholdes på OP50, så længe de blev flyttet til HT115 efter synkronisering (dvs. fra luge post-blegning med eller uden L1 arrestation) indtil eksperimentering.
Her er karakteriseringen af aktiviteten af cellulære stressreaktioner ved hjælp af to funktionelle metoder beskrevet. Det skal bemærkes, at de præsenterede protokoller primært er fokuseret på cellulære stress reaktioner og deres indvirkning på protein homøostase. For det første er fluorescerende transskriptionelle journalister udnyttes, som er reguleret af endogene gen initiativtagere, der er specielt aktiveret som reaktion på forskellige cellulære belastninger. Disse fluorescerende transskriptionelle journalister er baseret på transskription af specifikke gener, der er indbygget en del af stress respons. For eksempel aktiveres HSP-4, et varmechokprotein orthologtil den menneskelige chaperone HSPA5/BiP, ved ER-stress og lokaliserer til erefor at afhjælpe belastningen. Under forhold med ER-stress (f.eks. eksponering for tunicamycin) syntetiseres et grønt fluorescerende protein (GFP), der er placeret under regulering af hsp-4-promotor, i høje niveauer, som kan vurderes ved fluorescerende mikroskopi eller kvantitativt målt ved hjælp af large-partikel flow cytometri af nematoder7. Tilsvarende er initiativtageren til en mitokondrielle chaperone, hsp-6 (orthologous til pattedyr HSPA9), anvendes til at overvåge aktiveringen af UPRMT8, og initiativtageren til cytosolic chaperone hsp-16.2 (orthologous til humankrystallin alpha gener) anvendes til at vurdere aktiviteten af HSR9. Disse journalister tillader en hurtig karakterisering af de veje, der aktiveres som reaktion på forskellige forstyrrelser.
Ofte er de journalister, der præsenteres her, afbildet ved hjælp af mikroskopi, som giver et kvalitativt output af aktiveringen af stressreaktioner. Men mens billeddannelsesteknikker giver både oplysninger om intensiteten og vævsplaceringen af de ovennævnte journalister, er kvantificeringen ikke altid nøjagtig eller robust. Selv om det er muligt at kvantificere fluorescerende aktivering ved hjælp af billedbehandlingsanalyseværktøjer, er disse metoder relativt lave gennemløbsgrad, og stikprøvestørrelsen er lille på grund af det relativt lave antal afbildede dyr. Den lethed og evne til at opnå store mængder af dyr hurtigt gøre C. elegans en ideel model system til at assay aktivering af fluorescerende stress reportere ved hjælp af en stor partikelflow cytometer. En stor partikel flow cytometer er i stand til at registrere, analysere og sortering baseret på størrelse og fluorescens fra mange levende dyr. Ved hjælp af denne metode er det muligt at få fluorescerende intensitet, størrelse og også rumlige (2D) oplysninger for tusindvis af orme. Systemet styres ved hjælp af FlowPilot, som giver mulighed for dataindsamling i realtid og analyse af de målte parametre. Her tilbydes metoder til både mikroskopisk billeddannelse og kvantitativ analyse ved hjælp af et cytometer med stort partikelflow som metoder til at måle aktiveringen af stressrespons.
Ud over reporteranalyse kan dyrenes følsomhed eller modstandsdygtighed over for stress måles ved hjælp af fysiologiske stressanalyser. Dette opnås ved at udsætte dyr for stressende miljøer, der aktiverer specifikke cellulære stressveje. Her findes der flere metoder til at måle hele dyrs følsomhed over for bestemte typer stressfaktorer.
ER-stress påføres C. elegans ved hjælp af den kemiske agens tunicamycin, som blokerer N-forbundet glycosylation, hvilket forårsager akkumulering af misfoldede proteiner i ER10. I C. elegans resulterervæksten ved eksponering for tunicamycin i større forstyrrelser i ER-funktionen og en signifikant nedsat levetid11. Ved at måle dyrenes overlevelse på tunicamycinholdige plader kan er-stressfølsomheden hos dyrene kvantificeres. For eksempel, dyr med ektopisk UPRER induktion og dermed øget resistens over for protein misfolding stress i ER har en øget overlevelse ved tunicamycin eksponering i forhold til vilde dyr12.
Oxidativ og mitokondriel stress påføres C. elegans ved at udsætte dyrene for den kemiske agens, paraquat. Paraquat er et almindeligt anvendt herbicid, som forårsager superoxid dannelse specifikt i mitokondrier13. På grund af den specifikke lokalisering af mitokondrier-afledte reaktive ilt arter (ROS), paraquat assays bruges ofte som en "mitokondriel" stress assay. Superoxid omdannes imidlertid hurtigt til hydrogenperoxid ved mitokondrielt superoxiddismutaser (SODs)14. Hydrogenperoxid kan efterfølgende spredes ud af mitokondrier og forårsage oxidativstress i andre rum i cellen. Derfor beskriver vi paraquat overlevelsesanalyser som måling af følsomhed over for både mitokondriært og oxidativt stress (andre oxidative stressanalyser kan findes15).
Termotoleranceanalyser udføres i C. elegans ved at placere dyr i forhøjede temperaturer. Omgivelsestemperaturerfor nematoder er ~15-20 °C , og der fremkaldes termisk belastning ved temperaturer over 25 °C16,17. Termotoleranceanalyser udføres normalt ved temperaturer fra 30-37 °C, da dyrene udviser store cellulære defekter ved denne temperatur, og overlevelsesanalyser færdiggøres inden for 24 timer16,18. Her findes der to alternative metoder til udførelse af termotoleranceanalyser: vækst ved 34 °C og vækst ved 37 °C. Sammen kan de protokoller, der præsenteres her, udnyttes til at udføre store skærme, når de kombineres med standard genknock-down ved hjælp af RNA-interferens eller kemiske lægemiddelbiblioteker.
Protokollen kan opdeles i 4 brede procedurer- vækst af C. elegans og forberedelse til billeddannelse (afsnit 1 og 2), billeddannelse af transskriptionelle reportere ved hjælp af fluorescerende mikroskopi (afsnit 3-5), kvantitative målinger af journalister ved hjælp af en stor partikelflowcytometer (afsnit 6) og fysiologiske analyser til måling af stressfølsomhed i C. elegans (afsnit 7).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>for mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118072</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco granulated agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-782</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>C0051-25</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>350-5000-000</td>
			<td>equipped with a 488 nm light source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Cleaning Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5072-000</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Sheath Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5070-100</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG dioxane free</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>CI8280-4</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426500</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M205FA stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450040</td>
			<td>equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0070-3</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>75990-514</td>
			<td>equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289-50G</td>
			<td>for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tert-butyl hydroperoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>458139</td>
			<td>for oxidative stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660-5G</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurements of physiological stress responses in c. elegans

Organismer er ofte udsat for svingende miljøer og ændringer i intracellulær homøostase, som kan have skadelige virkninger på deres proteom og fysiologi. Således har organismer udviklet målrettede og specifikke stress reaktioner dedikeret til at reparere skader og vedligeholde homøostase. Disse mekanismer omfatter udfoldet protein respons af endoplasmic reticulum (UPRER),udfoldet protein respons af mitokondrier (UPRMT),varmechok respons (HSR), og oxidative stress respons (OxSR). De protokoller, der præsenteres her beskrive metoder til at opdage og karakterisere aktivering af disse veje og deres fysiologiske konsekvenser i nematode, C. elegans. For det første er brugen af pathway-specifikke fluorescerende transskriptionelle journalister beskrevet for hurtig cellulær karakterisering, narkotika screening, eller storstilet genetisk screening (f.eks RNAi eller mutant biblioteker). Desuden beskrives komplementære, robuste fysiologiske analyser, som kan bruges til direkte at vurdere dyrenes følsomhed over for specifikke stressfaktorer, der tjener som funktionel validering af de transskriptionelle reportere. Sammen, disse metoder giver mulighed for hurtig karakterisering af de cellulære og fysiologiske virkninger af interne og eksterne proteotoksiske forstyrrelser.

Brug af transskriptionelle journalister til at måle aktivering af stressreaktioner Her er fluorescerende transskriptionelle journalister, der tjener som robuste værktøjer til at måle aktivering af de fleste stress reaktioner i C. elegans. GFP udtryk er drevet under initiativtager til kanoniske mål master transskriptionelle lovgivere involveret i at reagere på rum-specifikke belastninger. Tabel 3indeholder en omfattende liste over alminde...

Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Her karakteriserer vi cellulære proteotoksiske stressreaktioner i nematoden C. elegans ved at måle aktiveringen af fluorescerende transskriptionelle journalister og assaying følsomhed over for fysiologisk stress.

Målinger af fysiologiske stressreaktioner i C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Disse metoder kan bruges til at karakterisere stress reaktioner i C.elegans og til at afgøre, om genetiske eller farmakologiske perturbations påvirker aktivering af beskyttende cellulære veje. Disse metoder tillader hurtig og høj-throughput test af hundredvis af perturbations såsom gen knockdown både på de molekylære og fysiologiske niveauer. For at sikre analysen udføres korrekt, omfatter positive og negative kontroller.Synkroniser sunde, velnærede dyr til det rette stadie og brug friske plader til forsøget. Visualisering af mikromanipulation af ormene med et valg kan hjælpe nye brugere med at forstå, hvordan ormene kan linet op og vurderes for levedygtighed. Demonstrere procedurerne vil være Phil Frankino, Holly Gildea, og Melissa Metcalf, kandidatstuderende i vores laboratorium.At bruge dyr, der udtrykker GFP under promotor af varmechok protein fire til aktivering af endoplasmatiske reticulum udfoldet protein respons, vokse synkroniseret reporter dyr ved 20 grader Celsius indtil L4 fase og vaske orme fra pladen ved hjælp af M9 medium og overføres til et rør. Efter indsamling af ormene ved centrifugering erstattes M9 med 25 nanogram pr. milliliter af det stof, der er af interesse for M9 eller dimethylsulfoxid i M9 i kontroldyrrørene. Placer derefter ormene på en roterende platform i tre til fire timer ved 20 grader Celsius.Ved slutningen af inkubationen centrifuges ormene til at bosætte sig, før du udskifter behandlingsopløsningen med 15 milliliter M9 alene. Efter to vasker, overføre dyrene til NGM plader eller NGM RNA interferens plader efter behov og lad ormene til at inddrive natten ved 20 grader Celsius. Når ormene er kommet sig, tilsættes fem til 10 mikroliter på 100 millimolar natriumazid på en standard NGM plade uden bakterier og placere en plade af orme under et dissekerende mikroskop.Overfør 10 til 20 dyr fra pladen til stedet for natriumazid. Dyrene skal gribe bevægelse kort efter landing i saltopløsningen. Når natriumaziden er fordampet, skal dyrene sættes på linje i den ønskede billeddannelsesopsætning med de forreste og bageste sider i samme retning for alle dyrene og straks placere dyrepladen under et stereomikroskop.Start stereomikroskopbilledbehandlingssoftwaren, og klik på åbne projekter og en mappe under fanen Opkøb for at åbne et nyt projekt. Højreklik, og vælg omdøbe for at omdøbe mappen. Placer ormenprøven under mikroskopmålsætningen, og brug Brightfield-indstillingen til at finde ormenes korrekte omdrejningspunkt for at minimere fluorescerende blegning.Prøvens centrum vil være det punkt, hvor æglinjen er klart synlig og ikke uklar. Indstil eksponeringstiden for at sikre, at pixel ikke er mættede, og for at sikre, at signalet er over registreringsgrænsen. Når du har indstillet eksponeringstiden, zoom, fokus og Brightfield-kondensatorerne til de relevante indstillinger, skal du klikke på knappen hent billede for at hente et billede.Til billeddannelse ved hjælp af et sammensat wide-field mikroskop skal du placere baseline kontrolbehandlingspladen på det sammensatte wide-field-mikroskoptrin og bruge touchpad'en til at starte kontrolprogrammet. Opret et nyt album og filnavn, og placer pladen under objektivet. Brug grundkontrol og positive kontrolplader til at indstille eksponeringstiden og fluorescensintensiteten, så signalet er synligt, men ikke mættet.Gem derefter Brightfield- og GFP FITC-billeder. For at kvantificere induktionen af reporteren ved hjælp af stor partikelflow cytometri, først tænde cytometer lasere og åbne cytometer software. Klik på start for at tænde lasere i softwarevinduet og klik køre for at indlede laser i argon laser kontrol popup vindue.Når laseren når omkring 12 milliwatt og 488 lyskilde niveau går op til omkring 12, klik gjort og kontrollere de fire trykværdier. Hvis værdierne ligner dem, der blev observeret i den oprindelige opsætning, skal du markere feltet OK for tryk. Dernæst for at sikre, at der ikke er nogen luftbobler eller snavs blokerer strømmen af kappe og prøve gennem flowcellen, klik ren flere gange.Sluk derefter sortering og på kappe for at genstarte strømmen. For at kontrollere strømningshastigheden skal du samle hylsteret i 60 sekunder. Indsaml hylsteret i et 15 milliliterrør i 60 sekunder.Strømningshastigheden skal være ni til 10 milliliter i minuttet. Hvis du vil køre prøverne, skal du justere laserfotomultiplier effekt til et niveau, der er højt nok, at signalet er over detektionsgrænsen, men ikke højere end mætningsgrænsen. Udfør størrelse gating at udelukke bobler, snavs, æg og andre uønskede små partikler og til kun at omfatte dyr af interesse såsom voksne.Når screeningparametrene er indstillet, skal du føje de forberedte orme til en kop og klikke på hentning. Se for at sikre, at al væsken ikke tages op i maskinen, da dette vil få flowcytometeret til at tage luft ind og skabe bobler i detektoren. Når prøven er lav, og/eller der er indsamlet nok dyr, skal du klikke på stop.Hvis du vil gemme gated-data, der kun er baseret på størrelsesbegrænsningerne, skal du klikke på opsætning, datalagring, kun gated og gemme gated for at gemme dataene. Skyl derefter opsamlingsbægeret med deioniseret vand, og vask ved vakuum fjernes tre gange, før analysen gentages med den næste prøve. For at måle mitokondriel og oxidativ stress følsomhed, tilsæt 50 til 75 mikroliter paraquat i M9 til otte til 10 brønde pr tilstand af en flad bund 96-brønd plade og overføre otte til 10 orme per tilstand til hver brønd paraquat.Hver anden time skal du banke på pladen forsigtigt for at få de levende dyr til at prygle eller bøje for at tillade scoring af antallet af døde dyr pr. brønd. For at måle dyrenes temperaturfølsomhed inkuberes ormene i tre til fire dage ved 20 grader Celsius, før de skal parre 10 til 15 dyr pr. plade pr. betingelse for i alt fire til seks plader. Derefter placere pladerne i en 34 eller 37 grader Celsius inkubator og score ormen overlevelse hver anden time som netop påvist.Den hsp-4 reporter har minimal basal indtryk i mangel af stress, men udviser en robust GFP udtryk, når dyrene udsættes for endoplasmic reticulum stress ved hjælp af lægemidlet Tunicamycin. Disse forskelle kan også kvantificeres ved hjælp af et stort partikelflow cytometer. Desuden kan induktionen af transgenet under endoplasmic reticulum stress være helt undertrykt ved knockdown af XBP-1 via RNA interferens.Lignende analyser kan udføres for at måle mitokondriel stress, oxidativstress og varmestress. Hele dyr fysiologiske reaktioner på stress kan også måles ved hjælp af flere overlevelse assays. For eksempel, eksponering for Tunicamycin bruges til at måle endoplasmic reticulum stress følsomhed.Knockdown af XBP-1 genet resulterer i en betydelig stigning i følsomheden over for Tunicamycin. Desuden anvendes eksponering for den kemiske agens Paraquat til at måle oxidativ og mitokondriel stressfølsomhed. Knockdown af DAF-2 genet resulterer i en betydelig stigning i resistens over for Paraquat.Thermotolerance kan måles ved at bestemme dyrenes overlevelse ved forhøjede temperaturer og kan afbildes som en overlevelseskurve. Disse analyser bør udføres mindst fire til seks gange, og alle replikater bør afbildes mod hinanden, da motolerance viser en utrolig høj variabilitet i forhold til andre stressanalyser. Ved billeddannelse af dyr er det afgørende at indstille parametrene, således at der ikke er over- eller undermætning af signal, og for at sikre, at de samme parametre anvendes under hele forsøget.De billeddannelsesprotokoller, der er beskrevet her, er modtagelige for storstilet screening, herunder skærme i hele genomet, og de er gode til både sonderende og bekræftende undersøgelser, som derefter kan følges op af de beskrevne fysiologiske analyser.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening for at identificere Postembryonic fænotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

Sammenkædning Prædation Risk, Herbivore fysiologisk stress og Mikrobiel nedbrydning af plante Kuld

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Kemotaksi Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antistoffarvning i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Brug af &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

En Anoxia-sult Model for iskæmi / reperfusion i<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder til Hud sårbarhed og Analyser for Wound Svar i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Metoder til at vurdere subcellulære afsnit af muskler i<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...