Name: measurements of physiological stress responses in c. elegans
Uploaded: 2020-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

R.BZ. wordt ondersteund door de EMBO long term fellowship en The Larry L. Hillblom Foundation. R.H.S wordt ondersteund door subsidie 5F32AG03202023-02 via het National Institute of Aging (NIA) en de Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship. A.F. wordt ondersteund door subsidie F32AG051355 via het NIA. H.K.G. wordt ondersteund door subsidie DGE1752814 via het National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. wordt ondersteund door 1F31AG060660-01 tot en met NIA. A.D. wordt ondersteund door de Thomas and Stacey Siebel Foundation, het Howard Hughes Medical Institute en 4R01AG042679-04 en 5R01AG055891-02 van NIA en 5R01ES021667-09 van NIEHS. Wij danken Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet en Anel Esquivel voor belangrijke technische bijstand. Wij danken het Morimoto lab en de CGC (gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) voor stammen.

1. Standaard groeiomstandigheden van temperaturen en OP50 vs HT115
<ol><li>Standaard groei en expansie<ol>
<li>Kweek een cultuur van OP50 in LB (Tabel 1) of gelijkwaardige media naar keuze voor 24-48 uur bij omgevingstemperatuur (~ 22-25 °C). Kweek bacteriën bij kamertemperatuur als OP50 is een uracil auxotroph en er is een hogere incidentie van redenaars (bijvoorbeeld suppressor mutanten) wanneer geteeld op 37 °C. Langdurige opslag van OP50-culturen wordt afgeraden (max 1 week bij 4 °C).</li>
		<l...

Hier worden methoden beschreven om cellulaire stressreacties in C. eleganste ondervragen, met behulp van fluorescerende transcriptieverslaggevers en fysiologische stressoverlevingstesten. De verslaggevers maken allemaal gebruik van GFP expressie gedreven onder de promotor van een downstream transcriptie doel van de transcriptie factoren die betrokken zijn bij de montage cellulaire stress reacties. Het gebruik van hsp-4p::GFP gemoduleerd door XBP-1s-gemedieerde UPRER, hsp-6p::GFP geco...

Het vermogen van een organisme om te reageren op veranderingen in de intra- en buitencellulaire omgeving is cruciaal voor zijn overleving en aanpassing. Dit wordt bereikt op cellulair niveau door middel van tal van beschermende trajecten die de integriteit van de cel te waarborgen. Terwijl tal van cellulaire componenten zijn onderworpen aan stress-geassocieerde schade, een belangrijke betrokkenheid van cellulaire stress reacties is het herstellen en beschermen van de homeostase van de cellulaire proteome. Echter, de compartimentering van eiwitten in speciale structuren, genaamd organellen, vormt een uitdaging voor de cel, omdat het niet kan vertrouwen op een gecentraliseerde vorm van eiwit kwaliteitscontrole om ervoor te zorgen dat alle eiwitten in de cel goed worden gevouwen en functioneel. Daarom, om te gaan met verstoringen van hun eiwitten, organellen hebben ontwikkeld speciale kwaliteitscontrole mechanismen, die kunnen voelen verkeerd gevouwen eiwitten en activeren van een stress reactie in een poging om de stress te verlichten in dat compartiment. De cytosol is bijvoorbeeld afhankelijk van de hitteschokrespons (HSR), terwijl het endoplasmatische reticulum (ER) en mitochondriën afhankelijk zijn van hun compartimentspecifieke ontvouwde eiwitrespons (UPR). De OxSR dient om de toxische effecten van reactieve zuurstofsoorten (ROS) te verlichten. Elke stressreactie wordt geactiveerd in aanwezigheid van cellulaire uitdagingen en milieubeledigingen en induceert een op maat gemaakte transcriptiereactie. De kenmerken van deze reacties omvatten het synthetiseren van moleculen die verkeerd gevouwen eiwitten (zoals chaperonen) opnieuw vouwen die gericht zijn op de juiste organelle, of als alternatief beschadigde eiwitten verwijderen door eiwitafbraak. Het niet activeren van deze stressreacties resulteert in accumulatie van beschadigde eiwitten, cellulaire disfunctie die wordt gepropageerd tot systemisch falen van weefsels en uiteindelijk de dood van het organisme. De functie en regulering van de verschillende stressreacties worden elders herzien1.
Veel inzichten met betrekking tot de regulering en activiteit van cellulaire stress reacties zijn toegeschreven aan de nematode, Caenorhabditis elegans, een meercellig model organisme in genetisch onderzoek. Nematoden maken het niet alleen mogelijk om stressreacties op cellulair niveau te bestuderen, maar ook op het organismeniveau; nematoden zijn gebruikt om de effecten van genetische verstoringen of blootstelling aan drugs en verontreinigende stoffen op hun groei en overleving te bestuderen. Hun snelle generatie tijd, isogene, transparantie, genetische traktaat, en gebruiksgemak tijdens experimenten maken ze ideaal voor dergelijke studies. Bovendien maken de relatief snelle fysiologische reactie op stress (tussen uren en een paar dagen) en de evolutionaire conservering van cellulaire paden nematoden een prominent hulpmiddel bij het bestuderen van stressbestendigheid.
Er zijn twee veelgebruikte E. coli stammen gebruikt als een voedselbron om Te groeien C. elegans: standaard OP50, een B-stam waarin de meeste experimenten is historisch uitgevoerd2 en HT115, een K-12 stam die wordt gebruikt voor bijna alle RNAi experimenten3,4. Het is belangrijk op te merken dat er aanzienlijke verschillen zijn tussen OP50 en HT115 bacteriële diëten. Groei op deze verschillende bacteriële bronnen is aangetoond dat grote verschillen in metabolisch profiel veroorzaken, mitochondriale DNA-kopie nummer, en een aantal belangrijke fenotypes, waaronder levensduur5. Sommige van deze verschillen worden toegeschreven aan vitamine B12-tekort geassocieerd met groei op OP50-bacteriën, wat kan resulteren in defecten in mitochondriale homeostase en verhoogde gevoeligheid voor ziekteverwekkers en spanningen. Al deze fenotypes zijn aangetoond te worden verlicht door de groei op HT115 bacteriën, die hogere niveaus van vitamine B126hebben. Daarom wordt aanbevolen dat alle experimenten op fysiologische stressreacties worden uitgevoerd op HT115-bacteriën, ongeacht de noodzaak van RNAi-aandoeningen. Echter, vanwege het gemak van het onderhoud van dieren op OP50, alle standaard groei (dat wil zeggen, onderhoud en versterking van dieren) kan worden uitgevoerd op OP50, als significante verschillen in de experimentele paradigma's hier beschreven werden niet gedetecteerd in wormen gehandhaafd op OP50, zolang ze werden verplaatst naar HT115 post synchronisatie (dat wil zeggen, van luik post-bleken met of zonder L1 arresteren) tot experimenten.
Hier wordt de karakterisering van de activiteit van cellulaire stressreacties met behulp van twee functionele methoden beschreven. Opgemerkt moet worden dat de gepresenteerde protocollen voornamelijk gericht zijn op cellulaire stressreacties en hun impact op eiwithomeostase. Ten eerste, fluorescerende transcriptie verslaggevers worden gebruikt, die worden gereguleerd door endogene genpromotoren die specifiek worden geactiveerd in reactie op verschillende cellulaire spanningen. Deze fluorescerende transcriptie verslaggevers zijn gebaseerd op de transcriptie-inductie van specifieke genen die inheems deel uitmaken van de stress respons. HSP-4, een hitteshockeiwit orthologous voor de menselijke chaperonne HSPA5/BiP, wordt bijvoorbeeld geactiveerd bij ER-stress en lokaliseert naar de ER om de stress te verlichten. In omstandigheden van ER-stress (bijvoorbeeld blootstelling aan tunicamycine), wordt een groen fluorescerend eiwit (GFP), geplaatst onder de verordening van de hsp-4 promotor, gesynthetiseerd in hoge niveaus zoals kan worden beoordeeld door fluorescerende microscopie of kwantitatief gemeten met behulp van grote deeltjesstroomcytometrie van nematoden7. Op dezelfde manier wordt de promotor van een mitochondriale chaperonne, hsp-6 (orthologous tot zoogdier HSPA9), gebruikt om de activering van de UPRMT8te controleren , en de promotor van de cytosolic chaperonne hsp-16.2 (orthologous voor de menselijke kristalline alfagenen) wordt gebruikt voor de beoordeling van de activiteit van de HSR9. Deze verslaggevers laten een snelle karakterisering van de trajecten geactiveerd in reactie op verschillende verstoringen.
Vaak worden de hier gepresenteerde verslaggevers afgebeeld met behulp van microscopie, die een kwalitatieve output van de activering van stressreacties biedt. Hoewel beeldvormingstechnieken zowel informatie geven over de intensiteit als de weefsellocatie van de hierboven beschreven verslaggevers, is de kwantificering niet altijd nauwkeurig of robuust. Hoewel het mogelijk is om fluorescerende activering te kwantificeren met behulp van imaging analyse tools, deze methoden zijn relatief lage doorvoer en steekproef grootte is klein, als gevolg van het relatief lage aantal dieren afgebeeld. Het gemak en de mogelijkheid om grote hoeveelheden dieren snel te verkrijgen maken C. elegans een ideaal model systeem om de activering van fluorescerende stress verslaggevers test door het gebruik van een grote deeltjesstroom cytometer. Een cytometer met grote deeltjesstroom is in staat om op te nemen, te analyseren en te sorteren op basis van grootte en fluorescentie van veel levende dieren. Met behulp van deze methode is het mogelijk om de fluorescerende intensiteit, grootte en ook ruimtelijke (2D) informatie te krijgen voor duizenden wormen. Het systeem wordt aangestuurd met Behulp van FlowPilot, die het mogelijk maakt voor real-time data-acquisitie en analyse van de gemeten parameters. Hier worden methoden voor zowel microscopische beeldvorming als kwantitatieve analyse met behulp van een cytometer met grote deeltjesstroom aangeboden als methoden om de activering van stressreacties te meten.
Naast reporter analyse, de gevoeligheid of weerstand van dieren tegen stress kan worden gemeten met behulp van fysiologische stress testen. Dit wordt bereikt door dieren bloot te stellen aan stressvolle omgevingen die specifieke cellulaire stresspaden activeren. Hier worden verschillende methoden verstrekt om de gevoeligheid van hele dieren voor specifieke soorten stressoren te meten.
ER-stress wordt toegepast op C. elegans met behulp van het chemische middel, tunicamycine, dat N-gekoppelde glycosylation blokkeert, waardoor ophoping van verkeerd gevouwen eiwitten in de ER10ontstaat. In C. elegansleidt de groei bij blootstelling aan tunicamycine tot grote verstoringen in de ER-functie en een aanzienlijk verminderde levensduur11. Door het meten van de overleving van dieren op tunicamycine-bevattende platen, er stress gevoeligheid van dieren kan worden gekwantificeerd. Bijvoorbeeld, dieren met buitenbaarmoederlijke UPRER-inductie en dus verhoogde weerstand tegen eiwit misfolding stress in de ER hebben een verhoogde overleving bij blootstelling aan tunicamycine in vergelijking met wilde dieren12.
Oxidatieve en mitochondriale stress wordt toegepast op C. elegans door dieren bloot te stellen aan het chemische middel, paraquat. Paraquat is een veel gebruikt herbicide, die superoxide vorming specifiek in de mitochondriën13veroorzaakt. Als gevolg van de specifieke lokalisatie van mitochondriën afgeleide reactieve zuurstofsoorten (ROS), paraquat tests worden vaak gebruikt als een "mitochondriale" stress test. Superoxide wordt echter snel omgezet in waterstofperoxide door mitochondriale superoxide dismutases (SOD's)14. Waterstofperoxide kan vervolgens diffuus uit de mitochondriën en oxidatieve stress veroorzaken in andere compartimenten van de cel. Daarom beschrijven we paraquat overlevingstesten als het meten van de gevoeligheid voor zowel mitochondriale als oxidatieve stress (andere oxidatieve stresstesten zijn te vinden15).
Thermotolerantie testen worden uitgevoerd in C. elegans door het plaatsen van dieren in verhoogde temperaturen. De omgevingstemperaturen voor aaltjes zijn ~15-20 °C en thermische belasting wordt veroorzaakt bij temperaturen boven 25 °C16,17. Thermotolerantietesten worden over het algemeen uitgevoerd bij temperaturen variërend van 30-37 °C, omdat dieren grote cellulaire defecten vertonen bij deze temperatuur en overlevingstests binnen 24 uur16,18worden voltooid. Hier zijn twee alternatieve methoden voorzien voor het uitvoeren van thermotolerantietests: groei bij 34 °C en groei bij 37 °C. Samen kunnen de hier gepresenteerde protocollen worden gebruikt om grootschalige schermen uit te voeren in combinatie met standaard genknock-down met behulp van RNA-interferentie of chemische drugsbibliotheken.
Het protocol kan worden opgesplitst in 4 brede procedures- groei van C. elegans en voorbereiding op beeldvorming (secties 1 en 2), beeldvorming van transcriptieverslaggevers met behulp van fluorescerende microscopie (secties 3-5), kwantitatieve metingen van verslaggevers met behulp van een cytometer met grote deeltjesstroom (sectie 6) en fysiologische tests om stressgevoeligheid te meten in C. elegans (sectie 7).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>for mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118072</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco granulated agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-782</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>C0051-25</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>350-5000-000</td>
			<td>equipped with a 488 nm light source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Cleaning Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5072-000</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Sheath Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5070-100</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG dioxane free</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>CI8280-4</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426500</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M205FA stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450040</td>
			<td>equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0070-3</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>75990-514</td>
			<td>equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289-50G</td>
			<td>for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tert-butyl hydroperoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>458139</td>
			<td>for oxidative stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660-5G</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurements of physiological stress responses in c. elegans

Organismen worden vaak blootgesteld aan fluctuerende omgevingen en veranderingen in intracellulaire homeostase, die schadelijke effecten kunnen hebben op hun proteome en fysiologie. Zo hebben organismen ontwikkeld gerichte en specifieke stress reacties gewijd aan schade te herstellen en te handhaven homeostase. Deze mechanismen omvatten de ontvouwde eiwitrespons van het endoplasmatische reticulum (UPRER),de ontvouwde eiwitrespons van de mitochondriën (UPRMT),de hitteschokrespons (HSR) en de oxidatieve stressrespons (OxSR). De hier gepresenteerde protocollen beschrijven methoden om de activering van deze trajecten en hun fysiologische gevolgen in de nematode, C. elegans, te detecteren en te karakteriseren. Ten eerste wordt het gebruik van trajectspecifieke fluorescerende transcriptieverslaggevers beschreven voor snelle cellulaire karakterisering, medicijnscreening of grootschalige genetische screening (bijvoorbeeld RNAi of gemuteerde bibliotheken). Daarnaast worden complementaire, robuuste fysiologische testen beschreven, die kunnen worden gebruikt om de gevoeligheid van dieren voor specifieke stressoren direct te beoordelen, wat dient als functionele validatie van de transcriptieverslaggevers. Samen maken deze methoden een snelle karakterisering van de cellulaire en fysiologische effecten van interne en externe proteotoxische verstoringen mogelijk.

Met behulp van transcriptie verslaggevers om activering van stress reacties te meten Hier worden fluorescerende transcriptieverslaggevers gebruikt, die dienen als robuuste instrumenten om de activering van de meeste stressreacties in C. elegans te meten. GFP-expressie wordt gedreven onder de promotor van canonieke doelen van master transcriptional regulators die betrokken zijn bij het reageren op compartimentspecifieke spanningen. Een uitgebreide lijst van vee...

Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Hier karakteriseren we cellulaire proteotoxische stressreacties in de nematode C. elegans door het meten van de activering van fluorescerende transcriptieverslaggevers en assaying gevoeligheid voor fysiologische stress.

Metingen van fysiologische stressreacties in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Deze methoden kunnen worden gebruikt om stressreacties in C.elegans te karakteriseren en om te bepalen of genetische of farmacologische verstoringen de activering van beschermende cellulaire paden beïnvloeden. Deze methoden maken snelle en hoge doorvoer testen van honderden verstoringen, zoals gen knockdown zowel op de moleculaire en fysiologische niveaus. Om ervoor te zorgen dat de test correct wordt uitgevoerd, omvatten positieve en negatieve controles.Synchroniseer gezonde, goed gevoede dieren tot het juiste stadium en gebruik verse platen voor het experiment. Visualisatie van micromanipulatie van de wormen met een pick kan nieuwe gebruikers helpen begrijpen hoe de wormen kunnen worden opgesteld en beoordeeld op levensvatbaarheid. Het aantonen van de procedures zal Worden Phil Frankino, Holly Gildea, en Melissa Metcalf, afgestudeerde studenten in ons laboratorium.Om dieren te gebruiken die GFP uitdrukken onder de promotor van het hitteshockeiwit vier voor activering van het endoplasmische reticulum ontvouwde eiwitrespons, kweek je gesynchroniseerde reporterdieren bij 20 graden Celsius tot de L4-fase en was je de wormen van de plaat met M9-medium en breng je over in een buis. Na het verzamelen van de wormen door centrifugatie, vervang de M9 met 25 nanogram per milliliter van het geneesmiddel van belang in M9 of dimethylsulfoxide in M9 in de controle dierlijke buizen. Plaats de wormen vervolgens drie tot vier uur op een roterend platform bij 20 graden Celsius.Aan het einde van de incubatie, centrifugeren de wormen te vestigen voor het vervangen van de behandeling oplossing met 15 milliliter M9 alleen. Breng de dieren na twee wasbeurten naar NGM-platen of NGM RNA-interferentieplaten over en laat de wormen zich 's nachts herstellen bij 20 graden Celsius. Wanneer de wormen zijn hersteld, voeg vijf tot 10 microliter van 100 millimolar natrium azide op een standaard NGM plaat zonder bacteriën en plaats een plaat van wormen onder een ontleden microscoop.Breng 10 tot 20 dieren van de plaat naar de plek van natriumaedide. De dieren zouden beweging kort na het landen in de zoute oplossing moeten grijpen. Zodra het natriumaside is verdampt, zet de dieren in de gewenste beeldvormingsopstelling met de voorste en achterste zijden in dezelfde oriëntatie voor alle dieren en plaats onmiddellijk de plaat van dieren onder een stereomicroscoop.Start de stereomicroscoop beeldsoftware en klik onder het tabblad overnames op projecten openen en mappen om een nieuw project te openen. Klik met de rechtermuisknop en selecteer de naam om de naam van de map te wijzigen. Plaats het wormmonster onder de microscoopdoelstelling en gebruik de instelling Brightfield om het juiste brandpunt van de wormen te lokaliseren om fluorescerende bleken te minimaliseren.Het midden van het monster zal het punt zijn waarop de lijn van eieren duidelijk zichtbaar is en niet wazig. Stel de belichtingstijd in om ervoor te zorgen dat pixels niet verzadigd zijn en ook om ervoor te zorgen dat het signaal boven de detectielimiet ligt. Nadat u de belichtingstijd, zoom, focus en Brightfield-condensatoren hebt ingesteld op de juiste instellingen, klikt u op de knop opnameafbeelding om een afbeelding te verkrijgen.Voor beeldvorming met behulp van een samengestelde breedveldmicroscoop, plaats de baseline controle behandeling plaat op de samengestelde breedveld microscoop stadium en gebruik het touchpad om de controle programma te starten. Maak een nieuw album en bestandsnaam en plaats de plaat onder de objectieve lens. Gebruik de basislijnregeling en positieve controleplaten om de belichtingstijd en fluorescentieintensiteit zo in te stellen dat het signaal zichtbaar is, maar niet verzadigd.Sla vervolgens Brightfield- en GFP FITC-afbeeldingen op. Om de inductie van de verslaggever te kwantificeren door grote deeltjesstroomcytometrie, zet u eerst de cytometerlasers aan en open u de cytometersoftware. Klik op start om de lasers in het softwarevenster in te schakelen en klik op uitvoeren om de laser te starten in het pop-upvenster voor argonlaserbesturing.Wanneer de laser bereikt ongeveer 12 milliwatt en de 488 lichtbron niveau gaat tot ongeveer 12, klik gedaan en controleer de vier drukwaarden. Als de waarden lijken op die in de oorspronkelijke installatie, schakelt u het vak druk OK in. Vervolgens, om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen of puin blokkeren van de stroom van schede en monster door de stroomcel, klik op schoon meerdere malen.Schakel vervolgens de sorteer en schede uit om de stroom opnieuw op te starten. Om de stroomsnelheid te controleren, verzamelt u de schede gedurende 60 seconden. Verzamel de schede in een 15 milliliter buis gedurende 60 seconden.De stroomsnelheid moet negen tot 10 milliliter per minuut zijn. Om de monsters uit te voeren, past u het laserfotomultipliervermogen aan op een niveau dat hoog genoeg is dat het signaal boven de detectielimiet ligt, maar niet hoger is dan de verzadigingslimiet. Voer grootte gating uit om bellen, puin, eieren en andere ongewenste kleine deeltjes uit te sluiten en alleen de dieren van belang, zoals volwassenen, op te nemen.Wanneer de screening parameters zijn ingesteld, voeg de voorbereide wormen aan een kopje en klik verwerven. Kijk om ervoor te zorgen dat alle vloeistof niet wordt opgenomen in de machine als dit zal leiden tot de stroom cytometer te nemen in de lucht en bellen te creëren in de detector. Wanneer het monster laag is en/of er voldoende dieren zijn verzameld, klikt u op Stop.Als u gated-gegevens wilt opslaan op basis van de groottebeperkingen, klikt u op instellen, gegevensopslag, alleen gated en slaat u gated op om de gegevens op te slaan. Spoel vervolgens de opvangbeker met gedeïoniseerd water en verwijder de was drie keer vacuüm voordat u de analyse met het volgende monster herhaalt. Om de mitochondriale en oxidatieve stressgevoeligheid te meten, voeg 50 tot 75 microliter paraquat in M9 toe aan acht tot 10 putten per toestand van een platte bodem 96-put plaat en breng acht tot 10 wormen per aandoening over naar elke put van Paraquat.Tik om de twee uur zachtjes op de plaat om de levende dieren te laten thrash of buigen om het aantal dode dieren per put te kunnen scoren. Om de temperatuurgevoeligheid van de dieren te meten, broedt u de wormen gedurende drie tot vier dagen bij 20 graden Celsius voordat 10 tot 15 dieren per plaat per plaat per voorwaarde worden ingeperkt voor een totaal van vier tot zes platen. Plaats vervolgens de platen in een 34 of 37 graden Celsius incubator en scoor de worm overleven om de twee uur zoals net aangetoond.De hsp-4 reporter heeft minimale basale indruk bij afwezigheid van stress, maar vertoont een robuuste GFP-expressie wanneer de dieren worden blootgesteld aan endoplasmische reticulumstress met behulp van het medicijn Tunicamycine. Deze verschillen kunnen ook worden gekwantificeerd met behulp van een grote deeltjesstroom cytometer. Bovendien kan de inductie van het transgene onder endoplasmische reticulumstress volledig worden onderdrukt door het uitschakelen van XBP-1 via RNA-interferentie.Soortgelijke tests kunnen worden uitgevoerd om mitochondriale stress, oxidatieve stress en hittestress te meten. Hele dierlijke fysiologische reacties op stress kunnen ook worden gemeten met behulp van verschillende overlevingstesten. Blootstelling aan Tunicamycine wordt bijvoorbeeld gebruikt om de gevoeligheid van endoplasmatische reticulumstress te meten.De knockdown van het XBP-1 gen resulteert in een significante toename van de gevoeligheid voor Tunicamycine. Bovendien wordt blootstelling aan het chemische agens Paraquat gebruikt om oxidatieve en mitochondriale stressgevoeligheid te meten. Het uitschakelen van het DAF-2 gen resulteert in een aanzienlijke toename van de weerstand tegen Paraquat.Thermotolerance kan worden gemeten door het bepalen van de overleving van dieren bij verhoogde temperaturen en kan worden uitgezet als een overlevingscurve. Deze tests moeten ten minste vier tot zes keer worden uitgevoerd en alle replica's moeten tegen elkaar worden uitgezet, aangezien thermotolerantie een ongelooflijk hoge variabiliteit aantoont in vergelijking met andere stresstesten. Bij het beeldvorming van dieren is het van cruciaal belang om de parameters zodanig in te stellen dat er geen over- of onder verzadiging van het signaal is en ervoor te zorgen dat dezelfde parameters tijdens het hele experiment worden gebruikt.De hier beschreven beeldvormingsprotocollen zijn vatbaar voor grootschalige screening, waaronder genoombrede schermen en zijn zeer geschikt voor zowel verkennende als bevestigende studies die vervolgens kunnen worden opgevolgd door de beschreven fysiologische tests.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generatie van Stable transgene C. elegans Met behulp van micro-injectie

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Monitoring plantenhormonen tijdens stress Reacties

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generatie van transgene C. elegans Door biolistische Transformatie

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

Linking predatierisico, Herbivore fysiologische stress-en Microbiële afbraak van Plant Litter

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antilichaamkleuring in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Een &#39;Freeze-Cracking &quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Een Anoxia-verhongering Model voor ischemie / reperfusie in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methoden voor de huid De verwondingen en Testen voor Wond Reacties in<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methoden om subcellulaire compartimenten van Muscle beoordelen<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...