Name: measurements of physiological stress responses in c. elegans
Uploaded: 2020-05-21T13:30:00
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R.BZ. est soutenue par la bourse à long terme de l’EMBO et la Fondation Larry L. Hillblom. R.H.S est soutenu par une subvention 5F32AG032023-02 par l’intermédiaire du National Institute of Aging (NIA) et de la Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship. A.F. est soutenu par la subvention F32AG051355 par l’intermédiaire de la NIA. H.K.G. est appuyé par une subvention DGE1752814 par l’entremise du Programme de bourses de recherche supérieures de la National Science Foundation. M.G.M. est soutenu par 1F31AG060660-01 par NIA. A.D. est soutenu par la Fondation Thomas et Stacey Siebel, le Howard Hughes Medical Institute et 4R01AG042679-04 et 5R01AG05891-02 de NIA, et 5R01ES021667-09 de NIEHS. Nous remercions Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet et Anel Esquivel pour leur aide technique importante. Nous remercions le laboratoire Morimoto et la CCG (financé par le Bureau de l’infrastructure de recherche des NIH P40 OD010440) pour ses souches.

1. Conditions de croissance standard des températures et OP50 vs HT115
<ol><li>Croissance et expansion standard<ol>
<li>Développer une culture d’OP50 en LB(tableau 1) ou des supports équivalents de choix pour 24-48 h à température ambiante (22-25 oC). Cultivez des bactéries à température ambiante car OP50 est un uracil auxotroph et il y a une incidence plus élevée de réversants (p. ex., mutants suppresseurs) lorsqu’ils sont cultivés à 37 oC. Le stockage à long terme des cultures OP50 ...

Ici, des méthodes pour interroger les réponses de stress cellulaire dans C. elegans, utilisant des reporters transcriptionnels fluorescents et des essais physiologiques de survie de stress sont décrits. Les journalistes utilisent tous l’expression GFP entraînée sous le promoteur d’une cible transcriptionnelle en aval des facteurs de transcription impliqués dans l’augmentation des réponses de stress cellulaire. L’utilisation de hsp-4p::GFP modulé par XBP-1s-mediated UPRER, ...

La capacité d’un organisme à réagir aux changements dans l’environnement intra- et extracellulaire est cruciale pour sa survie et son adaptation. Ceci est accompli au niveau cellulaire par de nombreuses voies protectrices qui assurent l’intégrité de la cellule. Tandis que de nombreux composants cellulaires sont sujets à des dommages liés au stress, une participation importante des réponses de stress cellulaire est de réparer et de protéger l’homéostasie du protéome cellulaire. Cependant, la compartimentation des protéines en structures spéciales, appelées organites, pose un défi pour la cellule, car elle ne peut pas compter sur une forme centralisée de contrôle de la qualité des protéines pour s’assurer que toutes les protéines de la cellule sont correctement pliées et fonctionnelles. Par conséquent, pour faire face aux perturbations de leurs protéines, les organites ont développé des mécanismes de contrôle de la qualité dédiés, qui peuvent détecter les protéines mal repliées et activer une réponse au stress dans une tentative d’alléger le stress dans ce compartiment. Par exemple, le cytosol repose sur la réponse au choc thermique (HSR), tandis que le réticulum endoplasmique (ER) et les mitochondries s’appuient sur leurs réponses protéiques dépliées spécifiques à leur compartiment (UPR). L’OxSR sert à atténuer les effets toxiques des espèces réactives d’oxygène (ROS). Chaque réponse au stress est déclenchée en présence de défis cellulaires et d’insultes environnementales et induit une réponse transcriptionnelle sur mesure. Les caractéristiques de ces réponses comprennent la synthèse des molécules qui replient les protéines mal repliées (comme les chaperons) ciblées sur l’organelle appropriée, ou alternativement, enlever les protéines endommagées par la dégradation des protéines. L’omission d’activer ces réponses de stress entraîne l’accumulation de protéines endommagées, le dysfonctionnement cellulaire propagé à l’échec systémique des tissus, et finalement la mort de l’organisme. La fonction et la régulation des différentes réponses au stress sont examinées ailleurs1.
De nombreuses idées concernant la régulation et l’activité des réponses au stress cellulaire ont été attribuées au nématode, Caenorhabditis elegans, un organisme modèle multicellulaire dans la recherche génétique. Les nématodes permettent non seulement d’étudier l’activation des réponses au stress au niveau cellulaire, mais aussi au niveau de l’organisme; nématodes ont été utilisés pour étudier les effets des perturbations génétiques ou de l’exposition à des médicaments et des polluants sur leur croissance et leur survie. Leur temps de génération rapide, l’isogeny, la transparence, la tractabilité génétique et la facilité d’utilisation pendant l’expérimentation les rendent idéaux pour de telles études. En outre, la réponse physiologique relativement rapide au stress (entre les heures et quelques jours) et la conservation évolutive des voies cellulaires font des nématodes un outil important dans l’étude de la résistance au stress.
Il existe deux souches E. coli couramment utilisées comme source de nourriture pour cultiver des C. elegans: op50 standard, une souche B dans laquelle la plupart des expérimentations ont été historiquement effectuées2 et HT115, une souche K-12 qui est utilisée pour presque toutes les expériences RNAi3,4. Il est important de noter qu’il existe des différences significatives entre les régimes bactériens OP50 et HT115. La croissance sur ces différentes sources bactériennes a été montrée pour causer des différences importantes dans le profil métabolique, le numéro de copie d’ADN mitochondrial, et plusieurs phénotypes principaux, y compris la durée de vie5. Certaines de ces différences sont attribuées à l’insuffisance de vitamine B12 associée à la croissance sur les bactéries OP50, qui peuvent entraîner des défauts dans l’homéostasie mitochondriale et une sensibilité accrue aux agents pathogènes et aux stress. Tous ces phénotypes ont été montrés pour être atténués par la croissance sur les bactéries HT115, qui ont des niveaux plus élevés de vitamine B126. Par conséquent, il est recommandé que toutes les expériences sur les réponses physiologiques au stress soient effectuées sur les bactéries HT115, indépendamment de la nécessité des conditions d’ARNi. Cependant, en raison de la facilité de maintenir les animaux sur OP50, toute la croissance standard (c.-à-d. l’entretien et l’amplification des animaux) peuvent être effectuées sur OP50, car des différences significatives dans les paradigmes expérimentaux décrits ici n’ont pas été détectées dans les vers maintenus sur OP50 tant qu’ils ont été déplacés à la synchronisation post HT115 (c.-à-d., de l’éclosion après le blanchiment ou sans arrestation L1) jusqu’à l’expérimentation.
Ici, la caractérisation de l’activité des réponses de stress cellulaire utilisant deux méthodes fonctionnelles est décrite. Il convient de noter que les protocoles présentés sont principalement axés sur les réponses au stress cellulaire et leur impact sur l’homéostasie des protéines. Tout d’abord, les journalistes transcriptionnels fluorescents sont utilisés, qui sont réglementés par les promoteurs de gènes endogènes qui sont spécifiquement activés en réponse à différents stress cellulaires. Ces reporters transcriptionnels fluorescents sont basés sur l’induction transcriptionnelle de gènes spécifiques qui font partie indigène de la réponse au stress. Par exemple, HSP-4, une protéine de choc thermique orthologue à la chaperon humaine HSPA5/BiP, est activée sur le stress aux ER et localise aux ER pour soulager le stress. Dans les conditions de stress aux urgences (p. ex., l’exposition à la tunicamycine), une protéine fluorescente verte (GFP), placée sous la réglementation du promoteur hsp-4, est synthétisée à des niveaux élevés, comme on peut l’évaluer par microscopie fluorescente ou mesurée quantitativement à l’aide de la cytométrie du débit à grande particule des nématodes7. De même, le promoteur d’un chaperon mitochondrial, hsp-6 (orthologue au mammifère HSPA9), est utilisé pour surveiller l’activation de l’UPRMT8, et le promoteur de la chaperon cytosolique hsp-16.2 (orthologue aux gènes alpha cristalline humaine) est utilisé pour évaluer l’activité de la HSR9. Ces reporters permettent une caractérisation rapide des voies activées en réponse à diverses perturbations.
Souvent, les journalistes présentés ici sont photographiés à l’aide de microscopie, ce qui fournit une sortie qualitative de l’activation des réponses au stress. Cependant, bien que les techniques d’imagerie fournissent à la fois des informations sur l’intensité et l’emplacement des tissus des journalistes décrits ci-dessus, sa quantification n’est pas toujours exacte ou robuste. Bien qu’il soit possible de quantifier l’activation fluorescente à l’aide d’outils d’analyse d’imagerie, ces méthodes sont relativement faibles et la taille de l’échantillon est faible, en raison du nombre relativement faible d’animaux photographiés. La facilité et la capacité d’obtenir de grandes quantités d’animaux font rapidement de C. elegans un système modèle idéal pour apaiser l’activation des journalistes de stress fluorescent grâce à l’utilisation d’un cytomètre de débit de particules importante. Un cytomètre à débit à grande particule est capable d’enregistrer, d’analyser et de trier en fonction de la taille et de la fluorescence de nombreux animaux vivants. En utilisant cette méthode, il est possible d’obtenir l’intensité fluorescente, la taille, et aussi l’information spatiale (2D) pour des milliers de vers. Le système est contrôlé à l’aide de FlowPilot, qui permet l’acquisition et l’analyse en temps réel des paramètres mesurés. Ici, des méthodes d’imagerie microscopique et d’analyse quantitative à l’aide d’un cytomètre à débit à grande particule sont proposées comme méthodes pour mesurer l’activation des réponses au stress.
Au-delà de l’analyse des journalistes, la sensibilité ou la résistance des animaux au stress peut être mesurée à l’aide d’essais de stress physiologique. Ceci est réalisé en exposant les animaux à des environnements stressants qui activent des voies de stress cellulaire spécifiques. Ici, plusieurs méthodes sont fournies pour mesurer la sensibilité des animaux entiers à des types spécifiques de facteurs de stress.
Le stress d’ER est appliqué à C. elegans en utilisant l’agent chimique, tunicamycine, qui bloque la glycosylation liée au N, causant l’accumulation de protéines mal repliées dansl’ER 10. Dans C. elegans, la croissance à l’exposition à la tunicamycine entraîne des perturbations majeures dans la fonction d’ER, et une durée de vie11 considérablementdiminuée. En mesurant la survie des animaux sur les plaques contenant de la tunicamycine, la sensibilité au stress des animaux aux ER peut être quantifiée. Par exemple, les animaux atteints d’induction ectopiqued’ER UPR et donc d’une résistance accrue au stress de mauvais recul des protéines aux repli sur les ER ont une survie accrue lors de l’exposition à la tunicamycine par rapport aux animaux de type sauvage12.
Le stress oxydatif et mitochondrial est appliqué à C. elegans en exposant les animaux à l’agent chimique, paraquat. Paraquat est un herbicide couramment utilisé, qui provoque la formation de superoxyde spécifiquement dans les mitochondries13. En raison de la localisation spécifique des espèces réactives d’oxygène (ROS) dérivées des mitochondries, les essais de parquat sont souvent utilisés comme un essai de stress « mitochondrial ». Cependant, le superoxyde est rapidement converti en peroxyde d’hydrogène par des dismutases mitochondriales de superoxyde (SOD)14. Le peroxyde d’hydrogène peut par la suite se diffuser hors des mitochondries et causer un stress oxydatif dans d’autres compartiments de la cellule. Par conséquent, nous décrivons les essais de survie parquat comme mesurant la sensibilité au stress mitochondrial et oxydatif (d’autres essais de stress oxydatif peuvent être trouvés15).
Les essais de thermotolerance sont effectués à C. elegans en plaçant les animaux à des températures élevées. Les températures ambiantes pour les nématodes sont de 15 à 20 oC et le stress thermique est induit à des températures supérieures à 25 oC16,17. Les essais de thermotolerance sont généralement effectués à des températures allant de 30-37 oC, car les animaux présentent des défauts cellulaires majeurs à cette température, et les essais de survie sont effectués dans les 24 heures16,18. Ici, deux autres méthodes sont fournies pour effectuer des essais de thermotolerance : la croissance à 34 oC et la croissance à 37 oC. Ensemble, les protocoles présentés ici peuvent être utilisés pour effectuer des écrans à grande échelle lorsqu’ils sont combinés avec le gène standard knock-down à l’aide d’interférences d’ARN ou de bibliothèques de médicaments chimiques.
Le protocole peut être divisé en 4 procédures générales - la croissance de C. elegans et la préparation pour l’imagerie (sections 1 et 2), l’imagerie des journalistes transcriptionnels à l’aide de microscopie fluorescente (sections 3-5), des mesures quantitatives des journalistes à l’aide d’un cytomètre à flux à grande particule (section 6), et des essais physiologiques pour mesurer la sensibilité au stress dans C. elegans (section 7).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>for mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118072</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco granulated agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-782</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>C0051-25</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>350-5000-000</td>
			<td>equipped with a 488 nm light source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Cleaning Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5072-000</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Sheath Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5070-100</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG dioxane free</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>CI8280-4</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426500</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M205FA stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450040</td>
			<td>equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0070-3</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>75990-514</td>
			<td>equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289-50G</td>
			<td>for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tert-butyl hydroperoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>458139</td>
			<td>for oxidative stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660-5G</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurements of physiological stress responses in c. elegans

Les organismes sont souvent exposés à des environnements fluctuants et à des changements dans l’homéostasie intracellulaire, ce qui peut avoir des effets néfastes sur leur protégé et leur physiologie. Ainsi, les organismes ont développé des réponses ciblées et spécifiques au stress dédiées à réparer les dommages et à maintenir l’homéostasie. Ces mécanismes comprennent la réponse protéique dépliée du réticulum endoplasmique (UPRER), la réponse protéique dépliée des mitochondries (UPRMT),la réponse de choc thermique (HSR), et la réponse oxydative de stress (OxSR). Les protocoles présentés ici décrivent des méthodes pour détecter et caractériser l’activation de ces voies et leurs conséquences physiologiques dans le nématode, C. elegans. Premièrement, l’utilisation de reporters transcriptionnels fluorescents spécifiques à la voie est décrite pour la caractérisation cellulaire rapide, le dépistage des médicaments ou le dépistage génétique à grande échelle (p. ex., RNAi ou bibliothèques mutantes). En outre, des tests physiologiques complémentaires et robustes sont décrits, qui peuvent être utilisés pour évaluer directement la sensibilité des animaux à des facteurs de stress spécifiques, servant de validation fonctionnelle des reporters transcriptionnels. Ensemble, ces méthodes permettent une caractérisation rapide des effets cellulaires et physiologiques des perturbations protéotoxiciques internes et externes.

Utilisation de reporters transcriptionnels pour mesurer l’activation des réponses au stress Ici, les reporters transcriptionnels fluorescents sont utilisés, qui servent d’outils robustes pour mesurer l’activation de la plupart des réponses au stress dans C. elegans. L’expression GFP est conduite sous le promoteur de cibles canoniques des régulateurs transcriptionnels principaux impliqués dans la réponse aux contraintes spécifiques aux compartime...

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Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Ici, nous caractérisons les réponses de stress protéotoxiciques cellulaires dans le nématode C. elegans en mesurant l’activation des reporters transcriptionnels fluorescents et en assayant la sensibilité au stress physiologique.

Mesures des réponses physiologiques au stress à C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Ces méthodes peuvent être utilisées pour caractériser les réponses au stress chez C.elegans et pour déterminer si les perturbations génétiques ou pharmacologiques affectent l’activation des voies cellulaires protectrices. Ces méthodes permettent des tests rapides et à haut débit de centaines de perturbations telles que le renversement de gènes à la fois sur les niveaux moléculaire et physiologique. Pour s’assurer que l’analyse est effectuée correctement, inclure des contrôles positifs et négatifs.Synchronisez les animaux sains et bien nourris au bon stade et utilisez des assiettes fraîches pour l’expérience. La visualisation de la micromanipulation des vers à l’aide d’un pic peut aider les nouveaux utilisateurs à comprendre comment les vers peuvent être alignés et évalués pour leur viabilité. Phil Frankino, Holly Gildea et Melissa Metcalf, étudiants diplômés de notre laboratoire, démontreront les procédures.Utiliser des animaux exprimant le GFP sous le promoteur de la protéine de choc thermique quatre pour l’activation du réticulum endoplasmique a déplié la réponse protéique, cultiver des animaux de reporter synchronisés à 20 degrés Celsius jusqu’au stade L4 et laver les vers de la plaque à l’aide du milieu M9 et transférer dans un tube. Après avoir recueilli les vers par centrifugation, remplacer le M9 par 25 nanogrammes par millilitre du médicament d’intérêt dans M9 ou le sulfure de diméthyle dans M9 dans les tubes animaux de contrôle. Placez ensuite les vers sur une plate-forme rotative pendant trois à quatre heures à 20 degrés Celsius.À la fin de l’incubation, centrifuger les vers pour qu’ils s’installent avant de remplacer la solution de traitement par 15 millilitres de M9 seulement. Après deux lavages, transférez les animaux dans des plaques NGM ou des plaques d’interférence de l’ARN NGM, le cas échéant, et laissez les vers se rétablir pendant la nuit à 20 degrés Celsius. Lorsque les vers se sont rétablis, ajouter de cinq à dix microlitres d’azide de sodium de 100 millimlaires sur une plaque NGM standard sans bactéries et placer une plaque de vers sous un microscope disséquant.Transférer 10 à 20 animaux de l’assiette dans l’endroit de l’azide de sodium. Les animaux doivent saisir le mouvement peu de temps après l’atterrissage dans la solution de sel. Une fois que l’azide de sodium s’est évaporé, alignez les animaux dans la configuration d’imagerie désirée avec les côtés antérieur et postérieur dans la même orientation pour tous les animaux et placez immédiatement la plaque des animaux sous un microscope stéréo.Lancez le logiciel d’imagerie au microscope stéréo et sous l’onglet acquisitions, cliquez sur projets ouverts et dossier pour ouvrir un nouveau projet. Cliquez à droite et sélectionnez renommer pour renommer le dossier. Placez l’échantillon de ver sous l’objectif du microscope et utilisez le réglage Brightfield pour localiser le point focal correct des vers afin de minimiser le blanchiment fluorescent.Le centre de l’échantillon sera le point où la ligne des œufs est clairement visible et non floue. Définissez le temps d’exposition pour vous assurer que les pixels ne sont pas saturés et aussi pour vous assurer que le signal est au-dessus de la limite de détection. Après avoir con réglage le temps d’exposition, le zoom, la mise au point et les condenseurs Brightfield aux paramètres appropriés, cliquez sur le bouton image de capture pour acquérir une image.Pour l’imagerie à l’aide d’un microscope composé à champ large, placez la plaque de traitement de contrôle de base sur l’étape du microscope composé à champ large et utilisez la tablette tactile pour lancer le programme de contrôle. Créez un nouvel album et un nouveau nom de fichier et placez la plaque sous l’objectif objectif. Utilisez le contrôle de base et les plaques de contrôle positives pour définir le temps d’exposition et l’intensité de la fluorescence afin que le signal soit visible mais non saturé.Enregistrez ensuite les images Brightfield et GFP FITC. Pour quantifier l’induction du journaliste par cytométrie du flux de particules, allumez d’abord les lasers cytométriques et ouvrez le logiciel cytomètre. Cliquez sur commencer à activer les lasers dans la fenêtre logicielle et cliquez sur exécuter pour lancer le laser dans la fenêtre popup de contrôle laser argon.Lorsque le laser atteint environ 12 milliwatts et le niveau de source lumineuse 488 monte à environ 12, cliquez sur fait et vérifiez les quatre valeurs de pression. Si les valeurs ressemblent à celles observées dans la configuration d’origine, cochez la case OK de pression. Ensuite, pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air ou de débris bloquant l’écoulement de la gaine et de l’échantillon à travers la cellule d’écoulement, cliquez propre plusieurs fois.Puis éteignez le tri et sur la gaine pour redémarrer le flux. Pour vérifier le débit, collectez la gaine pendant 60 secondes. Recueillir la gaine dans un tube de 15 millilitres pendant 60 secondes.Le débit devrait être de neuf à 10 millilitres par minute. Pour exécuter les échantillons, réglez la puissance du photomultiplier laser à un niveau suffisamment élevé pour que le signal soit au-dessus de la limite de détection, mais pas plus élevé que la limite de saturation. Effectuez des gations de taille pour exclure les bulles, les débris, les œufs et d’autres petites particules indésirables et pour n’inclure que les animaux d’intérêt tels que les adultes.Lorsque les paramètres de criblage ont été définis, ajoutez les vers préparés à une tasse et cliquez sur acquérir. Veillez à ce que tout le liquide ne soit pas pris dans la machine car cela provoquera le cytomètre d’écoulement à prendre dans l’air et créer des bulles à l’intérieur du détecteur. Lorsque l’échantillon est faible et/ou que suffisamment d’animaux ont été prélevés, cliquez sur arrêter.Pour stocker les données saisies en fonction uniquement des contraintes de taille, cliquez sur configuration, stockage de données, uniquement fermé, et stocker fermé pour enregistrer les données. Rincez ensuite la tasse de collecte à l’eau déionisée et retirez le lavage par vide trois fois avant de répéter l’analyse avec l’échantillon suivant. Pour mesurer la sensibilité au stress mitochondrial et oxydatif, ajouter de 50 à 75 microlitres de Paraquat dans M9 à huit à 10 puits par condition d’une plaque plate à fond 96 puits et transférer de huit à dix vers par condition à chaque puits de Paraquat.Toutes les deux heures, appuyez doucement sur la plaque pour faire battre ou plier les animaux vivants afin de permettre de marquer le nombre d’animaux morts par puits. Pour mesurer la sensibilité à la température des animaux, incuber les vers pendant trois à quatre jours à 20 degrés Celsius avant de plaquer de 10 à 15 animaux par plaque par condition pour un total de quatre à six plaques. Placez ensuite les plaques dans un incubateur de 34 ou 37 degrés Celsius et marquez la survie du ver toutes les deux heures comme nous venons de le démontrer.Le journaliste hsp-4 a une impression basale minimale en l’absence de stress, mais présente une expression GFP robuste lorsque les animaux sont exposés à un stress endoplasmique reticulum en utilisant le médicament Tunicamycin. Ces différences peuvent également être quantifiées à l’aide d’un cytomètre à flux de particules important. En outre, l’induction du transgène sous l’effort endoplasmique de réticulum peut être complètement supressed par knockdown de XBP-1 par l’interférence d’ARN.Des analyses similaires peuvent être effectuées pour mesurer le stress mitochondrial, le stress oxydatif et le stress thermique. Les réactions physiologiques des animaux entiers au stress peuvent également être mesurées à l’aide de plusieurs tests de survie. Par exemple, l’exposition à la tunicamycine est utilisée pour mesurer la sensibilité au stress réticulum endoplasmique.Le renversement du gène XBP-1 entraîne une augmentation significative de la sensibilité à la tunicamycine. En outre, l’exposition à l’agent chimique Paraquat est utilisée pour mesurer la sensibilité au stress oxydatif et mitochondrial. Le renversement du gène DAF-2 entraîne une augmentation significative de la résistance au Paraquat.La thermotolerance peut être mesurée en déterminant la survie des animaux à des températures élevées et peut être tracée comme une courbe de survie. Ces analyses doivent être effectuées au moins quatre à six fois et toutes les répliques doivent être tracées les unes contre les autres, car la thermotolerance démontre une variabilité incroyablement élevée par rapport à d’autres analyses de stress. Lors de l’imagerie des animaux, il est essentiel de définir les paramètres de manière à ce qu’il n’y ait pas de saturation totale ou sous le signal et de s’assurer que les mêmes paramètres sont utilisés tout au long de l’expérience.Les protocoles d’imagerie décrits ici sont disponibles pour le criblage à grande échelle comprenant des écrans génomiques-larges et sont grands pour des études exploratoires et confirmatoires qui peuvent alors être suivies par les analyses physiologiques décrites.

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