Name: measurements of physiological stress responses in c. elegans
Uploaded: 2020-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

R.BZ. נתמך על ידי המענק לטווח ארוך EMBO והקרן לארי ל. הילבלון. R. H. S נתמך על ידי הענקת 5F32AG032023-02 דרך המכון הלאומי להזדקנות (NIA) וקרן גלן למחקר רפואי פוסט דוקטורט. A.F. נתמך על ידי מענק F32AG051355 דרך NIA. H.K.G. נתמך על ידי גרנט DGE1752814 באמצעות תוכנית המלגות למחקר בוגר קרן המדע הלאומי. M.G.M. נתמך על ידי 1F31AG060660-01 דרך NIA. לאחר הספירה נתמכת על ידי הקרן תומס וסטייסי Siebel, המכון הרפואי הווארד יוז, ו 4R01AG042679-04 ו 5R01AG055891-02 מ NIA, ו 5R01AG055891-09 מ-בארני. אנו מודים ללארי ג'ו, מליסה סנצ'ז, נאיימי קלט ובנאל אסקוויבל לסיוע טכני משמעותי. אנו מודים למעבדת מורימוטו ו-CGC (ממומן על-ידי משרד NIH בתוכנית תשתית מחקר P40 OD010440) עבור זנים.

1. תנאי צמיחה סטנדרטיים של טמפרטורות & OP50 vs HT115
<ol><li>צמיחה והרחבה סטנדרטית<ol>
<li>לגדל תרבות של OP50 ליברות (שולחן 1) או מדיה המקבילה של בחירה עבור 24-48 h בטמפרטורת הסביבה (~ 22-25 ° c). לגדול חיידקים בטמפרטורת החדר כמו OP50 הוא מעין מהפך אורציל ו יש שכיחות גבוהה יותר של הגדלות (למשל, מוטציות מדכא) ?...

כאן, שיטות לחקור תגובות הלחץ הסלולר ב -C. אלגיה, באמצעות כתבים פלורסנט הישרדות הלחץ הפיזיולוגי ההישרדות הפיזי מתוארים. הכתבים כל לנצל את הביטוי GFP מונע תחת היזם של היעד במורד הזרם החוצה של הגורמים שעתוק המעורבים הרכבה התגובות הסלולר. השימוש hsp-4p:: GFP מאופנן על ידי xbp-1s-תיווך משנה</sup...

היכולת של אורגניזם להגיב לשינויים בסביבה הפנים והחילוץ היא חיונית להישרדותה וההסתגלות שלה. זה מושגת על רמה תאית דרך מסלולים הגנה רבים המבטיחים את שלמות התא. בעוד רכיבים סלולריים רבים כפופים נזק הקשורים למתח, מעורבות גדולה של תגובות הלחץ הסלולר היא לתקן ולהגן על הומאוסטזיס של פרוטדום הסלולר. עם זאת, ממדר של חלבונים לתוך מבנים מיוחדים, הנקראים אורגלים, מציב אתגר עבור התא, כפי שהוא לא יכול להסתמך על צורה מרכזית אחת של בקרת איכות חלבון כדי להבטיח כי כל החלבונים בתוך התא הם מקופלים ופונקציונלי כראוי. לכן, כדי להתמודד עם רטבאליות החלבונים שלהם, אורגלים התפתחו מנגנוני בקרת איכות ייעודי, אשר יכול לחוש חלבונים מקופלים ולהפעיל תגובת לחץ בניסיון להקל על הלחץ בתוך התא. לדוגמה, הציטוזול מסתמך על תגובת הלם החום (HSR), בעוד הרשתית האנדופלזמית (ER) והמיטותרפיה מסתמכים על התגובות שלהם לתאים החלבון המופרש (UPR). OxSR משמש כדי להקל על ההשפעות הרעילות של מינים חמצן תגובתי (ROS). כל תגובת מתח מופעלת בנוכחות אתגרים סלולריים ועלבונות סביבתיים ומשרה תגובה מותאמת המותאמת. הסימנים של תגובות אלה כוללים סינתזה מולקולות כי לקפל מחדש חלבונים שאינם מקופלים (כגון מלווים) מיועדים ארגונית נכונה, או לחילופין, להסיר חלבונים פגומים על ידי השפלה חלבון. אי הפעלת תגובות אלה לחץ תוצאות הצטברות של חלבונים פגומים, תפקוד הסלולר הופץ כישלון מערכתי של רקמות, ובסופו של דבר מותו של האורגניזם. הפונקציה והרגולציה של תגובות הלחץ השונות נבדקות במקומות אחרים1.
תובנות רבות לגבי הרגולציה והפעילות של התגובות לחץ הסלולר יוחסו nematode, האלגיה של Caenorditis, האורגניזם המודל הרב-תאי במחקר גנטי. מתכונדס לא רק לאפשר ללמוד את הפעלת תגובות הלחץ ברמה התאית, אלא גם ברמה ארגונית; נמטודות שימשו כדי ללמוד את ההשפעות של רטבאליות גנטית או חשיפה סמים ומזהמים על הצמיחה שלהם והישרדות. זמן הדור הזריז שלהם, הקימוט, השקיפות, הדחיפה הגנטית וקלות השימוש במהלך הניסויים, הופכים אותם לאידיאליים למחקרים כאלה. בנוסף, התגובה הפיסיולוגית מהירה יחסית למתח (בין שעות ומספר ימים) והשימור האבולוציוני של מסלולים סלולריים להפוך מכשיר בולט במחקר התנגדות לחץ.
ישנם שני זנים נפוצים E. coli המשמשים כמקור מזון לצמוח C. אלגיה: תקן OP50, מאמץ B שבו רוב הניסויים כבר בוצעה היסטורית2 ו HT115, זן K-12 המשמש כמעט כל ניסויים rnai3,4. חשוב לציין כי ישנם הבדלים משמעותיים בין OP50 ו HT115 בקטריאלי דיאטות. צמיחה על אלה מקורות חיידקיים שונים הוכח לגרום הבדלים עיקריים פרופיל מטבולית, מספר העתק מיטוכונדריאלי עותק DNA, ומספר פנוטיפים עיקריים, כולל תוחלת החיים5. חלק מההבדלים הללו מיוחסים למחסור בויטמין B12 הקשור לגידול בחיידקים OP50, אשר יכולים לגרום לפגמים בהומאוסטזיס מיטוכונדריאלי ורגישות מוגברת לפתוגנים וללחצים. כל פנוטיפים אלה הוכחו להקלה על ידי צמיחה על HT115 חיידקים, אשר יש רמות גבוהות יותר של ויטמין B126. לכן, מומלץ כי כל הניסויים על התגובות הפיזיולוגיות הלחץ להתבצע על HT115 בקטריה, ללא קשר לצורך של תנאי RNAi. עם זאת, בשל הקלות של שמירה על בעלי חיים על OP50, כל הצמיחה הסטנדרטית (כלומר, תחזוקה והגברה של בעלי חיים) ניתן לבצע על OP50, כמו הבדלים משמעותיים התפיסות הנסיוני שתוארו כאן לא זוהו תולעים המתוחזקות ב OP50 כל עוד הם הועברו לסנכרון HT115 post (כלומר, מתוך הצוהר לאחר ה
כאן, אפיון הפעילות של התגובה ללחץ הסלולר באמצעות שתי שיטות פונקציונלי מתואר. יצוין כי הפרוטוקולים המוצגים מתמקדים בעיקר בתגובות לחץ הסלולר השפעתם על הומאוסטזיס חלבון. ראשית, כתבים פלורסנט להמרה מנוצלים, אשר מוסדרים על ידי היזמים גנים אנדוגני המופעלות במיוחד בתגובה ללחצים סלולריים שונים. אלה כתבים פלורסנט מבוסס על אינדוקציה הטרנסקריפטוניים של גנים ספציפיים כי הם חלק ביסודו של תגובת הלחץ. לדוגמה, HSP-4, חלבון בהלם חום האורתוולוגי אל המלווה האנושי HSPA5/BiP, מופעל על המתח ER ומדגיש את המיון כדי להקל על הלחץ. בתנאים של מתח ER (למשל, חשיפה tunicamycin), חלבון פלורסנט ירוק (gfp), הממוקם תחת התקנה של המקדם hsp-4 , הוא מסונתז ברמות גבוהות כפי שניתן להעריך על ידי מיקרוסקופ פלורסנט או כימות באמצעות החלקיקים גדול-חלקיק cy, לנסות של נמטודות7. באופן דומה, היזם של מלווה מיטוכונדריאלי, hsp-6 (אורתוולוגי HSPA9), מנוצל כדי לפקח על ההפעלה של UprMT8, ואת המקדם של המלווה cytosolic hsp-16.2 (אורתוולוגי לגנים האנושיים crystallin alpha) משמש להערכת הפעילות של hsp9. כתבים אלה מאפשרים אפיון מהיר של המסלולים המופעלות בתגובה לרטבאליות שונות.
לעתים קרובות, הכתבים המוצגים כאן הם התמונה באמצעות מיקרוסקופ, אשר מספק פלט איכותי של הפעלת תגובות הלחץ. עם זאת, בעוד טכניקות דימות לספק הן מידע על עוצמת ומיקום הרקמה של הכתבים שתוארו לעיל, הקוונפיקציה שלה לא תמיד מדויק או חזק. אמנם ניתן לכמת הפעלת פלורסנט באמצעות כלי ניתוח הדמיה, שיטות אלה הן תפוקה נמוכה יחסית וגודל המדגם קטן, בשל מספר נמוך יחסית של בעלי חיים הדמיה. הקלות והיכולת להשיג כמויות גדולות של בעלי חיים במהירות לעשות C. אלגיה מערכת המודל האידיאלי כדי לעצב את ההפעלה של כתבים הלחץ פלורסנט דרך השימוש של זרם חלקיקים גדול cytometer. Cytometer זרם גדול חלקיקים מסוגל להקליט, ניתוח, ומיון בהתבסס על גודל וקרינה מחיות חיים רבים. באמצעות שיטה זו, ניתן לקבל את עוצמת הפלורסנט, גודל, וגם מרחבית (2D) מידע עבור אלפי תולעים. המערכת נשלטת באמצעות FlowPilot, אשר מאפשר רכישת נתונים בזמן אמת וניתוח של פרמטרים נמדד. כאן, שיטות עבור הדמיה הן מיקרוסקופיים וניתוח כמותי באמצעות cytometer החלקיקים הגדולים זרימה מוצעים כשיטות למדוד את הפעלת תגובות הלחץ.
מעבר לניתוח העיתונאי, הרגישות או ההתנגדות של בעלי חיים ללחץ ניתן למדוד באמצעות הלחץ הפיזיולוגי שאומר. זה מושגת על ידי חשיפת בעלי חיים לסביבות מלחיצות המפעילות מסלולים ספציפיים לחץ הסלולר. כאן, מספר שיטות מסופקות כדי למדוד רגישות של בעלי חיים שלמים לסוגים מסוימים של לחצים.
מתח ER מוחל על C. אלגיה באמצעות הסוכן הכימי, tunicamycin, אשר חוסם את הגליציציה מקושרת N, גרימת הצטברות של חלבונים מקופלים במיון10. ב -C. אלגיה, הגדילה על החשיפה לטונאיאמיצין גורמת לרטבאליות העיקריים בתפקוד ה-ER, ומפחיתה את תוחלת החיים11באופן משמעותי. על ידי מדידת ההישרדות של בעלי חיים על tunicamycin המכילים צלחות, ER רגישות לחץ של בעלי חיים ניתן לכמת. לדוגמה, בעלי חייםעם אינדוקציה upr חוץ רחמי ובכך התנגדות מוגברת למתח מעוות חלבונים במיון יש הישרדות מוגברת על החשיפה tunicamycin בהשוואה לחיות בר מסוג12.
לחץ חמצוני ומיטוכונדריאלי מיושם על ידי חשיפת בעלי חיים לסוכן הכימי, paraquat. Paraquat היא בשימוש נפוץ בצמחי מעשה, אשר גורמת היווצרות סופראוקסיד במיוחד המיטו,13. בשל הלוקליזציה הספציפי של מינים מסוג חמצן תגובתי (ROS), paraquat בחני משמשים לעתים קרובות בתור "מיטוכונדריאלי" שיטת הסטרס. עם זאת, סופראוקסיד הוא המרה במהירות לתוך תחמוצת מימן על ידי מיטוכונדריזה הסופראוקסיד dismutases (sods)14. מי חמצן יכול לאחר מכן לפזר מתוך המיטוגרם ולגרום ללחץ חמצוני בתאים אחרים של התא. לכן, אנו מתארים paraquat הישרדות בחני כרגישות מדידה הן מיטוכונדריאלי ומתח חמצוני (אחר לחץ חמצוני אחרים ניתן למצוא15).
מאמר התרמוסובלנות מתבצעים באמצעות הצבת בעלי חיים בטמפרטורות גבוהות. טמפרטורת הסביבה לנמטודות הם ~ 15-20 ° c ומתח תרמי מושרה בטמפרטורות מעל 25 ° c16,17. מערכות התרמוסבילות מבוצעות בדרך כלל בטמפרטורות החל מ-30-37 ° c, כאשר בעלי חיים מפגינים פגמים סלולאריים מרכזיים בטמפרטורה זו, ומספר ההישרדות הושלם בתוך 24 שעות16,18. כאן מסופקים שתי שיטות חלופיות לביצוע ביצוע: צמיחה ב34 ° c וצמיחה ב-37 ° c. יחד, הפרוטוקולים המוצגים כאן יכול להיות מנוצל כדי לבצע מסכי בקנה מידה גדול כאשר בשילוב עם הגן הסטנדרטי להפיל באמצעות RNA הפרעות או ספריות תרופות כימיות.
הפרוטוקול יכול להיות מחולק ל -4 הליכים רחבים-צמיחה של C. אלגיה והכנה להדמיה (סעיפים 1 ו-2), הדמיה של כתבים הניתנים להמרה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט (סעיפים 3-5), מדידות כמותית של כתבים באמצעות cytometer זרימה גדולה- חלקיק (סעיף 6), והפיזיולוגיה הפיסיולוגית למדידת רגישות

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>for mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118072</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco granulated agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-782</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>C0051-25</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>350-5000-000</td>
			<td>equipped with a 488 nm light source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Cleaning Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5072-000</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Sheath Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5070-100</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG dioxane free</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>CI8280-4</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426500</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M205FA stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450040</td>
			<td>equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0070-3</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>75990-514</td>
			<td>equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289-50G</td>
			<td>for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tert-butyl hydroperoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>458139</td>
			<td>for oxidative stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660-5G</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurements of physiological stress responses in c. elegans

אורגניזמים נחשפים לעתים קרובות לסביבות תנודות ושינויים בהומאוסטזיס תאיים, אשר יכול להיות השפעות מזיקות על פרוטדום ופיזיולוגיה שלהם. כך, האורגניזמים התפתחו ממוקד התגובות לחץ ספציפי מוקדש לתיקון נזק ושמירה על הומאוסטזיס. מנגנונים אלה כוללים את תגובת החלבון המופרש של הרשתית האנדופלזמית (UPRER), תגובת החלבון המופרש של המיטותרפיה (UprMT), תגובת הלם חום (hsr), ואת תגובת הלחץ חמצוני (oxsr). הפרוטוקולים המוצגים כאן מתארים שיטות לגילוי ולאפיון הפעלת מסלולים אלה ואת ההשלכות הפיזיולוגיות שלהם ב nematode, ג. אלגיה. ראשית, השימוש של כתבים מסוימים פלורסנט ההמרה מוגדר לאפיון סלולרי מהיר, הקרנת סמים, או הקרנה גנטית בקנה מידה גדול (למשל, RNAi או ספריות מוטציה). בנוסף, מתוארים הפיזיולוגיה המשלימה והאיתנה, שניתן להשתמש בה ישירות להערכת רגישות של בעלי חיים לגורמי משתמש ספציפיים, המשמשים כאימות פונקציונלי של הכתבים הטרנסקריפטלים. ביחד, שיטות אלה מאפשרות אפיון מהיר של ההשפעות הסלולר והפיסיולוגיים של רטבאליות רעילים פנימיים וחיצוניים.

שימוש בכתבי ההמרה למדידת הפעלת תגובות הסטרס כאן משמשים כתבים בעלי פלורסנט, המשמשים ככלים חזקים למדידת הפעלת רוב תגובות הסטרס בג. ביטוי GFP מונע תחת המקדם של יעדים קאנוניים של מורים מוכווני הבסיס המעורבים בתגובה ללחצים ספציפיים לחלקה. רשימה מקיפה של כתבים ב...

Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

כאן, אנו מאפיינים את התגובות הסלולר מדגיש התגובה התאית ב-נמטודות C. אלגיה על ידי מדידת ההפעלה של כתבים פלורסנט ההמרה ולומר רגישות ללחץ פיזיולוגי.

מדידות התגובות הפיזיולוגיות של הלחץ בג. אלגיה

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

שיטות אלה יכולות לשמש כדי לאפיין תגובות מתח C.elegans ולקבוע אם הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות להשפיע על ההפעלה של מסלולים הסלולר מגן. שיטות אלה מאפשרות בדיקות תפוקה מהירה וגברוהה של מאות הפרעות כגון הפלת גנים הן ברמה המולקולרית והן ברמה הפיזיולוגית. כדי להבטיח שההתבצעות מתבצעת כראוי, כלול פקדים חיוביים ושליליים.סנכרנו בעלי חיים בריאים וניזונים היטב לשלב הנכון ולהשתמש בצלחות טריות לניסוי. הדמיה של מיקרו-ניהול של התולעים עם בחירה יכולה לעזור למשתמשים חדשים להבין כיצד ניתן ליישר את התולעים ולהעריך אותן לצורך כדאיות. הדגמת ההליכים תהיה פיל פרנקינו, הולי גילדיה ומליסה מטקאלף, סטודנטים לתארים מתקדמים במעבדה שלנו.כדי להשתמש בבעלי חיים המבטאת GFP תחת האמרגן של חלבון הלם החום ארבע להפעלת reticulum אנדופלזמי התגלגל תגובת חלבון, לגדל בעלי חיים כתב מסונכרן ב 20 מעלות צלזיוס עד שלב L4 ולשטוף את התולעים מהצלחת באמצעות מדיום M9 ולהעביר לתוך צינור. לאחר איסוף התולעים על ידי צנטריפוגה, להחליף את M9 עם 25 ננוגרם למיליליטר של התרופה של עניין M9 או דימתיל סולפוקסיד ב M9 בצינורות בעלי חיים בקרה. ואז למקם את התולעים על פלטפורמה מסתובבת במשך שלוש עד ארבע שעות ב 20 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, צנטריפוגה התולעים להתיישב לפני החלפת פתרון הטיפול עם 15 מיליליטר של M9 לבד. לאחר שתי שטיפות, להעביר את בעלי החיים צלחות NGM או NGM RNA הפרעות לוחות לפי הצורך ולאפשר לתולעים להתאושש לילה ב 20 מעלות צלזיוס. כאשר התולעים התאוששו, להוסיף חמישה עד 10 microliters של 100 מילימולר נתרן אזיד על צלחת NGM סטנדרטית ללא חיידקים ולמקם צלחת של תולעים תחת מיקרוסקופ חיטוי.מעבירים 10 עד 20 בעלי חיים מהצלחת לנקודה של נתרן אזיד. בעלי החיים צריכים לתפוס תנועה זמן קצר לאחר הנחיתה בתסתר המלח. לאחר שהנתרן אזיד התאדה, בשורה את בעלי החיים במערך ההדמיה הרצוי עם הצדדים הקדמיים וה האחוריים באותו אוריינטציה עבור כל בעלי החיים ומיד למקם את הצלחת של בעלי חיים תחת מיקרוסקופ סטריאו.הפעל את תוכנת הדמיית המיקרוסקופ הסטריאו ותחת הכרטיסיה רכישות, לחץ על פתח פרוייקטים ותיקיות כדי לפתוח פרוייקט חדש. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר שנה שם כדי לשנות את שם התיקיה. מקם את דגימת התולעת מתחת למטרת המיקרוסקופ ולהשתמש בהגדרה Brightfield כדי לאתר את המוקד הנכון של התולעים כדי למזער הלבנה פלואורסצנטי.מרכז המדגם יהיה הנקודה שבה קו הביצים נראה בבירור ולא מטושטש. הגדר את זמן החשיפה כדי להבטיח שפיקסלים אינם רוויים וגם כדי להבטיח שהאות נמצא מעל מגבלת הזיהוי. לאחר הגדרת זמן החשיפה, שינוי גודל התצוגה, המוקד ועיבוי ברייטפילד להגדרות המתאימות, לחץ על לחצן לכידת התמונה כדי להשיג תמונה.להדמיה באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב מורכב, מקם את לוחית הטיפול הבסיסית על שלב המיקרוסקופ הרחב המורכב ולהשתמש בלוח המגע כדי להפעיל את תוכנית הבקרה. צור אלבום ושם קובץ חדשים ומקם את הלוחית מתחת לעדשת המטרה. השתמש בבקרה הבסיסית ובצלחות הבקרה החיוביות כדי להגדיר את זמן החשיפה ואת עוצמת הפלואורסצנטיות כך שהאות יהיה גלוי אך לא רווי.לאחר מכן שמרו תמונות ברייטפילד ו-GFP FITC. כדי לכמת את האינדוקציה של הכתב על ידי ציטומטריית זרימת חלקיקים גדולה, הפעל תחילה את לייזרי הציטומטר ופתח את תוכנת הציטומטר. לחץ להתחיל להפעיל את הלייזרים בחלון התוכנה ולחץ על הפעל כדי ליזום את הלייזר בחלון המוקפץ בקרת לייזר ארגון.כאשר הלייזר מגיע סביב 12 מילי וואט ואת רמת מקור האור 488 עולה עד סביב 12, לחץ על עשה ולבדוק את ארבעת ערכי הלחץ. אם הערכים נראים דומים לאלה שנצפו בהגדרה המקורית, סמן את התיבה אישור לחץ. לאחר מכן, כדי לוודא שאין בועות אוויר או פסולת החוסמת את זרימת נדן ולדגום דרך תא הזרימה, לחץ על נקי מספר פעמים.לאחר מכן כבה את המיון ואת הנדן כדי להפעיל מחדש את הזרימה. כדי לבדוק את קצב הזרימה, לאסוף את נדן במשך 60 שניות. לאסוף את נדן לתוך צינור 15 מיליליטר במשך 60 שניות.קצב הזרימה צריך להיות 9 עד 10 מיליליטר לדקה. כדי להפעיל את הדגימות, התאם את עוצמת הפוטומולטייאר בלייזר לרמה גבוהה מספיק כדי שהאות יהיה מעל מגבלת הזיהוי אך לא גבוה יותר ממגבלת הרוויה. בצע gating גודל כדי לא לכלול בועות, פסולת, ביצים, וחלקיקים קטנים לא רצויים אחרים לכלול רק את בעלי החיים של עניין כגון מבוגרים.לאחר הגדרת פרמטרי ההקרנה, הוסף את התולעים המוכנות לגביע ולחץ על לרכוש. צפה כדי לוודא כי כל הנוזל לא נלקח לתוך המכונה כמו זה יגרום ציטומטר זרימה לקחת באוויר וליצור בועות בתוך הגלאי. כאשר המדגם נמוך ו/או נאספו מספיק בעלי חיים, לחץ על עצור.כדי לאחסן נתונים מגודרים בהתבסס רק על אילוצי הגודל, לחץ על כיוונון, אחסון נתונים, מגודרים בלבד ואחסן אותם מגודרים כדי לשמור את הנתונים. לאחר מכן לשטוף את האוסף עם מים deionized ולהסיר את לשטוף על ידי ואקום שלוש פעמים לפני לחזור על הניתוח עם המדגם הבא. כדי למדוד את רגישות הלחץ המיטוכונדריאלי והחמצוני, להוסיף 50 עד 75 microliters של Paraquat ב M9 לשמונה עד 10 בארות לכל מצב של צלחת שטוחה למטה 96 באר ולהעביר שמונה עד 10 תולעים לכל תנאי לכל באר של Paraquat.כל שעתיים, הקש על הצלחת בעדינות כדי לגרום לבעלי החיים לחיות לתפור או להתכופף כדי לאפשר ניקוד של מספר בעלי החיים המתים לבא. כדי למדוד את רגישות הטמפרטורה של בעלי החיים, הדגירה את התולעים במשך שלושה עד ארבעה ימים ב 20 מעלות צלזיוס לפני ציפוי 10 עד 15 בעלי חיים לכל צלחת לכל תנאי עבור סך של ארבע עד שש צלחות. ואז למקם את הצלחות לתוך אינקובטור 34 או 37 מעלות צלזיוס ולהבקיע את הישרדות התולעת כל שעתיים כפי שהוכח רק.כתב hsp-4 יש רושם בסיס מינימלי בהיעדר מתח אבל מציג ביטוי GFP חזק כאשר בעלי החיים נחשפים ללחץ רשתית אנדופלזמית באמצעות התרופה Tunicamycin. הבדלים אלה ניתן לכמת גם באמצעות ציטומטר זרימת חלקיקים גדול. יתר על כן, אינדוקציה של הטרנסג'ין תחת מתח רשתית אנדופלזמית יכול להיות מדוכא לחלוטין על ידי הפלה של XBP-1 באמצעות הפרעה RNA.בדיקות דומות יכולות להתבצע כדי למדוד מתח מיטוכונדריאלי, מתח חמצוני, ומתח חום. תגובות פיזיולוגיות של בעלי חיים שלמים ללחץ ניתן למדוד גם באמצעות מספר מיסי הישרדות. לדוגמה, חשיפה לטוניקמיצין משמשת למדידת רגישות ללחץ רשתית אנדופלזמית.ההפלה של הגן XBP-1 גורמת לעלייה משמעותית ברגישות לטוניקאמיצין. יתר על כן, חשיפה לסוכן הכימי Paraquat משמשת למדידת רגישות ללחץ חמצוני ומיטוכונדריאלי. הפלת הגן DAF-2 גורמת לעלייה משמעותית בהתנגדות ל-Paraquat.Thermotolerance ניתן למדוד על ידי קביעת ההישרדות של בעלי חיים בטמפרטורות גבוהות והוא יכול להיות התווה כמו עקומת הישרדות. בדיקות אלה צריכות להתבצע לפחות ארבע עד שש פעמים וכל השכפולים צריכים להיות מותווים אחד נגד השני כמו thermotolerance מדגים שונות גבוהה מאוד לעומת בדיקות מתח אחרות. כאשר מדמיינים בעלי חיים, חיוני להגדיר את הפרמטרים כך שלא תהיה רוויה של אות או מתחתיה ולהבטיח שאותם פרמטרים ישמשו לאורך כל הניסוי.פרוטוקולי ההדמיה המתוארים כאן נוחים להקרנה בקנה מידה גדול כולל מסכים ברחבי הגנום והם נהדרים הן למחקרים גישושים והן למחקרים מאשרים אשר לאחר מכן ניתן לעקוב אחריהם על ידי הבדיקות הפיזיולוגיות המתוארות.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

ניטור הורמונים צמחיים במהלך התגובות מתח

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

קישור סיכוני טריפה, מתח פיסיולוגי אוכלי עשב ופירוק מיקרוביאלית המלטת צמח

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

נוגדן מכתים ב<em&gt; ג Elegans</em&gt; שימוש &quot;Freeze-פיצוח&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב<em&gt; ג elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...