Name: measurements of physiological stress responses in c. elegans
Uploaded: 2020-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

R.BZ. EMBO 장기 펠로우십과 래리 L. 힐블롬 재단의 지원을 받고 있습니다. R.H.S는 국립 노화 연구소 (NIA)와 의학 연구 박사 후 펠로우십을위한 글렌 재단을 통해 보조금 5F32AG032023-02에 의해 지원됩니다. A.F.는 NIA를 통해 F32AG051355를 지원합니다. 에이치케이지는 국립과학재단 대학원 연구동호회 프로그램을 통해 DGE1752814를 지원하고 있습니다. M.G.M.은 NIA를 통해 1F31AG060660-01에 의해 지원됩니다. A.D.는 토마스와 스테이시 시벨 재단, 하워드 휴즈 의학 연구소, 4R01AG042679-04 및 NIA의 5R01AG055891-02, 그리고 NIEHS의 5R01ES021667-09에 의해 지원됩니다. 래리 조, 멜리사 산체스, 나메 켈렛, 아넬 에스퀴벨에게 상당한 기술적 지원을 부탁드립니다. 우리는 모리모토 연구소와 CGC (연구 인프라 프로그램 P40 OD010440의 NIH 사무실에 의해 투자) 균주에 감사드립니다.

1. 온도 및 OP50 대 HT115의 표준 성장 조건
<ol><li>표준 성장 및 확장<ol>
<li>LB(표 1)에서OP50의 배양물을 성장시키고 주변 온도(~22-25°C)에서 24-48시간 동안 이에 상응하는 매체를 선택한다. OP50은 우라실 보조트로프로서 실온에서 박테리아를 성장시키고 37°C에서 재배할 때 역류제(예를 들어, 억제기 돌연변이체)의 발생률이 더 높다. OP50 배양물의 장기 보관은 권장되지 않습니다(최대 1주~4°...

여기서, C. elegans에서세포 스트레스 반응을 심문하는 방법, 형광 전사 리포터 및 생리적 스트레스 생존 측정법을 사용하여 설명된다. 기자들은 모두 세포 스트레스 반응 장착에 관여하는 전사 인자의 다운스트림 전사 표적의 프로모터 하에 구동되는 GFP 발현을 이용한다. hsp-4p의 사용 ::GFP는 XBP-1s 매개 UPRER에의해 변조, hsp-6p ::GFP ATFS-1 중재 UPRMT에의해 제어, GST...

세포 내 및 세포 외 환경의 변화에 반응하는 유기체의 능력은 생존과 적응에 매우 중요합니다. 이것은 세포의 무결성을 보장하는 수많은 보호 경로를 통해 세포 수준에서 수행됩니다. 수많은 세포 구성 요소는 스트레스 관련 손상의 대상이 되는 동안, 세포 스트레스 응답의 한 가지 주요 참여는 복구 하 고 세포 proteome의 항상성을 보호 하는. 그러나, 세포기관에게 불린 특별한 구조물로 단백질의 구획화는, 세포 내의 모든 단백질이 제대로 접혀 있고 기능적이다는 것을 확인하기 위하여 단백질 품질 관리의 1개의 중앙 집중식 양식에 의지할 수 없기 때문에, 세포를 위한 도전을 제기합니다. 따라서, 그들의 단백질에 교란을 다루기 위하여는, 세포기관은 잘못 접힌 단백질을 감지하고 그 구획 내의 응력을 경감하기 위하여 시도에서 긴장 반응을 활성화할 수 있는 전용적인 품질 관리 기계장치를 발전시켰습니다. 예를 들어, 시토솔은 열 충격 반응(HSR)에 의존하는 반면, 내포성 망상체(ER)와 미토콘드리아는 구획특이적 전개단백질 반응(UPR)에 의존한다. OxSR 반응성 산소 종의 독성 효과 완화 하는 역 (ROS). 각 스트레스 반응은 세포 도전과 환경 모욕의 존재에서 트리거되고 맞춤형 전사 반응을 유도한다. 이 반응의 특징은 적당한 세포기관을 표적으로 한 잘못 접힌 단백질 (샤페론과 같은) 또는 대안으로, 단백질 분해에 의해 손상된 단백질을 제거하는 분자를 합성하는 것을 포함합니다. 이러한 스트레스 반응을 활성화 하지 못하면 손상된 단백질의 축적, 조직의 전신 장애로 전파 되는 세포 기능 장애, 그리고 결국 유기체의 죽음. 다른 스트레스 응답의 기능과 조절은다른곳에서 검토1 .
세포 스트레스 반응의 조절 및 활동에 관한 많은 통찰력은 선충, 예쁜꼬마선충,유전 연구에서 다세포 모델 유기체에 기인했습니다. 선충은 세포 수준에서 스트레스 반응의 활성화를 연구 할뿐만 아니라 유기체 수준에서도 연구 할 수 있습니다. 선충은 그들의 성장과 생존에 있는 약 및 오염물질에 유전 섭동 또는 노출의 효력을 공부하기 위하여 이용되었습니다. 그들의 빠른 생성 시간, 등소, 투명성, 유전 적 견인성 및 실험 중 사용 편의성은 그러한 연구에 이상적입니다. 또한, 스트레스에 상대적으로 빠른 생리 적 반응 (시간과 몇 일 사이) 그리고 세포 경로의 진화 보존 선충 스트레스 저항을 공부에 눈에 띄는 도구.
C. elegans를성장 하기 위해 식품 소스로 사용 되는 두 개의 일반적으로 사용 되는 대장균 균주가 있다: 표준 OP50, 대부분의 실험역사적으로 수행 된 B 변형2 그리고 HT115, 거의 모든 RNAi실험에사용 되는 K-12 균주3,4. OP50과 HT115 세균성 규정식 사이 중요한 다름이 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다. 이 상이한 세균 성 근원에 성장은 신진 대사 단면도에 있는 중요한 다름을 일으키는 원인이 되기 위하여 보였습니다, 미토콘드리아 DNA 사본 수, 및 수명을 포함하여 몇몇 중요한 표현형, 일생5. 이러한 차이 중 일부는 OP50 박테리아에 성장과 관련 된 비타민 B12 결핍에 기인, 미토 콘 드리 아 항상성 및 병원 체와 스트레스에 증가 감도 발생할 수 있습니다. 이러한 표현형의 모든 HT115 박테리아에 성장에 의해 완화 될 것으로 나타났습니다., 비타민 B12의 상부는6. 따라서 RNAi 조건의 필요성에 관계없이 HT115 박테리아에 대한 생리적 스트레스 반응에 대한 모든 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 그러나, OP50상에서 동물을 유지하기 가용하기 때문에, 모든 표준 성장(즉, 동물의 유지 보수 및 증폭)은 OP50에서 수행될 수 있으며, 여기에 설명된 실험 패러다임의 현저한 차이는 OP50에서 유지되는 웜에서 검출되지 않았으며, HT115 포스트 동기화(즉, 부화 후 표백으로부터 또는 L검치없이)
여기서, 두 가지 기능적 방법을 이용한 세포 스트레스 반응의 활성의 특성화가 설명된다. 제시된 프로토콜은 주로 세포 스트레스 반응과 단백질 항상성에 미치는 영향에 초점을 맞추고 있다는 점에 유의해야합니다. 첫째, 형광 전사 기자는 다른 세포 스트레스에 응하여 특별히 활성화되는 내인성 유전자 프로모터에 의해 조절되는 활용된다. 이러한 형광 전사 기자는 기본적으로 스트레스 반응의 일부인 특정 유전자의 전사 유도에 기초한다. 예를 들어, HSP-4는 인간 보호자 HSPA5/BiP에 대한 열 충격 단백질 정형고체로, ER 스트레스시 활성화되고 스트레스를 완화하기 위해 ER에 국소화됩니다. ER 스트레스(예를 들어, tunicamycin에 대한 노출)의 조건에서, hsp-4 프로모터의 조절하에 놓인 녹색 형광 단백질(GFP)은,선충7의대입자 유동 세포학을 사용하여 형광 현미경 또는 정량적으로 측정될 수 있는 바와 같이 높은 수준으로 합성된다. 유사하게, 미토콘드리아 샤페론의 프로모터, hsp-6(포유류 HSPA9에 직교), UPRMT8의활성화를 모니터링하는 데 이용되고, 세포질 샤페론 hsp-16.2의 프로모터는 HSR9의활성을 평가하는데 사용된다. 이 리포터는 다양한 섭동에 대한 응답으로 활성화 된 경로의 신속한 특성화를 허용합니다.
종종 여기에 제시 된 기자는 스트레스 반응의 활성화의 질적 인 출력을 제공하는 현미경 검사를 사용하여 이미지화됩니다. 그러나 이미징 기술은 위에서 설명한 기자의 강도와 조직 위치에 대한 정보를 모두 제공하지만 정량화가 항상 정확하거나 견고한 것은 아닙니다. 이미징 분석 도구를 사용하여 형광 활성화를 정량화할 수 있지만, 이러한 방법은 상대적으로 처리량이 낮고 샘플 크기가 작으며, 이는 상대적으로 적은 수의 동물이 이미지화되기 때문이다. 다량의 동물을 쉽게 얻을 수있는 능력은 C. elegans가 큰 입자 유동 세포계를 사용하여 형광 응력 리포터의 활성화를 분석하는 이상적인 모델 시스템입니다. 큰 입자 유동 세포계는 많은 살아있는 동물의 크기와 형광에 따라 기록, 분석 및 분류 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 수천 개의 웜에 대한 형광 강도, 크기 및 공간(2D) 정보를 얻을 수 있습니다. 이 시스템은 FlowPilot을 사용하여 제어되며, 이를 통해 측정된 파라미터를 실시간으로 데이터 수집 및 분석할 수 있습니다. 여기서, 대입자 유동 세포계를 이용한 현미경 이미징 및 정량분석 방법 모두 응력 반응의 활성화를 측정하는 방법으로 제안된다.
리포터 분석 외에도 동물의 스트레스에 대한 민감도 또는 저항성을 생리적 스트레스 분석법으로 측정할 수 있습니다. 이것은 특정 세포 스트레스 경로를 활성화 스트레스 환경에 동물을 노출하여 달성된다. 여기서, 특정 유형의 스트레스에 대한 전체 동물의 민감도를 측정하기 위한 몇 가지 방법이 제공된다.
ER 응력은 N-연결된 글리코실화를 차단하는 화학 약제인 튜니카마이신을 사용하여 C. elegans에 가해져 ER10에서잘못 접힌 단백질이 축적됩니다. C. 예쁜꼬마선충에서튜니카마이신에 노출되면 성장하면 ER 기능의 주요 섭동이 발생하며 수명이 현저히 감소하여수명이 11로크게 감소합니다. 튜니카마이신 함유 플레이트에서 동물의 생존을 측정함으로써, 동물의 ER 응력 민감도를 정량화할 수 있다. 예를 들어, 이후성 UPRER 유도를 가진 동물은 ER에서 단백질 오폴딩 스트레스에 대한 내성을 증가시켜 야생형동물(12)에비해 튜니카마이신 노출 시 생존율이 증가한다.
산화 및 미토콘드리아 스트레스는 동물을 화학 약제인 파라쿼트에 노출시킴으로써 C. 예쁜꼬마선충에 가된다. 파라쿼트(Paraquat)는 일반적으로 사용되는 제초제로서, 특히 미토콘드리아13에서과산화물 형성을 일으킨다. 미토콘드리아 유래 반응성 산소 종(ROS)의 특이적 국소화로 인해 파라쿼트 분석제는 종종 "미토콘드리아" 스트레스 분석법으로 사용됩니다. 그러나, 과산화물은 미토콘드리아 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SODs)14에의해 과산화수소로 급속히 전환된다. 과산화수소는 이후에 미토콘드리아에서 확산되어 세포의 다른 구획에서 산화 스트레스를 유발할 수 있습니다. 따라서, 우리는 미토콘드리아 및 산화 스트레스 둘 다에 대한 감수성을 측정하는 것으로 파라쿼트 생존 분석을 설명한다(다른 산화 스트레스측정제는 15).
열내성 검사들은 동물을 높은 온도에 두어 C. 예쁜꼬마선충에서 수행됩니다. 선충에 대한 주변 온도는 ~ 15-20 °C이며 열 응력은 25 °C16,,17이상의 온도에서 유도됩니다. 열내성 측정은 일반적으로 동물이 이 온도에서 중요한 세포 결함을 나타내기 때문에 30-37 °C에 이르는 온도에서 수행되며, 생존 측정은 24 시간16,,18이내에 완료됩니다. 여기서, 열내성 검사를 수행하기 위한 두 가지 대체 방법이 제공된다: 34°C에서의 성장 및 37°C에서의 성장. 함께, 여기에 제시된 프로토콜은 RNA 간섭 또는 화학 약물 라이브러리를 사용하여 표준 유전자 노크다운과 결합될 때 대규모 스크린을 수행하기 위해 이용될 수 있다.
프로토콜은 4 개의 넓은 절차로 나눌 수 있습니다- C. elegans의 성장 및 화상 진찰을 위한 준비 (단면도 1 및 2), 형광 현미경 검사법을 사용하여 전사 기자의 화상 진찰 (섹션 3-5), 큰 입자 유량 세포측계를 사용하여 기자의 정량적인 측정 (섹션 6), 및 C. elegans에 있는 긴장 감도를 측정하기 위하여 생리학적 분석 (단면도 7).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>for mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118072</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco granulated agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-782</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>C0051-25</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>350-5000-000</td>
			<td>equipped with a 488 nm light source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Cleaning Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5072-000</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Sheath Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5070-100</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG dioxane free</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>CI8280-4</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426500</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M205FA stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450040</td>
			<td>equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0070-3</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>75990-514</td>
			<td>equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289-50G</td>
			<td>for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tert-butyl hydroperoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>458139</td>
			<td>for oxidative stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660-5G</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurements of physiological stress responses in c. elegans

유기체는 종종 변동 환경과 세포 내 항상성에 변화에 노출, 이는 자신의 단백질과 생리학에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 유기체는 손상을 복구하고 항상성을 유지하기 위해 최선을 다하고 대상 및 특정 스트레스 응답을 진화했다. 이러한 메커니즘은 내구 성 망막(UPRER),미토콘드리아의 전개된 단백질 반응(UPRMT),열 충격 반응(HSR) 및 산화 스트레스 반응(OxSR)의 전개된 단백질 반응을 포함한다. 여기에 제시 된 프로토콜은 선충, C. elegans에서이러한 경로및 생리적 결과의 활성화를 감지하고 특성화하는 방법을 설명합니다. 먼저, 경로 특이적 형광 전사 기의 사용은 신속한 세포 특성화, 약물 스크리닝, 또는 대규모 유전자 스크리닝(예를 들어, RNAi 또는 돌연변이 라이브러리)에 대해 기술된다. 또한, 상보적이고 견고한 생리학적 측정이 설명되며, 이는 특정 스트레스에 대한 동물의 민감도를 직접 평가하는 데 사용될 수 있으며, 전사 기의 기능적 검증역할을 한다. 함께, 이러한 방법은 내부 및 외부 proteotoxic 섭동의 세포 및 생리적 효과의 신속한 특성화를 허용합니다.

전사 리포터를 사용하여 스트레스 반응 의 활성화를 측정 여기에서, 형광 전사 기자는 C. elegans에있는 대부분의 긴장 반응의 활성화를 측정하는 강력한 공구로 봉사하는 이용됩니다. GFP 발현은 구획별 응력에 반응하는 데 관여하는 마스터 전사 조절제의 정식 표적의 프로모터에 의해 구동된다. 일반적으로 사용되는 전사 기자의 포괄적인 목록은 <stron...

Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

여기서, 우리는 선충 C. 예쁜꼬마선충에서 세포 단백질 독성 스트레스 반응을 형광 전사 기의 활성화를 측정하고 생리적 스트레스에 대한 감수성을 측정하여 특성화한다.

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

이 방법은 C.elegans에 있는 긴장 반응을 특성화하고 유전 또는 약리학 적인 동요가 보호 세포 통로의 활성화에 영향을 미치는지 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 방법은 분자 및 생리적 수준에 유전자 녹다운과 같은 수백 개의 동요의 신속하고 높은 처리량 테스트를 허용합니다. 분석이 제대로 수행되도록 하려면 양수 및 음수 컨트롤을 포함합니다.건강하고 잘 먹이는 동물을 적절한 단계로 동기화하고 실험을 위해 신선한 접시를 사용합니다. 선택으로 웜의 미세 조작을 시각화하면 새로운 사용자가 웜이 어떻게 줄 지어 생존 가능성을 평가하는지 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 필 프랭티노, 홀리 길데아, 멜리사 멧칼프, 우리의 실험실에서 대학원생이 될 것입니다.내열성 망상의 활성화를 위해 열충격 단백질 4의 발기인하에 GFP를 발현하는 동물을 사용하려면 단백질 반응이 전개되고, L4 단계까지 20도에서 동기화된 리포터 동물을 성장시키고 M9 배지를 사용하여 플레이트에서 벌레를 씻어 튜브로 옮긴다. 원심분리에 의해 벌레를 수집한 후, M9에 대한 관심 약물의 밀리리터당 25 나노그램으로 M9을 조절동물관에서 M9 또는 디메틸 설산화물을 대체한다. 그런 다음 웜을 회전 플랫폼에 섭씨 20도에서 3~4시간 동안 배치합니다.인큐베이션이 끝나면 웜을 원심분리하여 치료 용액을 M9의 15밀리리터만 교체합니다. 2개의 세징 후에, 동물을 NGM 플레이트 또는 NGM RNA 간섭 판으로 적절히 옮기고 벌레가 섭씨 20도에서 하룻밤 동안 회복할 수 있도록 합니다. 벌레가 회복되면 박테리아없이 표준 NGM 접시에 100 밀리머 나트륨 아지드의 5 ~ 10 마이크로 리터를 추가하고 해부 현미경 아래에 벌레 접시를 놓습니다.접시에서 아지드 나트륨 의 자리로 10~20마리의 동물을 옮기. 동물은 소금 용액에 착륙 한 직후 의 움직임을 포착해야합니다. 아지드 나트륨이 증발하면 모든 동물에 대해 동일한 방향으로 전방 및 후방 면으로 원하는 이미징 설정에 동물을 정렬하고 즉시 스테레오 현미경 아래에 동물의 접시를 놓습니다.스테레오 현미경 이미징 소프트웨어를 실행하고 인수 탭에서 프로젝트 및 폴더를 클릭하여 새 프로젝트를 엽니다. 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 이름을 변경하여 폴더이름을 변경합니다. 현미경 목표 아래에 웜 샘플을 배치하고 브라이트필드 설정을 사용하여 웜의 올바른 초점점을 찾아 형광 표백을 최소화합니다.샘플의 중심은 계란의 선이 명확하게 보이고 퍼지지 않는 지점이 될 것입니다. 노출 시간을 설정하여 픽셀이 포화되지 않았는지 확인하고 신호가 감지 한계를 초과하도록 합니다. 노출 시간, 줌, 포커스 및 브라이트필드 응축기를 적절한 설정으로 설정한 후 캡처 이미지 버튼을 클릭하여 이미지를 얻습니다.복합 광야 현미경을 이용한 이미징의 경우, 베이스라인 제어 처리 플레이트를 복합 광야 현미경 단계에 배치하고 터치 패드를 사용하여 제어 프로그램을 시작합니다. 새 앨범과 파일 이름을 만들고 플레이트를 객관적인 렌즈 아래에 배치합니다. 기준선 제어 및 양수 제어 플레이트를 사용하여 노출 시간 및 형광 강도를 설정하여 신호가 보이지만 포화되지 않도록 합니다.그런 다음 브라이트필드와 GFP FITC 이미지를 저장합니다. 큰 입자 흐름 세포측정에 의해 기자의 유도를 정량화하려면 먼저 세포계 레이저를 켜고 사이토미터 소프트웨어를 엽니다. 소프트웨어 창에서 레이저를 켜고 실행을 클릭하여 아르곤 레이저 제어 팝업 창에서 레이저를 시작하려면 시작하십시오.레이저가 약 12 밀리와트에 도달하면 488 광원 수준이 약 12까지 올라가면 완료를 클릭하고 네 개의 압력 값을 확인하십시오. 값이 원래 설정에서 관찰된 값과 비슷해 보이는 경우 압력 확인 란을 선택합니다. 다음으로, 유동 셀을 통해 칼집과 샘플의 흐름을 차단하는 기포 나 파편이 없는지 확인하려면 여러 번 청소를 클릭합니다.그런 다음 정렬을 끄고 칼집을 켜서 흐름을 다시 시작합니다. 유량을 확인하려면 60초 동안 칼집을 수집합니다. 60초 동안 15밀리리터 튜브에 칼집을 수집합니다.유량은 분당 9~10밀리리터여야 합니다. 시료를 실행하려면 레이저 광증 전력을 감지 한계를 초과하지만 채도 한계보다 높지 않을 정도로 높은 수준으로 조정합니다. 거품, 파편, 계란 및 기타 원치 않는 작은 입자를 배제하고 성인과 같은 관심있는 동물만 포함하도록 크기 게이팅을 수행합니다.스크리닝 매개 변수가 설정된 경우 준비된 웜을 컵에 추가하고 획득을 클릭합니다. 이 공기에 걸릴 및 검출기 내에서 거품을 만들 수 있기 때문에 모든 액체가 기계에 채택되지 않도록주의하십시오. 샘플이 낮거나 동물이 충분히 수집되면 중지를 클릭합니다.크기 제약 조건에 따라 게이트된 데이터를 저장하려면 설정, 데이터 저장소를 클릭하고 게이트된 저장소만 저장하여 데이터를 저장합니다. 그런 다음 수집 컵을 탈온된 물로 헹구고 다음 샘플로 분석을 반복하기 전에 진공으로 세척을 세 번 제거합니다. 미토콘드리아 및 산화 스트레스 민감도를 측정하려면 M9에서 50~75마이크로리터를 평평한 바닥 96웰 플레이트의 조건당 8~10개의 우물로 추가하고 조건당 8~10개의 웜을 파라콰트의 각 우물에 전달합니다.2시간마다 접시를 부드럽게 탭하여 살아있는 동물이 잘 죽은 동물의 수를 채점할 수 있도록 분쇄하거나 구부립니다. 동물의 온도 민감도를 측정하려면, 총 4~6플레이트에 대해 조건당 10~15마리의 동물을 도금하기 전에 20°C에서 3~4일 동안 벌레를 배양한다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 34도 또는 37도의 인큐베이터에 넣고 2시간마다 웜 생존을 기록합니다.hsp-4 리포터는 스트레스가 없는 경우 최소한의 기저 인상을 가지고 있지만 동물이 투니카마이신 약물을 사용하여 내시경 망상 스트레스에 노출될 때 강력한 GFP 표현을 나타낸다. 이러한 차이는 또한 큰 입자 흐름 세포계를 사용하여 정량화될 수 있다. 더욱이, 폐막성 망상 응력 하에서 트랜스진의 유도는 RNA 간섭을 통해 XBP-1의 녹다운에 의해 완전히 억압될 수 있다.유사한 소하는 미토콘드리아 스트레스, 산화 스트레스 및 열 스트레스를 측정하기 위해 수행 될 수있다. 스트레스에 대한 전체 동물 생리적 반응은 또한 여러 생존 방법을 사용하여 측정 될 수있다. 예를 들어, Tunicamycin에 노출은 내민성 망상 응력 감도를 측정하기 위하여 이용됩니다.XBP-1 유전자의 녹다운은 튜니카마이신에 대한 민감도가 현저한 증가로 이산됩니다. 더욱이, 화학약제 파라쿼트에 노출되는 것은 산화 및 미토콘드리아 응력 감도를 측정하는 데 사용된다. DAF-2 유전자의 녹다운은 파라쿼트에 대한 저항성이 현저한 증가로 이산됩니다.열성 편협은 높은 온도에서 동물의 생존을 결정함으로써 측정 될 수 있으며 생존 곡선으로 플롯 될 수있다. 이러한 분석은 적어도 4 ~ 6 번 수행해야하며 열성 편협이 다른 스트레스 측정에 비해 매우 높은 가변성을 보여 주면서 복제본을 모두 서로 에 대해 플롯해야합니다. 동물을 이미징할 때, 신호의 이상 또는 채도 미만이 없도록 매개변수를 설정하고 실험 전반에 걸쳐 동일한 매개 변수가 사용되는지 확인하는 것이 중요합니다.여기에서 기술된 화상 진찰 프로토콜은 게놈 전체 스크린을 포함하여 대규모 검열을 위한 허용되고 그 때 기술된 생리적인 분석에 의해 후속될 수 있는 탐구및 확증 연구 둘 다를 위해 중대합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

연구

생물학

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

스트레스 응답하는 동안 식물 호르몬을 모니터링

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

트렌스 제닉의 생성 C. 엘레간스 Biolistic 변환에 의해

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

Predation 위험, Herbivore 생리적 스트레스와 식물 돼지 미생물 분해를 연결

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans의 주 화성 분석

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

항체 염색법에<em&gt; C. 엘레</em&gt; &quot;동결 크래킹 사용&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

허혈 / 재관류에 대한 산소 결핍 - 기아 모델<em&gt; C. 엘레</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험<em&gt; C. 엘레</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

방법은 근육의 세포 내 구획을 평가하기 위해<em&gt; C. 엘레</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...