Name: measurements of physiological stress responses in c. elegans
Uploaded: 2020-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

R.BZ. støttes av EMBO langsiktig fellesskap og Larry L. Hillblom Foundation. R.H.S støttes av stipend 5F32AG032023-02 gjennom National Institute of Aging (NIA) og Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship. A.F. støttes av gi F32AG051355 gjennom NIA. H.K.G. støttes av gi DGE1752814 gjennom National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. støttes av 1F31AG060660-01 til og med NIA. A.D. støttes av Thomas og Stacey Siebel Foundation, Howard Hughes Medical Institute, og 4R01AG042679-04 og 5R01AG055891-02 fra NIA, og 5R01ES021667-09 fra NIEHS. Vi takker Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet og Anel Esquivel for betydelig teknisk assistanse. Vi takker Morimoto-laboratoriet og CGC (finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) for stammer.

1. Standard vekstforhold for temperaturer og OP50 vs HT115
<ol><li>Standard vekst og ekspansjon<ol>
<li>Vokse en kultur av OP50 i LB (Tabell 1) eller tilsvarende media av valget for 24-48 h ved omgivelsestemperatur (~ 22-25 °C). Vokse bakterier ved romtemperatur som OP50 er en uracil auxotroph og det er en høyere forekomst av revertants (f.eks suppressor mutanter) når dyrket ved 37 °C. Langsiktig lagring av OP50 kulturer anbefales ikke (maks 1 uke ved 4 °C).</li>
		<li>Frø et volum på ~ 100-200 ...

Her beskrives metoder for å avhøre cellulære stressresponser i C. elegans, ved hjelp av fluorescerende transkripsjonsreportere og fysiologiske stressoverlevelsesanalyser. Journalistene bruker alle GFP-uttrykk drevet under arrangøren av et nedstrøms transkripsjonsmål for transkripsjonsfaktorene som er involvert i montering av cellulære stressresponser. Bruken av hsp-4p::GFP modulert av XBP-1s-mediert UPRER, hsp-6p::GFP kontrollert av ATFS-1-mediert UPRMT, gst-4p:...

Evnen til en organisme til å reagere på endringer i det intra- og ekstracellulære miljøet er avgjørende for sin overlevelse og tilpasning. Dette oppnås på cellenivå gjennom mange beskyttende veier som sikrer cellens integritet. Mens mange cellulære komponenter er utsatt for stress-assosiert skade, en stor involvering av cellulære stress responser er å reparere og beskytte homeostase av cellulær proteome. Men kompartaliseringen av proteiner i spesielle strukturer, kalt organeller, utgjør en utfordring for cellen, da den ikke kan stole på en sentralisert form for proteinkvalitetskontroll for å sikre at alle proteinene i cellen er riktig brettet og funksjonelle. Derfor, for å håndtere perturbasjoner til sine proteiner, har organeller utviklet dedikerte kvalitetskontrollmekanismer, noe som kan føle feilfoldede proteiner og aktivere en stressrespons i et forsøk på å lindre stresset i det rommet. For eksempel er cytosol avhengig av varmesjokkresponsen (HSR), mens endoplasmatisk reticulum (ER) og mitokondrier er avhengige av deres kupéspesifikke utfoldede proteinresponser (UPR). OxSR tjener til å lindre de toksiske effektene av reaktive oksygenarter (ROS). Hver stressrespons utløses i nærvær av cellulære utfordringer og miljøfornærmelser og induserer en skreddersydd transkripsjonsrespons. Kjennetegnene på disse svarene inkluderer syntetiserende molekyler som re-fold misfolded proteiner (som chaperones) rettet mot riktig organelle, eller alternativt fjerne skadede proteiner ved protein nedbrytning. Unnlatelse av å aktivere disse stressresponsene resulterer i akkumulering av skadede proteiner, cellulær dysfunksjon forplantet til systemisk svikt i vev, og til slutt død av organismen. Funksjonen og reguleringen av de ulike stresssvarene gjennomgås andre steder1.
Mange innsikter om regulering og aktivitet av cellulære stressresponser har blitt tilskrevet nematode, Caenorhabditis elegans, en flercellet modell organisme i genetisk forskning. Nematoder tillater ikke bare å studere aktivering av stressresponser på cellenivå, men også på organismenivå; nematoder har blitt brukt til å studere effekten av genetiske perturbasjoner eller eksponering for narkotika og forurensende stoffer på deres vekst og overlevelse. Deres raske generasjonstid, isogeni, åpenhet, genetisk tractability og brukervennlighet under eksperimentering gjør dem ideelle for slike studier. I tillegg gjør den relativt raske fysiologiske responsen på stress (mellom timer og noen dager) og evolusjonær bevaring av cellulære veier nematoder til et fremtredende verktøy for å studere stressresistens.
Det er to vanlige E. coli stammer som brukes som matkilde for å vokse C. elegans: standard OP50, en B-stamme der de fleste eksperimentering har blitt historisk utført2 og HT115, en K-12 stamme som brukes til nesten alle RNAi eksperimenter3,4. Det er viktig å merke seg at det er betydelige forskjeller mellom OP50 og HT115 bakterielle dietter. Vekst på disse forskjellige bakterielle kildene har vist seg å forårsake store forskjeller i metabolsk profil, mitokondrie DNA kopi nummer, og flere store fenotyper, inkludert levetid5. Noen av disse forskjellene tilskrives Vitamin B12 mangel forbundet med vekst på OP50 bakterier, noe som kan resultere i defekter i mitokondrie homeostase og økt følsomhet for patogener og påkjenninger. Alle disse fenotypene har vist seg å bli lindret av vekst på HT115 bakterier, som har høyere nivåer av vitamin B126. Derfor anbefales det at alle eksperimenter på fysiologiske stressresponser utføres på HT115-bakterier, uavhengig av nødvendigheten av RNAi-forhold. Men på grunn av den enkle å opprettholde dyr på OP50, kan all standard vekst (dvs. vedlikehold og forsterkning av dyr) utføres på OP50, da betydelige forskjeller i de eksperimentelle paradigmene som er beskrevet her ikke ble oppdaget i ormer opprettholdt på OP50 så lenge de ble flyttet til HT115 postsynkronisering (dvs. fra luke etter bleking med eller uten L1 arrestere) før eksperimentering.
Her er karakteriseringen av aktiviteten til cellulære stressresponser ved hjelp av to funksjonelle metoder beskrevet. Det bør bemerkes at protokollene som presenteres er primært fokusert på cellulære stressresponser og deres innvirkning på protein homeostase. For det første benyttes fluorescerende transkripsjonsreportere, som reguleres av endogene genarrangører som er spesielt aktivert som svar på ulike cellulære påkjenninger. Disse fluorescerende transkripsjonelle journalistene er basert på transkripsjonsinduksjon av spesifikke gener som er opprinnelig en del av stressresponsen. For eksempel aktiveres HSP-4, et varmesjokkprotein ortolog til den menneskelige chaperone HSPA5/BiP, på ER-stress og lokaliserer til ER for å lindre stresset. Under forhold med ER-stress (f.eks. eksponering for tunikamycin), et grønt fluorescerende protein (GFP), plassert under regulering av hsp-4-promotoren, syntetiseres i høye nivåer som kan vurderes ved fluorescerende mikroskopi eller kvantitativt målt ved hjelp av cytometri av nematoder7. På samme måte benyttes arrangøren av en mitokondriechaperone, hsp-6 (ortolog til pattedyr HSPA9), til å overvåke aktiveringen av UPRMT8, og arrangøren av den cytosolic chaperone hsp-16.2 (ortolog til de menneskelige krystallinske alfagenene) brukes til å vurdere aktiviteten til HSR9. Disse reporterne tillater en rask karakterisering av banene aktivert som svar på ulike perturbasjoner.
Ofte er journalistene som presenteres her avbildet ved hjelp av mikroskopi, noe som gir en kvalitativ effekt av aktiveringen av stressresponser. Men mens bildeteknikker gir både informasjon om intensitet og vevplassering av journalistene beskrevet ovenfor, er kvantifiseringen ikke alltid nøyaktig eller robust. Selv om det er mulig å kvantifisere fluorescerende aktivering ved hjelp av bildeanalyseverktøy, er disse metodene relativt lave gjennomstrømnings- og prøvestørrelsen liten, på grunn av det relativt lave antallet dyr avbildet. Den enkle og evne til å oppnå store mengder dyr raskt gjøre C. elegans et ideelt modellsystem for å si aktivering av fluorescerende stress reportere gjennom bruk av en stor partikkel flyt cytometer. En stor partikkelflyt cytometer er i stand til å registrere, analysere og sortere basert på størrelse og fluorescens fra mange levende dyr. Ved hjelp av denne metoden er det mulig å få fluorescerende intensitet, størrelse og også romlig (2D) informasjon for tusenvis av ormer. Systemet styres ved hjelp av FlowPilot, som gjør det mulig for sanntidsdatainnsamling og analyse av de målte parametrene. Her tilbys metoder for både mikroskopisk avbildning og kvantitativ analyse ved hjelp av et cytometer for storpartikkelflyt som metoder for å måle aktiveringen av stressresponser.
Utover reporteranalyse kan følsomheten eller motstanden til dyr mot stress måles ved hjelp av fysiologiske stressanalyser. Dette oppnås ved å utsette dyr for stressende miljøer som aktiverer spesifikke cellulære stressveier. Her er det gitt flere metoder for å måle følsomheten til hele dyr til bestemte typer stressfaktorer.
ER stress påføres C. elegans ved hjelp av kjemisk middel, tunikamycin, som blokkerer N-koblet glykosylering, forårsaker akkumulering av feilfoldede proteiner i ER10. I C. elegans,vekst ved eksponering for tunikamycin resulterer i store perturbasjoner i ER funksjon, og en betydelig redusert levetid11. Ved å måle overlevelsen av dyr på tunikamycinholdige plater, kan ER stressfølsomhet av dyr kvantifiseres. For eksempel har dyr med ektopisk UPRER induksjon og dermed økt motstand mot protein feilfolding stress i ER økt overlevelse ved tunicamycin eksponering sammenlignet med villtype dyr12.
Oksidativt og mitokondriestress påføres C. elegans ved å utsette dyr for det kjemiske middelet, paraquat. Paraquat er et vanlig ugressmiddel, noe som forårsaker superoksiddannelse spesielt i mitokondriene13. På grunn av den spesifikke lokaliseringen av mitokondrier-avledede reaktive oksygenarter (ROS), brukes paraquatanalyser ofte som en "mitokondrie" stressanalyse. Imidlertid blir superoksid raskt omdannet til hydrogenperoksid ved mitokondriesuperoksiddismutaser (SODs)14. Hydrogenperoksid kan deretter spre seg ut av mitokondriene og forårsake oksidativt stress i andre rom i cellen. Derfor beskriver vi paraquat overlevelseanalyser som målefølsomhet for både mitokondrie- og oksidativt stress (andre oksidative stressanalyser kan bli funnet15).
Termotoleranse analyser utføres i C. elegans ved å plassere dyr i forhøyede temperaturer. Omgivelsestemperaturer for nematoder er ~ 15-20 °C og termisk stress induseres ved temperaturer over 25 °C16,17. Termotoleranse analyser utføres vanligvis ved temperaturer fra 30-37 °C, da dyr viser store cellulære defekter ved denne temperaturen, og overlevelsesanalyser fullføres innen 24 timer16,18. Her er det gitt to alternative metoder for å utføre termotoleranseanalyser: vekst ved 34 °C og vekst ved 37 °C. Sammen kan protokollene som presenteres her brukes til å utføre store skjermer når de kombineres med standard genknock-down ved hjelp av RNA-interferens eller kjemiske legemiddelbiblioteker.
Protokollen kan deles inn i 4 brede prosedyrer- vekst av C. elegans og forberedelse til bildebehandling (avsnitt 1 og 2), avbildning av transkripsjonelle reportere ved hjelp av fluorescerende mikroskopi (avsnitt 3-5), kvantitative målinger av journalister ved hjelp av et cytometer for stor partikkelstrøm (avsnitt 6) og fysiologiske analyser for å måle stressfølsomhet i C. elegans (avsnitt 7).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>for mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118072</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco granulated agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-782</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>C0051-25</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>350-5000-000</td>
			<td>equipped with a 488 nm light source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Cleaning Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5072-000</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Sheath Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5070-100</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG dioxane free</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>CI8280-4</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426500</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M205FA stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450040</td>
			<td>equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0070-3</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>75990-514</td>
			<td>equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289-50G</td>
			<td>for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tert-butyl hydroperoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>458139</td>
			<td>for oxidative stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660-5G</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurements of physiological stress responses in c. elegans

Organismer blir ofte utsatt for varierende miljøer og endringer i intracellulær homeostase, som kan ha skadelige effekter på deres proteome og fysiologi. Dermed har organismer utviklet seg målrettet og spesifikke stressresponser dedikert til å reparere skade og opprettholde homeostase. Disse mekanismene inkluderer den utfoldede proteinresponsen til endoplasmatisk reticulum (UPRER),den utfoldede proteinresponsen til mitokondriene (UPRMT),varmesjokkresponsen (HSR) og oksidativ stressrespons (OxSR). Protokollene som presenteres her beskriver metoder for å oppdage og karakterisere aktiveringen av disse banene og deres fysiologiske konsekvenser i nematoden, C. elegans. For det første er bruk av veispesifikke fluorescerende transkripsjonelle reportere beskrevet for rask cellulær karakterisering, narkotikascreening eller storskala genetisk screening (f.eks. RNAi eller mutantbiblioteker). I tillegg beskrives komplementære, robuste fysiologiske analyser, som kan brukes til å direkte vurdere følsomhet en dyr til spesifikke stressfaktorer, og fungerer som funksjonell validering av transkripsjonsreporterne. Sammen tillater disse metodene rask karakterisering av cellulære og fysiologiske effekter av interne og eksterne proteotoksiske perturbasjoner.

Bruke transkripsjonelle reportere til å måle aktivering av stressresponser Her brukes fluorescerende transkripsjonelle reportere, som fungerer som robuste verktøy for å måle aktivering av de fleste stressresponser i C. elegans. GFP-uttrykk drives under arrangøren av kanoniske mål for master transkripsjonelle regulatorer involvert i å svare på kupéspesifikke påkjenninger. En omfattende liste over vanlige transkripsjonelle reportere er tilgjengelig i ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Her karakteriserer vi cellulære proteotoksiske stressresponser i nematoden C. elegans ved å måle aktiveringen av fluorescerende transkripsjonelle journalister og assaying følsomhet for fysiologisk stress.

Målinger av fysiologiske stressresponser i C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Disse metodene kan brukes til å karakterisere stressresponser i C.elegans og for å avgjøre om genetiske eller farmakologiske perturbasjoner påvirker aktiveringen av beskyttende cellulære veier. Disse metodene tillater rask og høy gjennomstrømning testing av hundrevis av perturbasjoner som gen knockdown både på molekylære og fysiologiske nivåer. For å sikre at analysen utføres riktig, inkluderer positive og negative kontroller.Synkroniser friske, velddde dyr til riktig stadium og bruk ferske plater for eksperimentet. Visualisering av mikromanipulering av ormene med en pick kan hjelpe nye brukere å forstå hvordan ormene kan stilles opp og vurderes for levedyktighet. Demonstrere prosedyrene vil være Phil Frankino, Holly Gildea, og Melissa Metcalf, graduate studenter i vårt laboratorium.For å bruke dyr som uttrykker GFP under promotering av varmesjokkproteinet fire for aktivering av endoplasmatisk retikum utfoldet proteinrespons, vokse synkroniserte reporterdyr ved 20 grader Celsius til L4-scenen og vask ormene av platen ved hjelp av M9 medium og overfør til et rør. Etter å ha samlet ormene ved sentrifugering, erstatt M9 med 25 nanogram per milliliter av stoffet av interesse for M9 eller dimetylsulfoksid i M9 i kontrolldyrrørene. Plasser deretter ormene på en roterende plattform i tre til fire timer ved 20 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen sentrifugerer ormene for å bosette seg før du erstatter behandlingsløsningen med 15 milliliter M9 alene. Etter to vasker, overfør dyrene til NGM plater eller NGM RNA interferensplater etter behov og la ormene å gjenopprette over natten ved 20 grader Celsius. Når ormene har kommet seg, legg til fem til 10 mikroliter på 100 millimolar natriumazid på en standard NGM-plate uten bakterier og legg en plate med ormer under et dissekerende mikroskop.Overfør 10 til 20 dyr fra platen til stedet for natriumazid. Dyrene bør gripe bevegelse kort tid etter landing i saltoppløsningen. Når natriumazidet har fordampet, stille opp dyrene i ønsket bildeoppsett med fremre og bakre sider i samme retning for alle dyrene og legg umiddelbart platen av dyr under et stereomikroskop.Start stereomikroskopbildeprogramvaren, og klikk åpne prosjekter og mappe under anskaffelsene for å åpne et nytt prosjekt. Høyreklikk og velg gi nytt navn for å gi nytt navn til mappen. Plasser ormprøven under mikroskopets mål, og bruk Brightfield-innstillingen til å finne det riktige fokuspunktet for ormene for å minimere fluorescerende bleking.Midten av prøven vil være det punktet hvor linjen av egg er tydelig synlig og ikke fuzzy. Angi eksponeringstiden for å sikre at pikslene ikke er mettet, og også for å sikre at signalet er over deteksjonsgrensen. Når du har satt eksponeringstiden, zoomen, fokuset og Brightfield-kondensatorene til de riktige innstillingene, klikker du på bildeknappen for å hente et bilde.For avbildning ved hjelp av et sammensatt bredfeltmikroskop plasserer du den opprinnelige kontrollbehandlingsplaten på det sammensatte bredfeltsmikroskopstadiet og bruker styreplaten til å starte kontrollprogrammet. Opprett et nytt album og filnavn og plasser platen under objektivobjektivet. Bruk grunnlinjekontrollen og de positive kontrollplatene til å stille inn eksponeringstiden og fluorescensintensiteten slik at signalet er synlig, men ikke mettet.Lagre deretter Brightfield- og GFP FITC-bilder. For å kvantifisere induksjonen av reporteren ved stor partikkelstrømcytometri, slå først på cytometerlasere og åpne cytometerprogramvaren. Klikk start for å slå på lasere i programvarevinduet og klikk kjør for å starte laseren i argon laser kontroll popup-vinduet.Når laseren når rundt 12 milliwatt og 488 lyskildenivået går opp til rundt 12, klikk gjort og sjekk de fire trykkverdiene. Hvis verdiene ligner på de som er observert i det opprinnelige oppsettet, merker du av for trykk-OK. Deretter, for å sikre at det ikke er luftbobler eller rusk som blokkerer strømmen av hylse og prøve gjennom strømningscellen, klikker du rengjør flere ganger.Slå deretter av sortering og på hylse for å starte strømmen på nytt. For å sjekke strømningshastigheten, samle hylsen i 60 sekunder. Samle hylsen i et 15 milliliter rør i 60 sekunder.Strømningshastigheten skal være ni til 10 milliliter per minutt. For å kjøre prøvene, juster laserfotomultiplierkraften til et nivå høyt nok til at signalet er over deteksjonsgrensen, men ikke høyere enn metningsgrensen. Utfør størrelse gating for å utelukke bobler, rusk, egg og andre uønskede små partikler og å inkludere bare dyr av interesse som voksne.Når screeningparametrene er angitt, legger du til de forberedte ormene i en kopp og klikker på hent. Pass på at all væske ikke tas opp i maskinen, da dette vil føre til at strømningssytometeret tar inn luft og skaper bobler i detektoren. Når prøven er lav og/eller nok dyr er samlet inn, klikker du stopp.Hvis du vil lagre inngjerdede data basert bare på størrelsesbegrensningene, klikker du oppsett, datalagring, bare inngjerdet og lagrer inngjerdet for å lagre dataene. Skyll deretter oppsamlingskoppen med avionisert vann og fjern vasken med vakuum tre ganger før du gjentar analysen med neste prøve. For å måle mitokondrie- og oksidativ stressfølsomhet, tilsett 50 til 75 mikroliter Paraquat i M9 til åtte til 10 brønner per tilstand av en flat bunn 96-brønnsplate og overfør åtte til 10 ormer per tilstand til hver brønn av Paraquat.Annenhver time, trykk platen forsiktig for å få de levende dyrene til å slå eller bøye for å tillate scoring av antall døde dyr per brønn. For å måle dyrenes temperaturfølsomhet, inkuber ormene i tre til fire dager ved 20 grader Celsius før du plating 10 til 15 dyr per plate per tilstand for totalt fire til seks plater. Plasser deretter platene i en 34 eller 37 grader Celsius inkubator og score ormen overlevelse annenhver time som nettopp demonstrert.HSP-4 reporter har minimal basal inntrykk i fravær av stress, men viser et robust GFP uttrykk når dyrene er utsatt for endoplasmatisk reticulum stress ved hjelp av stoffet Tunicamycin. Disse forskjellene kan også kvantifiseres ved hjelp av et stort partikkelstrømningscytometer. Videre kan induksjon av transgene under endoplasmisk reticulum stress være helt supressed ved knockdown av XBP-1 via RNA interferens.Lignende analyser kan utføres for å måle mitokondriestress, oksidativt stress og varmestress. Hele dyrefysiologiske reaksjoner på stress kan også måles ved hjelp av flere overlevelsesanalyser. For eksempel brukes eksponering for Tunicamycin til å måle endoplasmatisk retikuulum stressfølsomhet.Nedslag av XBP-1-genet resulterer i en betydelig økning i følsomheten for Tunicamycin. Videre brukes eksponering for det kjemiske middelet Paraquat til å måle oksidativ og mitokondriestressfølsomhet. Knockdown av DAF-2 genet resulterer i en betydelig økning i resistens mot Paraquat.Termotolerance kan måles ved å bestemme dyrenes overlevelse ved forhøyede temperaturer og kan plottes som en overlevelseskurve. Disse analysene bør utføres minst fire til seks ganger, og alle replikeringene bør plottes mot hverandre som termotoleranse viser en utrolig høy variasjon sammenlignet med andre stressanalyser. Når du avbilder dyr, er det viktig å angi parametrene slik at det ikke er over eller under metning av signal og for å sikre at de samme parametrene brukes gjennom hele eksperimentet.Bildeprotokollene som er beskrevet her, er mottagelige for storskalascreening, inkludert genomdekkende skjermer, og er gode for både utforskende og bekreftende studier som deretter kan følges opp av de fysiologiske analysene som er beskrevet.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening for å identifisere Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

Linking predasjonsrisiko, Herbivore fysiologisk stress og mikrobiell nedbryting av Plant Kull

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis analysen

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antistoffarging i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Ved hjelp av &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

En Anoksi-sult Modell for iskemi / Reperfusjon i<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder for Skin såre og Analyser for Wound Responses i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Metoder for å vurdere subcellulære avdelinger av muskel i<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...