Name: measurements of physiological stress responses in c. elegans
Uploaded: 2020-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

R.BZ. é apoiado pela bolsa de longo prazo EMBO e a Fundação Larry L. Hillblom. O R.H.S é apoiado pela bolsa 5F32AG032023-02 através do Instituto Nacional de Envelhecimento (NIA) e da Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship. A A.F. é apoiada pelo subsídio F32AG051355 através da NIA. H.K.G. é apoiado pela bolsa DGE1752814 através do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. é suportado por 1F31AG060660-01 através da NIA. A.D. é apoiado pela Fundação Thomas e Stacey Siebel, o Howard Hughes Medical Institute, e 4R01AG042679-04 e 5R01AG055891-02 da NIA, e 5R01ES021667-09 da NIEHS. Agradecemos a Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet e Anel Esquivel por assistência técnica significativa. Agradecemos ao laboratório morimoto e ao CGC (financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) por tensões.

1. Condições padrão de crescimento das temperaturas e OP50 vs HT115
<ol><li>Crescimento e expansão padrão<ol>
<li>Cultivar uma cultura de OP50 em LB(Tabela 1) ou mídia equivalente de escolha para 24-48 h à temperatura ambiente (~22-25 °C). Cultivar bactérias à temperatura ambiente como OP50 é um auxotroph uracil e há uma maior incidência de revertantes (por exemplo, mutantes supressores) quando cultivados a 37 °C. O armazenamento a longo prazo das culturas OP50 não é recomendado (máx 1...

Aqui, são descritos métodos para interrogar respostas de estresse celular em C. elegans,usando repórteres transcritores fluorescentes e ensaios de sobrevivência do estresse fisiológico. Todos os repórteres utilizam a expressão GFP conduzida sob o promotor de um alvo transcricional a jusante dos fatores de transcrição envolvidos na montagem das respostas ao estresse celular. O uso de hsp-4p::GFP modulado por XBP-1s mediado UPRER, hsp-6p::GFP controlado por ATFS-1 mediado UPR<...

A capacidade de um organismo de responder a mudanças no ambiente intra e extracelular é crucial para sua sobrevivência e adaptação. Isso é feito em nível celular através de numerosas vias de proteção que garantem a integridade da célula. Embora numerosos componentes celulares estejam sujeitos a danos associados ao estresse, um grande envolvimento das respostas ao estresse celular é reparar e proteger a homeostase do proteome celular. No entanto, a compartimentação de proteínas em estruturas especiais, chamadas organelas, representa um desafio para a célula, pois não pode contar com uma forma centralizada de controle de qualidade proteica para garantir que todas as proteínas dentro da célula sejam devidamente dobradas e funcionais. Portanto, para lidar com perturbações de suas proteínas, organelas desenvolveram mecanismos dedicados de controle de qualidade, que podem sentir proteínas desdobradas e ativar uma resposta ao estresse na tentativa de aliviar o estresse dentro desse compartimento. Por exemplo, o citosol depende da resposta ao choque térmico (HSR), enquanto o retículo endoplasmático (ER) e mitocôndrias dependem de suas respostas proteicas desdobradas específicas do compartimento (UPR). O OxSR serve para aliviar os efeitos tóxicos das espécies de oxigênio reativa (ROS). Cada resposta ao estresse é desencadeada na presença de desafios celulares e insultos ambientais e induz uma resposta transcricional sob medida. As marcas dessas respostas incluem sintetizar moléculas que redobram proteínas desdobradas (como acompanhantes) direcionadas à organela adequada, ou, alternativamente, remover proteínas danificadas pela degradação proteica. A falha em ativar essas respostas de estresse resulta no acúmulo de proteínas danificadas, disfunção celular propagada para falha sistêmica dos tecidos e, eventualmente, morte do organismo. A função e a regulação das diferentes respostas ao estresse são revisadas em outros lugares1.
Muitos insights sobre a regulação e atividade das respostas ao estresse celular foram atribuídos ao nematode, Caenorhabditis elegans, um organismo modelo multicelular em pesquisa genética. Os nematóides não só permitem estudar a ativação das respostas ao estresse no nível celular, mas também no nível organismo; nematóides têm sido usados para estudar os efeitos de perturbações genéticas ou exposição a drogas e poluentes em seu crescimento e sobrevivência. Seu tempo de geração rápida, isogenia, transparência, trabilidade genética e facilidade de uso durante a experimentação os tornam ideais para tais estudos. Além disso, a resposta fisiológica relativamente rápida ao estresse (entre horas e poucos dias) e a conservação evolutiva das vias celulares fazem dos nematóides uma ferramenta proeminente no estudo da resistência ao estresse.
Existem duas cepas de E. coli comumente usadas como fonte de alimento para cultivar C. elegans: padrão OP50, uma cepa B na qual a maioria das experimentações foi historicamente realizada2 e HT115, uma cepa K-12 que é usada para quase todos os experimentos RNAi3,4. É importante notar que existem diferenças significativas entre as dietas bacterianas OP50 e HT115. O crescimento dessas diferentes fontes bacterianas tem sido demonstrado para causar grandes diferenças no perfil metabólico, número de cópia de DNA mitocondrial e vários dos principais fenótipos, incluindo a vida útil5. Algumas dessas diferenças são atribuídas à deficiência de Vitamina B12 associada ao crescimento das bactérias OP50, o que pode resultar em defeitos na homeostase mitocondrial e aumento da sensibilidade a patógenos e estresses. Todos esses fenótipos têm sido amenizados pelo crescimento das bactérias HT115, que têm níveis mais elevados de Vitamina B126. Portanto, recomenda-se que todos os experimentos em respostas fisiológicas ao estresse sejam realizados em bactérias HT115, independentemente da necessidade das condições rnai. No entanto, devido à facilidade de manutenção de animais na OP50, todo o crescimento padrão (ou seja, manutenção e amplificação de animais) pode ser realizado na OP50, uma vez que diferenças significativas nos paradigmas experimentais descritos aqui não foram detectadas em vermes mantidos na OP50 desde que fossem transferidos para HT115 pós-sincronização (ou seja, de eclosão pós-branqueamento com ou sem L1) até a experimentação.
Aqui, é descrita a caracterização da atividade das respostas ao estresse celular utilizando dois métodos funcionais. Deve-se notar que os protocolos apresentados são focados principalmente nas respostas ao estresse celular e seu impacto na homeostase proteica. Em primeiro lugar, são utilizados repórteres transcricionais fluorescentes, que são regulados por promotores genéticos endógenos que são especificamente ativados em resposta a diferentes tensões celulares. Esses repórteres transcritores fluorescentes baseiam-se na indução transcricional de genes específicos que fazem parte nativamente da resposta ao estresse. Por exemplo, hSP-4, um ortologode de proteína de choque térmico para a acompanhante humana HSPA5/BiP, é ativado sobre o estresse er e localiza-se para o ER para aliviar o estresse. Em condições de estresse er (por exemplo, exposição à tnicamicina), uma proteína fluorescente verde (GFP), colocada sob a regulação do promotor hsp-4, é sintetizada em altos níveis, como pode ser avaliada por microscopia fluorescente ou quantitativamente medida utilizando citometria de fluxo de partículas grandes de nematóides7. Da mesma forma, utiliza-se o promotor de um acompanhante mitocondrial, hsp-6 (ortologos a mamíferos HSPA9), para monitorar a ativação do UPRMT8, e o promotor da acompanhante citossólica hsp-16.2 (ortologous aos genes alfa cristalino humano) é utilizado para avaliar a atividade do HSR9. Esses repórteres permitem uma rápida caracterização dos caminhos ativados em resposta a várias perturbações.
Muitas vezes, os repórteres aqui apresentados são imagem do uso de microscopia, que fornece uma saída qualitativa da ativação de respostas ao estresse. No entanto, embora as técnicas de imagem forneçam informações sobre a intensidade e a localização do tecido dos repórteres descritos acima, sua quantificação nem sempre é precisa ou robusta. Embora seja possível quantificar a ativação fluorescente usando ferramentas de análise de imagem, esses métodos são relativamente baixos de throughput e o tamanho da amostra é pequeno, devido ao número relativamente baixo de animais com imagem. A facilidade e a capacidade de obter grandes quantidades de animais rapidamente fazem de C. elegans um sistema de modelo ideal para medir a ativação de repórteres de estresse fluorescente através do uso de um grande citómetro de fluxo de partículas. Um citómetro de fluxo de partículas grandes é capaz de registrar, analisar e classificar com base no tamanho e fluorescência de muitos animais vivos. Usando este método, é possível obter a intensidade fluorescente, tamanho e também informações espaciais (2D) para milhares de vermes. O sistema é controlado utilizando o FlowPilot, que permite a aquisição e análise de dados em tempo real dos parâmetros medidos. Aqui, métodos para imagens microscópicas e análise quantitativa usando um citómetro de fluxo de partículas de grande porte são oferecidos como métodos para medir a ativação das respostas ao estresse.
Além da análise do repórter, a sensibilidade ou resistência dos animais ao estresse pode ser medida por meio de ensaios de estresse fisiológico. Isso é conseguido expondo animais a ambientes estressantes que ativam vias específicas de estresse celular. Aqui, vários métodos são fornecidos para medir a sensibilidade de animais inteiros a tipos específicos de estressores.
O estresse er é aplicado a C. elegans usando o agente químico, tunicamicina, que bloqueia a glicosilação ligada a N, causando acúmulo de proteínas dobradas no ER10. Em C. elegans,o crescimento após a exposição à tnicamicina resulta em grandes perturbações na função ER, e uma redução significativa da vida útil11. Ao medir a sobrevivência dos animais em placas contendo tnicamicina, a sensibilidade ao estresse de ER dos animais pode ser quantificada. Por exemplo, animais com indução ectópica UPRER e, portanto, aumento da resistência ao estresse desdobrado de proteína no PS têm uma sobrevida aumentada sobre a exposição à tnicamicina em comparação com animais do tipo selvagem12.
O estresse oxidativo e mitocondrial é aplicado aos C. elegans expondo os animais ao agente químico, paraquat. Paraquat é um herbicida comumente usado, que causa formação de superóxido especificamente nas mitocôndrias13. Devido à localização específica de espécies de oxigênio reativo derivadas de mitocôndrias (ROS), ensaios de paraquat são frequentemente usados como um ensaio de estresse "mitocondrial". No entanto, o superóxido é rapidamente convertido em peróxido de hidrogênio por dismutases de superóxido mitocondrial (SODs)14. O peróxido de hidrogênio pode posteriormente difundir-se para fora das mitocôndrias e causar estresse oxidativo em outros compartimentos da célula. Por isso, descrevemos ensaios de sobrevivência de paraquat como a sensibilidade de medição tanto ao estresse mitocondrial quanto ao oxidativo (outros ensaios de estresse oxidativo podem ser encontrados15).
Os ensaios de termotolerância são realizados em C. elegans colocando animais em temperaturas elevadas. As temperaturas ambientes para nematóides são de ~15-20 °C e o estresse térmico é induzido a temperaturas acima de 25 °C16,17. Os ensaios de termotolerância são geralmente realizados a temperaturas que variam de 30-37 °C, uma vez que os animais apresentam grandes defeitos celulares a esta temperatura, e os ensaios de sobrevivência são concluídos dentro de 24 horas16,18. Aqui, dois métodos alternativos são fornecidos para a realização de ensaios de termotolerância: crescimento a 34 °C e crescimento a 37 °C. Juntos, os protocolos aqui apresentados podem ser utilizados para realizar telas em larga escala quando combinados com o knock-down genético padrão usando interferência de RNA ou bibliotecas de medicamentos químicos.
O protocolo pode ser dividido em 4 procedimentos amplos: crescimento de C. elegans e preparação para imagens (seções 1 e 2), imagens de repórteres transcritores usando microscopia fluorescente (seções 3-5), medidas quantitativas de repórteres usando um citómetro de fluxo de partículas de grande porte (seção 6) e ensaios fisiológicos para medir a sensibilidade ao estresse em C. elegans (seção 7).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>for mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118072</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco granulated agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-782</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>C0051-25</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>350-5000-000</td>
			<td>equipped with a 488 nm light source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Cleaning Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5072-000</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Sheath Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5070-100</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG dioxane free</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>CI8280-4</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426500</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M205FA stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450040</td>
			<td>equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0070-3</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>75990-514</td>
			<td>equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289-50G</td>
			<td>for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tert-butyl hydroperoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>458139</td>
			<td>for oxidative stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660-5G</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurements of physiological stress responses in c. elegans

Organismos são frequentemente expostos a ambientes flutuantes e mudanças na homeostase intracelular, que podem ter efeitos prejudiciais em seu proteome e fisiologia. Assim, os organismos evoluíram respostas de estresse direcionadas e específicas dedicadas a reparar danos e manter a homeostase. Esses mecanismos incluem a resposta proteica desdobrada do retículo endoplasmático (UPRER),a resposta proteica desdobrada das mitocôndrias (UPRMT),a resposta ao choque térmico (HSR) e a resposta ao estresse oxidativo (OxSR). Os protocolos aqui apresentados descrevem métodos para detectar e caracterizar a ativação dessas vias e suas consequências fisiológicas no nematoide, C. elegans. Em primeiro lugar, o uso de repórteres transcritores fluorescentes específicos da via é descrito para caracterização celular rápida, triagem de drogas ou triagem genética em larga escala (por exemplo, RNAi ou bibliotecas mutantes). Além disso, são descritos ensaios fisiológicos complementares e robustos, que podem ser utilizados para avaliar diretamente a sensibilidade dos animais a estressores específicos, servindo como validação funcional dos repórteres transcritores. Juntos, esses métodos permitem a rápida caracterização dos efeitos celulares e fisiológicos das perturbações proteotóxicas internas e externas.

Usando repórteres transcritores para medir a ativação de respostas ao estresse Aqui, são utilizados repórteres transcricionais fluorescentes, que servem como ferramentas robustas para medir a ativação da maioria das respostas ao estresse em C. elegans. A expressão GFP é conduzida sob o promotor de alvos canônicos de reguladores transcritores mestres envolvidos na resposta a tensões específicas do compartimento. Uma lista abrangente de repórteres t...

Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Aqui, caracterizamos as respostas de estresse proteotóxico celular no nematoide C. elegans medindo a ativação de repórteres transcritores fluorescentes e atribuindo sensibilidade ao estresse fisiológico.

Medições de Respostas de Estresse Fisiológico em C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Esses métodos podem ser usados para caracterizar respostas ao estresse em C.elegans e para determinar se perturbações genéticas ou farmacológicas afetam a ativação de vias celulares protetoras. Esses métodos permitem testes rápidos e de alto rendimento de centenas de perturbações, como o knockdown genético, tanto nos níveis molecular e fisiológico. Para garantir que o ensaio seja realizado corretamente, inclua controles positivos e negativos.Sincronizar animais saudáveis e bem alimentados até o estágio adequado e usar placas frescas para o experimento. A visualização da micromanipulação dos worms com uma picareta pode ajudar os novos usuários a entender como os worms podem ser alinhados e avaliados para viabilidade. Os procedimentos serão Phil Frankino, Holly Gildea e Melissa Metcalf, estudantes de pós-graduação em nosso laboratório.Para usar animais expressando GFP sob o promotor da proteína de choque térmico quatro para ativação do reticúlo endoplasmático desdobrado resposta proteica, crescer animais repórteres sincronizados a 20 graus Celsius até o estágio L4 e lavar os vermes da placa usando m9 médio e transferir para um tubo. Depois de coletar os vermes por centrifugação, substitua o M9 por 25 nanogramas por mililitro da droga de interesse em M9 ou sulfóxido de dimetil em M9 nos tubos de animais de controle. Em seguida, coloque os vermes em uma plataforma rotativa por três a quatro horas a 20 graus Celsius.No final da incubação, centrifugar os vermes para se estabelecer antes de substituir a solução de tratamento por 15 mililitros de M9 sozinho. Após duas lavagens, transfira os animais para placas de NGM ou placas de interferência de NGM RNA conforme apropriado e permita que os vermes se recuperem durante a noite a 20 graus Celsius. Quando os vermes se recuperarem, adicione cinco a 10 microlitros de 100 mililitros de sódio em uma placa NGM padrão sem bactérias e coloque uma placa de vermes sob um microscópio dissecando.Transfira de 10 a 20 animais da placa para o local do azida de sódio. Os animais devem aproveitar o movimento logo após o pouso na solução de sal. Uma vez que o azida de sódio tenha evaporado, alinhe os animais na configuração de imagem desejada com os lados anterior e posterior na mesma orientação para todos os animais e coloque imediatamente a placa de animais sob um microscópio estéreo.Inicie o software de imagem de microscópio estéreo e sob a guia de aquisições, clique em projetos abertos e pasta para abrir um novo projeto. Clique com o botão direito do mouse e selecione renomear para renomear a pasta. Posicione a amostra de vermes sob o objetivo do microscópio e use a configuração Brightfield para localizar o ponto focal correto dos vermes para minimizar o branqueamento fluorescente.O centro da amostra será o ponto em que a linha de ovos é claramente visível e não confuso. Defina o tempo de exposição para garantir que os pixels não estejam saturados e também para garantir que o sinal esteja acima do limite de detecção. Depois de definir o tempo de exposição, zoom, foco e condensadores Brightfield nas configurações apropriadas, clique no botão de imagem de captura para adquirir uma imagem.Para imagens usando um microscópio composto de campo largo, coloque a placa de tratamento de controle da linha de base no estágio de microscópio de campo largo composto e use a almofada de toque para iniciar o programa de controle. Crie um novo álbum e nome de arquivo e posicione a placa sob a lente objetiva. Use o controle da linha de base e as placas de controle positivas para definir o tempo de exposição e a intensidade da fluorescência para que o sinal seja visível, mas não saturado.Em seguida, salve imagens Brightfield e GFP FITC. Para quantificar a indução do repórter por grande citometria de fluxo de partículas, primeiro ligue os lasers do citógrafo e abra o software do citômetro. Clique para ligar os lasers na janela do software e clique em correr para iniciar o laser na janela popup de controle a laser de argônio.Quando o laser atingir cerca de 12 miliwatts e o nível de fonte de luz 488 subir para cerca de 12, clique feito e verifique os quatro valores de pressão. Se os valores forem semelhantes aos observados na configuração original, verifique a caixa OK de pressão. Em seguida, para ter certeza de que não há bolhas de ar ou detritos bloqueando o fluxo da baia e amostra através da célula de fluxo, clique limpo várias vezes.Em seguida, desligue a classificação e a baia para reiniciar o fluxo. Para verificar a vazão, recolha a baia por 60 segundos. Colete a baia em um tubo de 15 mililitros por 60 segundos.A vazão deve ser de 9 a 10 mililitros por minuto. Para executar as amostras, ajuste a potência fotomultiplier do laser a um nível alto o suficiente para que o sinal esteja acima do limite de detecção, mas não superior ao limite de saturação. Realize o tamanho do gating para excluir bolhas, detritos, ovos e outras pequenas partículas indesejadas e incluir apenas os animais de interesse, como adultos.Quando os parâmetros de triagem tiverem sido definidos, adicione os worms preparados a um copo e clique em adquirir. Observe para ter certeza de que todo o líquido não é levado para dentro da máquina, pois isso fará com que o citômetro de fluxo tome ar e crie bolhas dentro do detector. Quando a amostra estiver baixa e/ou animais suficientes tiverem sido coletados, clique em parar.Para armazenar dados fechados com base apenas nas restrições de tamanho, clique na configuração, armazenamento de dados, somente fechado e fechado para salvar os dados. Em seguida, enxágue o copo de coleta com água deionizada e remova a lavagem por vácuo três vezes antes de repetir a análise com a próxima amostra. Para medir a sensibilidade ao estresse mitocondrial e oxidativo, adicione 50 a 75 microliters de Paraquat em M9 a 8 a 10 poços por condição de uma placa plana de 96 poços e transfira de oito a dez vermes por condição para cada poço de Paraquat.A cada duas horas, toque suavemente na placa para fazer com que os animais vivos batam ou dobrem para permitir a pontuação do número de animais mortos por poço. Para medir a sensibilidade à temperatura dos animais, incubar os vermes por três a quatro dias a 20 graus Celsius antes de emplacar de 10 a 15 animais por placa por condição para um total de quatro a seis placas. Em seguida, coloque as placas em uma incubadora Celsius de 34 ou 37 graus e marque a sobrevivência do verme a cada duas horas como apenas demonstrado.O repórter hsp-4 tem mínima impressão basal na ausência de estresse, mas exibe uma expressão robusta de GFP quando os animais são expostos ao estresse rídulo endoplasmático usando a droga Tunicamycin. Essas diferenças também podem ser quantificadas usando um grande citômetro de fluxo de partículas. Além disso, a indução do transgene sob estresse órticulo endoplasmático pode ser completamente suprimida pelo knockdown de XBP-1 via interferência de RNA.Ensaios semelhantes podem ser realizados para medir o estresse mitocondrial, o estresse oxidativo e o estresse térmico. Respostas fisiológicas animais inteiras ao estresse também podem ser medidas usando vários ensaios de sobrevivência. Por exemplo, a exposição à Tunicamicycin é usada para medir a sensibilidade ao estresse rítmico endoplasmático.A derrubada do gene XBP-1 resulta em um aumento significativo na sensibilidade à Tunicamiciccin. Além disso, a exposição ao agente químico Paraquat é usada para medir a sensibilidade ao estresse oxidativo e mitocondrial. O knockdown do gene DAF-2 resulta em um aumento significativo da resistência ao Paraquat.A termotolerância pode ser medida determinando a sobrevivência de animais a temperaturas elevadas e pode ser traçada como uma curva de sobrevivência. Esses ensaios devem ser realizados pelo menos quatro a seis vezes e todas as réplicas devem ser plotadas umas contra as outras, pois a termotolerância demonstra uma variabilidade incrivelmente alta em comparação com outros ensaios de estresse. Ao fotografar animais, é fundamental definir os parâmetros de tal forma que não haja mais ou sob saturação de sinal e para garantir que os mesmos parâmetros sejam usados ao longo do experimento.Os protocolos de imagem descritos aqui são favoráveis à triagem em larga escala, incluindo telas de genoma e são ótimos para estudos exploratórios e confirmatórios que podem ser seguidos pelos ensaios fisiológicos descritos.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biologia

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Monitoramento hormônios vegetais Durante Respostas ao Estresse

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Geração de transgênicos C. elegans Por biobalística Transformação

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

Ligando o risco de predação, Stress herbívoro fisiológica e decomposição da maca Usina

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Anticorpo de coloração em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Usando o &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Métodos para a pele ferimento e Ensaios para Responses ferida no<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Métodos para avaliar os compartimentos subcelulares do músculo em C. elegans.

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...