Name: measurements of physiological stress responses in c. elegans
Uploaded: 2020-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

R.BZ. поддерживается EMBO долгосрочной стипендий и Ларри Л. Hillblom фонда. R.H.S поддерживается грантом 5F32AG032023-02 через Национальный институт старения (NIA) и Фонд Гленн для медицинских исследований постдокторской стипендий. A.F. поддерживается грантом F32AG051355 через NIA. H.K.G. поддерживается грантом DGE1752814 в рамках Программы стипендий для аспирантов Национального научного фонда. M.G.M. поддерживается 1F31AG060660-01 через NIA. A.D. поддерживается Фондом Томаса и Стейси Зибеля, Медицинским институтом Говарда Хьюза и 4R01AG042679-04 и 5R01AG05891-02 от NIA и 5R01ES021667-09 от NIEHS. Мы благодарим Ларри Джо, Мелиссу Санчес, Нааме Келет и Анэла Эскивеля за значительную техническую помощь. Мы благодарим лабораторию Моримото и CGC (финансируется NIH Office исследовательской инфраструктуры программы P40 OD010440) для штаммов.

1. Стандартные условия роста температур ы и OP50 против HT115
<ol><li>Стандартный рост и расширение<ol>
<li>Выращивайте культуру OP50 в LB(таблица 1)или эквивалентные носители выбора для 24-48 ч при температуре окружающей среды (22-25 градусов по Цельсию). Выращивайте бактерии при комнатной темпе...

Здесь описаны методы для изучения клеточных реакций стресса в C. elegans,с помощью флуоресцентных транскрипционных репортеров и физиологических анализов выживания стресса. Репортеры все используют выражение GFP приводом под промоутер вниз по течению транскрипционной цели транскрипц...

Способность организма реагировать на изменения внутри- и внеклеточной среды имеет решающее значение для его выживания и адаптации. Это достигается на клеточном уровне через многочисленные защитные пути, которые обеспечивают целостность клетки. В то время как многочисленные клеточные компоненты подвержены стресс-ассоциированных повреждений, одним из основных участие клеточных реакций стресса является ремонт и защита гомеостаза клеточного протеома. Тем не менее, разобщенство белков в специальные структуры, называемые органеллами, представляет собой проблему для клетки, так как она не может полагаться на одну централизованную форму контроля качества белка, чтобы гарантировать, что все белки в клетке правильно сложены и функциональны. Поэтому, чтобы справиться с возмущениями к их белкам, органеллы развили специальные механизмы контроля качества, которые могут чувствовать неправильно сложенные белки и активировать стресс ответ в попытке облегчить стресс в этом отсеке. Например, цитозол опирается на реакцию теплового шока (HSR), в то время как эндоплазмический ретикулум (ER) и митохондрии полагаются на их отсек конкретных развернутых белковых реакций (UPR). OxSR служит для облегчения токсического воздействия реактивных видов кислорода (ROS). Каждый стресс ответ вызывается в присутствии сотовых проблем и экологических оскорблений и вызывает индивидуальный транскрипционный ответ. Отличительными чертами этих ответов являются синтез молекулы, которые повторно складываются неправильно сложенные белки (например, сопровождающие), предназначенные для надлежащей органеллы, или же, удалить поврежденные белки путем деградации белка. Неспособность активировать эти стрессовые реакции приводит к накоплению поврежденных белков, клеточной дисфункции, распространяемых на системный отказ тканей, и в конечном итоге смерти организма. Функция и регулирование различных ответов на стресс рассматриваются в другом месте1.
Многие идеи в отношении регулирования и активности клеточных реакций стресса были отнесены к нематод, Caenorhabditis elegans, многоклеточной модели организма в генетических исследованиях. Нематоды позволяют изучать активацию стрессовых реакций не только на клеточном уровне, но и на уровне организма; нематод были использованы для изучения влияния генетических возмущений или воздействия наркотиков и загрязняющих веществ на их рост и выживание. Их быстрое время генерации, изогенность, прозрачность, генетическая уступчивость и простота использования во время экспериментов делают их идеальными для таких исследований. Кроме того, относительно быстрая физиологическая реакция на стресс (между часами и несколькими днями) и эволюционное сохранение клеточных путей делают нематоды выдающимся инструментом в изучении стрессоустойчивости.
Есть два широко используемых штаммов кишечной палочки, используемых в качестве источника пищи для выращивания C. elegans: стандартный OP50, штамм B, в котором большинство экспериментов было исторически выполнено2 и HT115, штамм K-12, который используется почти для всех экспериментов РНК3,4. Важно отметить, что существуют значительные различия между OP50 и HT115 бактериальных диет. Рост на этих различных бактериальных источников было показано, что причиной серьезных различий в метаболических профиля, митохондриальной КОПИи днк номер, и несколько основных фенотипов, в том числе продолжительность жизни5. Некоторые из этих различий объясняются дефицитом витамина В12, связанным с ростом бактерий OP50, что может привести к дефектам митохондриального гомеостаза и повышенной чувствительности к патогенам и стрессам. Все эти фенотипы, как было показано, были смягчены ростом на HT115 бактерий, которые имеют более высокий уровень витамина B126. Поэтому рекомендуется проводить все эксперименты по физиологическим стрессовым реакциям на бактериях HT115, независимо от необходимости РНК. Однако, из-за простоты поддержания животных на OP50, весь стандартный рост (т.е. обслуживание и усиление животных) может быть выполнен на OP50, так как значительные различия в экспериментальных парадигмах, описанных здесь, не были обнаружены у червей, поддерживаемых на OP50 до тех пор, пока они не были перенесены на HT115 пост синхронизации (т.е. от люка после отбеливания с или не-ареста).
Здесь описана характеристика активности клеточных стрессовых реакций с использованием двух функциональных методов. Следует отметить, что представленные протоколы в первую очередь ориентированы на клеточные реакции стресса и их влияние на белок гомеостаза. Во-первых, используются флуоресцентные транскрипционные репортеры, которые регулируются эндогенными генными промоутерами, которые специально активируются в ответ на различные клеточные стрессы. Эти флуоресцентные транскрипционные репортеры основаны на транскрипционной индукции конкретных генов, которые являются родным и частью реакции на стресс. Например, HSP-4, белок теплового шока orthologous для человека сопровождающего HSPA5/BiP, активируется на ER-стресс и локализуется в ER, чтобы облегчить стресс. В условиях стресса ER (например, воздействие туникамицина), зеленый флуоресцентный белок (GFP), помещенный под регулирование hsp-4 промотор, синтезируется в высоких уровнях, как может быть оцененфлоесцентной микроскопии или количественно измеряется с помощью крупночастицного потока цитометрии нематод7. Аналогичным образом, промоутер митохондриального сопровождающего, hsp-6 (ортологос для млекопитающих HSPA9), используется для мониторинга активации UPRMT8, и промоутер цитосоликического сопровождающего hsp-16.2 (ортолологос того к кристаллическому альфа-генам человека) используется для оценки активности HSR9. Эти репортеры позволяют быстро охарактеризовать пути, активированные в ответ на различные возмущения.
Часто представленные здесь репортеры изображены с помощью микроскопии, которая обеспечивает качественный выход активации стрессовых реакций. Однако, хотя методы визуализации предоставляют как информацию об интенсивности, так и местонахождении тканей репортеров, описанных выше, ее количественная оценка не всегда является точной или надежной. Хотя можно количественно флуоресцентной активации с помощью инструментов анализа изображений, эти методы являются относительно низкой пропускной всей и размер выборки невелик, из-за относительно низкого числа животных изображения. Легкость и способность получать большое количество животных быстро делают C. elegans идеальной модельной системой для того чтобы рассказать активацию флуоресцентных репортеров усилия через использование цитометра потока больших частиц. Цитометр потока больших частиц способен регистрировать, анализировать и сортировать на основе размера и флуоресценции от многих живых животных. Используя этот метод, можно получить флуоресцентную интенсивность, размер, а также пространственную (2D) информацию для тысяч червей. Система управляется с помощью FlowPilot, что позволяет в режиме реального времени получать и анализировать измеренные параметры. Здесь в качестве методов измерения активации стрессовых реакций предлагаются методы как микроскопической визуализации, так и количественного анализа с использованием цитметра потока больших частиц.
Помимо анализа репортера, чувствительность или устойчивость животных к стрессу может быть измерена с помощью физиологических анализов стресса. Это достигается путем воздействия животных на стрессовых средах, которые активируют конкретные клеточные пути стресса. Здесь предусмотрено несколько методов измерения чувствительности целых животных к определенным видам стрессоров.
ER стресс применяется к C. elegans с помощью химического агента, туникамицина, который блокирует N-связанных гликозилирования, вызывая накопление неправильно сложенных белков в ER10. В C. elegans, рост при воздействии туникамицина приводит к серьезным возмущениям в функции ER, и значительно сократилась продолжительность жизни11. Путем измерять выживание животных на туникамицин-содержащих плитах, чувствительность усилия ER может быть измерять. Например, животные с внематочной индукцией UPRER и, таким образом, повышенной устойчивостью к воздействию белка неправильно горит в ER, имеют повышенную выживаемость при воздействии туникамицина по сравнению с дикими животнымитипа 12.
Оксидативный и митохондриальный стресс применяется к C. elegans, подвергая животных химическому агенту, параквату. Паракват является широко используемым гербицидом, который вызывает образование супероксида специально в митохондриях13. В связи с конкретной локализацией митохондрий полученных реактивных видов кислорода (ROS), паркватные анализы часто используются в качестве "митохондриального" стресс-анализ. Тем не менее, супероксид быстро преобразуется в перекись водорода митохондриальной супероксид дисмутазы (SODs)14. Перекись водорода может впоследствии диффундии из митохондрий и вызвать окислительный стресс в других отсеках клетки. Таким образом, мы описываем паракват выживания анализы как измерение чувствительности как к митохондриальной и окислительного стресса (другие окислительные стрессы анализы можно найти15).
Термотерпимость анализы выполняются в C. elegans путем размещения животных в повышенной температуре. Температура нематод температуры нематод составляет 15-20 градусов по Цельсию, а тепловой стресс индуцируется при температурах выше 25 градусов по Цельсию16,17. Термотерпимость анализы, как правило, выполняются при температурах, начиная от 30-37 градусов по Цельсию, как животные проявляют основные клеточные дефекты при такой температуре, и выживание анализы завершены в течение 24 часов16,18. Здесь предусмотрены два альтернативных метода для проведения термопереносимости анализов: рост при 34 градусах Цельсия и рост при 37 градусах Цельсия. Вместе, протоколы, представленные здесь могут быть использованы для выполнения крупномасштабных экранов в сочетании со стандартным геном нокдаун с помощью РНК-помех или химических библиотек наркотиков.
Протокол может быть разбит на 4 широкие процедуры - рост C. elegans и подготовка к визуализации (разделы 1 и 2), визуализация транскрипционных репортеров с использованием флуоресцентной микроскопии (раздел 3-5), количественные измерения репортеров с использованием китометра потока больших частиц (раздел 6), и физиологические анализы для измерения чувствительности к стрессу в C. elegans (раздел 7).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>for mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118072</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco granulated agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-782</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>C0051-25</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>350-5000-000</td>
			<td>equipped with a 488 nm light source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Cleaning Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5072-000</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Sheath Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5070-100</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG dioxane free</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>CI8280-4</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426500</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M205FA stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450040</td>
			<td>equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0070-3</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>75990-514</td>
			<td>equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289-50G</td>
			<td>for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tert-butyl hydroperoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>458139</td>
			<td>for oxidative stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660-5G</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurements of physiological stress responses in c. elegans

Организмы часто подвергаются колебаниям среды и изменения внутриклеточного гомеостаза, которые могут иметь пагубные последствия для их протеома и физиологии. Таким образом, организмы развивались целенаправленные и конкретные реакции стресса, посвященный ремонту повреждений и поддерживать гомеостаз. Эти механизмы включают в себя развернутую реакцию белка эндоплазмического ретикулума (UPRER),развернутую белковую реакцию митохондрий (UPRMT),реакцию теплового шока (HSR) и окислительную реакцию стресса (OxSR). Представленные здесь протоколы описывают методы обнаружения и характеристики активации этих путей и их физиологических последствий в нематоде, C. elegans. Во-первых, использование флуоресцентных транскрипционных репортеров, специфичных для использования в пути, описывается для быстрой клеточной характеристики, скрининга наркотиков или крупномасштабного генетического скрининга (например, библиотеки РНК или мутантов). Кроме того, описаны дополнительные, надежные физиологические анализы, которые могут быть использованы для непосредственной оценки чувствительности животных к конкретным стрессорам, служа функциональной проверкой транскрипционных репортеров. Вместе эти методы позволяют быстро охарактеризовать клеточные и физиологические эффекты внутренних и внешних протеотоксических возмущений.

Использование транскрипционных репортеров для измерения активации стрессовых реакций Здесь используются флуоресцентные транскрипционные репортеры, которые служат надежными инструментами для измерения активации большинства стрессовых реакций в C. elega...

Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Здесь мы характеризуем клеточные протеотоксические реакции стресса в нематоде C. elegans путем измерения активации флуоресцентных транскрипционных репортеров и просказа чувствительности к физиологическому стрессу.

Измерения физиологических стрессовых реакций у C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Эти методы могут быть использованы для характеристики стрессовых реакций в C.elegans и для определения того, генетические или фармакологические возмущения влияют на активацию защитных клеточных путей. Эти методы позволяют быстрое и высокой пропускной способности тестирования сотен возмущений, таких как ген нокдаун как на молекулярном и физиологическом уровнях. Чтобы убедиться, что анализ выполняется должным образом, включите положительный и отрицательный контроль.Синхронизируйте здоровых, сытых животных до нужной стадии и используйте свежие пластины для эксперимента. Визуализация микроманипуляции червей с выбором может помочь новым пользователям понять, как черви могут быть выстроены и оценены на жизнеспособность. Демонстрацией процедур будут Фил Франкино, Холли Гилдеа и Мелисса Меткалф, аспиранты нашей лаборатории.Для использования животных, выражаюющих GFP под промоутером белка теплового шока четыре для активации эндоплазмической стикулум развернулся ответ белка, расти синхронизированных животных репортер на 20 градусов по Цельсию до стадии L4 и мыть червей от пластины с помощью M9 среды и передачи в трубку. После сбора червей центрифугации, заменить M9 с 25 нанограммов на миллилитр препарата, представляющих интерес в M9 или диметилового сульфоксида в M9 в контроль животных труб. Затем поместите червей на вращающейся платформе в течение трех-четырех часов при 20 градусах по Цельсию.В конце инкубации, центрифуга червей, чтобы поселиться перед заменой раствора лечения с 15 миллилитров M9 в одиночку. После двух моет, передать животных NGM пластин или NGM РНК вмешательства пластин по мере необходимости и позволяют червей восстановить ночь при 20 градусов по Цельсию. Когда черви выздоровели, добавьте от пяти до 10 микролитров 100 миллимолярный азид натрия на стандартную пластину NGM без бактерий и поместите тарелку червей под рассекающий микроскоп.Перенесите от 10 до 20 животных из тарелки в пятно азаида натрия. Звери должны захватить движение вскоре после посадки в соляной раствор. После того, как азид натрия испарился, выстроить животных в желаемую установку изображений с передней и задней сторон в той же ориентации для всех животных и сразу же поместить пластину животных под стерео микроскопом.Запустите программное обеспечение для визуализации стерео микроскопа и под вкладкой приобретения, нажмите открытые проекты и папку, чтобы открыть новый проект. Нажмите правой кнопкой мыши и выберите переименование, чтобы переименовать папку. Распоистив образец червя под микроскопом цели и использовать Brightfield настройки, чтобы найти правильный координационный центр червей, чтобы свести к минимуму флуоресцентное отбеливание.Центром образца будет точка, в которой линия яиц хорошо видна и нечеткая. Установите время экспозиции, чтобы убедиться, что пиксели не насыщены, а также убедиться, что сигнал выше предела обнаружения. После настройки времени экспозиции, увеличения, фокусировки и конденсаторов Брайтфилда до соответствующих настроек нажмите кнопку захвата изображения, чтобы получить изображение.Для визуализации с помощью соединения широкое поле микроскопа, место базового контроля лечения пластины на соединение широкое поле микроскоп этапе и использовать сенсорную панель для запуска программы управления. Создайте новый альбом и имя файла и распоимить пластину под объективом цели. Используйте базовый контроль и положительные контрольные пластины, чтобы установить время экспозиции и интенсивность флуоресценции, чтобы сигнал был виден, но не насыщен.Затем сохраните изображения Brightfield и GFP FITC. Для количественной оценки индукции репортера с помощью цитометрии потока крупных частиц сначала включите цитометрические лазеры и откройте программное обеспечение цитометра. Нажмите, чтобы включить лазеры в окне программного обеспечения и нажмите запустить, чтобы инициировать лазер в окне всплывающего окна аргон лазерного управления.Когда лазер достигает около 12 милливатт и уровень источника света 488 поднимается примерно до 12, нажмите сделано и проверить четыре значения давления. Если значения похожи на значения, наблюдаемые в исходной настройке, проверьте поле OK давления. Далее, чтобы убедиться, что нет пузырьков воздуха или мусора, блокирующего поток оболочки и образца через поток ячейки, нажмите чистый несколько раз.Затем выключите сортировку и на оболочке, чтобы перезапустить поток. Чтобы проверить скорость потока, соберите оболочку в течение 60 секунд. Соберите оболочку в 15 миллилитровую трубку в течение 60 секунд.Скорость потока должна быть от 9 до 10 миллилитров в минуту. Для запуска образцов отрегулируйте мощность лазерного фотомультиплера до уровня, достаточно высокого, чтобы сигнал был выше предела обнаружения, но не выше предела насыщения. Выполните размер gating, чтобы исключить пузырьки, мусор, яйца и другие нежелательные мелкие частицы и включить только животных, представляющих интерес, таких как взрослые.Когда параметры скрининга были установлены, добавьте подготовленных червей в чашку и нажмите приобрести. Следите за тем, чтобы вся жидкость не была взята в машину, так как это приведет к тому, что цитометр потока будет приниматься в воздухе и создавать пузырьки внутри детектора. Когда образец низкий и / или достаточно животных были собраны, нажмите кнопку остановить.Для хранения закрытых данных, основанных только на ограничениях размера, нажмите настройки, хранение данных, только закрытые, и хранить закрытые для сохранения данных. Затем промыть чашку сбора с деионизированной водой и удалить мыть вакуумом три раза, прежде чем повторить анализ со следующим образцом. Для измерения митохондриальной и окислительной чувствительности стресса, добавить от 50 до 75 микролитров Paraquat в M9 до 8 до 10 скважин на состояние плоского дна 96-хорошо пластины и передачи от восьми до 10 червей в состоянии каждой скважины Паракват.Каждые два часа, нажмите пластину мягко, чтобы заставить живых животных трэш или согнуть, чтобы забил количество мертвых животных на колодец. Для измерения температурной чувствительности животных, инкубировать червей в течение трех-четырех дней при температуре 20 градусов по Цельсию, прежде чем покрытие от 10 до 15 животных на тарелку на состояние в общей сложности от четырех до шести пластин. Затем поместите пластины в 34 или 37 градусов по Цельсию инкубатор и оценка выживания червя каждые два часа, как только что продемонстрировали.Репортер hsp-4 имеет минимальное базальное впечатление в отсутствие стресса, но демонстрирует надежное выражение GFP, когда животные подвергаются эндоплазмическому стрессу стикулума с помощью препарата Туникамицин. Эти различия также можно количественно оценить с помощью цитометра потока крупных частиц. Кроме того, индукция трансгена при эндоплазмическом стрессе стикулум может быть полностью супрессирована нокдауном XBP-1 с помощью РНК-интерференции.Подобные анализы могут быть выполнены для измерения митохондриального стресса, окислительного стресса и теплового стресса. Целые физиологические реакции животных на стресс также могут быть измерены с помощью нескольких анализов выживания. Например, воздействие туникамицина используется для измерения чувствительности эндоплазмической ретикулумов к стрессу.Нокдаун гена XBP-1 приводит к значительному повышению чувствительности к туникамицину. Кроме того, воздействие химического агента Паракват используется для измерения окислительной и митохондриальной чувствительности к стрессу. Нокдаун гена DAF-2 приводит к значительному повышению устойчивости к параквату.Термотолерантность может быть измерена путем определения выживаемости животных при повышенных температурах и может быть построена как кривая выживания. Эти анализы должны быть выполнены по крайней мере четыре-шесть раз, и все репликации должны быть построены друг против друга, как термотолеранс демонстрирует невероятно высокую изменчивость по сравнению с другими анализами стресса. При визуализации животных крайне важно установить параметры таким образом, чтобы не было перенасыщения сигнала или под ним, и обеспечить, чтобы на протяжении всего эксперимента использовались одинаковые параметры.Протоколы визуализации, описанные здесь, подотменны для крупномасштабного скрининга, включая экраны в ширину генома, и отлично подошел как для исследовательских, так и для подтверждающих исследований, за которыми можно следить с помощью описанных физиологических анализов.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Мониторинг завод гормонов во время реакции на стресс

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Поколение трансгенных С. Элеганс По Biolistic преобразования

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

Образцы хищничества риска, травоядным физиологический стресс и микробного разложения растительного опада

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. Элеганс Анализ хемотаксиса

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Антитела Окрашивание в<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Использование &quot;Freeze-Крекинг&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Аноксия-голодание модель ишемии / реперфузии в<em&gt; С. Элеганс</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Методы для кожи телесные повреждения и анализы для заживления ответы в<em&gt; C. Элеганс</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Методы оценки субклеточных отсеков Muscle в<em&gt; С. Элеганс</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...