Name: measurements of physiological stress responses in c. elegans
Uploaded: 2020-05-21T13:30:00
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R.BZ. cuenta con el apoyo de la beca a largo plazo embo y la Fundación Larry L. Hillblom. R.H.S cuenta con el apoyo de la concesión 5F32AG032023-02 a través del Instituto Nacional de Envejecimiento (NIA) y la Beca Postdoctoral Glenn Foundation for Medical Research. A.F. es apoyado por la concesión F32AG051355 a través de la NIA. H.K.G. cuenta con el apoyo de la beca DGE1752814 a través del Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias. M.G.M. es compatible con 1F31AG060660-01 a través de NIA. A.D. cuenta con el apoyo de la Fundación Thomas y Stacey Siebel, el Instituto Médico Howard Hughes y 4R01AG042679-04 y 5R01AG055891-02 de NIA, y 5R01ES021667-09 de NIEHS. Agradecemos a Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet y Anel Esquivel por su importante asistencia técnica. Agradecemos al laboratorio de Morimoto y al CGC (financiado por el Programa p40 OD010440 de la Oficina de Infraestructura de Investigación de los NIH) por las cepas.

1. Condiciones de crecimiento estándar de las temperaturas y OP50 vs HT115
<ol><li>Crecimiento y expansión estándar<ol>
<li>Cultivar un cultivo de OP50 en LB (Tabla 1) o medios equivalentes de elección para 24-48 h a temperatura ambiente (22-25 oC). Crecer bacterias a temperatura ambiente ya que OP50 es un auxotrofi de uracilo y hay una mayor incidencia de revertientes (por ejemplo, mutantes supresores) cuando se cultiva a 37 oC. No se recomienda el almacenamiento a largo plazo de cultivos OP50 (m?...

Aquí, se describen métodos para interrogar las respuestas de estrés celular en C. elegans,utilizando reporteros transcripcionales fluorescentes y ensayos fisiológicos de supervivencia por estrés. Todos los reporteros utilizan la expresión GFP impulsada bajo el promotor de un objetivo transcripcional descendente de los factores de transcripción involucrados en el montaje de las respuestas de estrés celular. El uso de hsp-4p::GFP modulado por XBP-1s-mediada UPRER, hsp-6p::GFP c...

La capacidad de un organismo para responder a los cambios en el entorno intra y extracelular es crucial para su supervivencia y adaptación. Esto se logra a nivel celular a través de numerosas vías protectoras que aseguran la integridad de la célula. Mientras que numerosos componentes celulares están sujetos a daño asociado al estrés, una participación importante de las respuestas de estrés celular es reparar y proteger la homeostasis del proteome celular. Sin embargo, la compartimentación de proteínas en estructuras especiales, llamadas orgánulos, plantea un desafío para la célula, ya que no puede confiar en una forma centralizada de control de calidad de proteínas para garantizar que todas las proteínas dentro de la célula estén correctamente plegadas y funcionales. Por lo tanto, para hacer frente a las perturbaciones a sus proteínas, los orgánulos han desarrollado mecanismos de control de calidad dedicados, que pueden detectar proteínas mal dobladas y activar una respuesta de tensión en un intento de aliviar el estrés dentro de ese compartimiento. Por ejemplo, el citosol se basa en la respuesta de choque térmico (HSR), mientras que el retículo endoplasmático (ER) y las mitocondrias dependen de sus respuestas proteicas desplegadas específicas del compartimiento (UPR). El OxSR sirve para aliviar los efectos tóxicos de las especies reactivas de oxígeno (ROS). Cada respuesta de estrés se activa en presencia de desafíos celulares e insultos ambientales e induce una respuesta transcripcional personalizada. Las características distintivas de estas respuestas incluyen la síntesis de moléculas que vuelven a plegar las proteínas mal dobladas (como los chaperones) dirigidas al orgánulo adecuado, o alternativamente, eliminan las proteínas dañadas por degradación de proteínas. Si no se activan estas respuestas de tensión, se acumulan proteínas dañadas, la disfunción celular se propaga a la insuficiencia sistémica de los tejidos y, finalmente, la muerte del organismo. La función y la regulación de las diferentes respuestas de tensión se revisan en otros lugares1.
Muchos conocimientos sobre la regulación y la actividad de las respuestas al estrés celular se han atribuido al nematodo, Caenorhabditis elegans, un organismo modelo multicelular en la investigación genética. Los nematodos no sólo permiten estudiar la activación de las respuestas de estrés a nivel celular, sino también a nivel de organismo; nematodos se han utilizado para estudiar los efectos de las perturbaciones genéticas o la exposición a fármacos y contaminantes en su crecimiento y supervivencia. Su tiempo de generación rápida, isogenia, transparencia, tractabilidad genética y facilidad de uso durante la experimentación los hacen ideales para tales estudios. Además, la respuesta fisiológica relativamente rápida al estrés (entre horas y unos días) y la conservación evolutiva de las vías celulares hacen de los nematodos una herramienta prominente en el estudio de la resistencia al estrés.
Hay dos cepas de E. coli comúnmente utilizadas como fuente de alimento para cultivar C. elegans: OP50 estándar, una cepa B en la que la mayoría de la experimentación se ha realizado históricamente2 y HT115, una cepa K-12 que se utiliza para casi todos los experimentos RNAi3,4. Es importante tener en cuenta que hay diferencias significativas entre las dietas bacterianas OP50 y HT115. Crecimiento en estas diferentes fuentes bacterianas se ha demostrado para causar grandes diferencias en el perfil metabólico, número de copia de ADN mitocondrial, y varios fenotipos principales, incluyendo la vida útil5. Algunas de estas diferencias se atribuyen a la deficiencia de vitamina B12 asociada con el crecimiento de bacterias OP50, que puede resultar en defectos en la homeostasis mitocondrial y mayor sensibilidad a patógenos y tensiones. Todos estos fenotipos han demostrado ser aliviados por el crecimiento de bacterias HT115, que tienen niveles más altos de vitamina B126. Por lo tanto, se recomienda que todos los experimentos sobre respuestas de estrés fisiológico se realicen en bacterias HT115, independientemente de la necesidad de condiciones de ARNi. Sin embargo, debido a la facilidad de mantener los animales en OP50, todo el crecimiento estándar (es decir, el mantenimiento y la amplificación de los animales) se puede realizar en OP50, ya que no se detectaron diferencias significativas en los paradigmas experimentales descritos aquí en los gusanos mantenidos en OP50 siempre y cuando se trasladaran a la sincronización posterior HT115 (es decir, desde el post-blanqueamiento de escotillas con o sin detención de L1) hasta la experimentación.
Aquí, se describe la caracterización de la actividad de las respuestas de estrés celular utilizando dos métodos funcionales. Cabe señalar que los protocolos presentados se centran principalmente en las respuestas de estrés celular y su impacto en la homeostasis proteica. En primer lugar, se utilizan reporteros transcripcionales fluorescentes, que están regulados por promotores de genes endógenos que se activan específicamente en respuesta a diferentes tensiones celulares. Estos reporteros transcripcionales fluorescentes se basan en la inducción transcripcional de genes específicos que son nativos parte de la respuesta al estrés. Por ejemplo, HSP-4, una proteína de choque térmico ortolista para el chaperone humano HSPA5/BiP, se activa al er-estrés y localiza a la sala de er para aliviar el estrés. En condiciones de estrés er (por ejemplo, la exposición a la tunicamicina), una proteína fluorescente verde (GFP), colocada bajo la regulación del promotor hsp-4, se sintetiza en niveles elevados, como puede evaluarse mediante microscopía fluorescente o medir cuantitativamente utilizando citometría de flujo de partículas grandes de nematodos7. Del mismo modo, el promotor de un chaperón mitocondrial, hsp-6 (ortologous a mamífero HSPA9), se utiliza para monitorear la activación de la UPRMT8,y el promotor de la chaperona citosólica hsp-16.2 (ortopéloga a los genes alfa de cristalino humana) se utiliza para evaluar la actividad del HSR9. Estos reporteros permiten una rápida caracterización de las vías activadas en respuesta a diversas perturbaciones.
A menudo, los reporteros presentados aquí son fotodos usando microscopía, que proporciona una salida cualitativa de la activación de las respuestas de estrés. Sin embargo, mientras que las técnicas de diagnóstico por imágenes proporcionan información sobre la intensidad y la ubicación de los tejidos de los reporteros descritos anteriormente, su cuantificación no siempre es precisa o robusta. Si bien es posible cuantificar la activación fluorescente utilizando herramientas de análisis de imágenes, estos métodos son relativamente bajos y el tamaño de la muestra es pequeño, debido al número relativamente bajo de animales en la imagen. La facilidad y la capacidad de obtener grandes cantidades de animales rápidamente hacen de C. elegans un sistema de modelo ideal para analizar la activación de los reporteros de estrés fluorescente a través del uso de un gran citómetro de flujo de partículas. Un citómetro de flujo de partículas grandes es capaz de registrar, analizar y clasificar en función del tamaño y la fluorescencia de muchos animales vivos. Usando este método, es posible obtener la intensidad fluorescente, el tamaño y también la información espacial (2D) para miles de gusanos. El sistema se controla mediante FlowPilot, que permite la adquisición y el análisis de datos en tiempo real de los parámetros medidos. Aquí, los métodos para la toma de imágenes microscópicas y el análisis cuantitativo utilizando un citómetro de flujo de partículas grandes se ofrecen como métodos para medir la activación de las respuestas de tensión.
Más allá del análisis del reportero, la sensibilidad o resistencia de los animales al estrés se puede medir mediante ensayos fisiológicos de estrés. Esto se logra mediante la exposición de los animales a ambientes estresantes que activan vías de estrés celular específicos. Aquí, se proporcionan varios métodos para medir la sensibilidad de animales enteros a tipos específicos de factores de estrés.
El estrés ER se aplica a C. elegans utilizando el agente químico, la tunicamicina, que bloquea la glicosilación ligada a N, causando la acumulación de proteínas mal plegadas en el ER10. En C. elegans, el crecimiento tras la exposición a la tunicamicina da lugar a perturbaciones importantes en la función de ER, y una vida útil significativamente disminuida11. Mediante la medición de la supervivencia de los animales en placas que contienen tunicamicina, se puede cuantificar la sensibilidad al estrés de los animales en ER. Por ejemplo, los animales con inducción ECtópica deURGENCIA supeditada y, por lo tanto, una mayor resistencia al estrés dedesdoblamiento de proteínas en el ER tienen una mayor supervivencia tras la exposición a la tunicamicina en comparación con los animales de tipo salvaje12.
El estrés oxidativo y mitocondrial se aplica a C. elegans al exponer animales al agente químico, paraquat. Paraquat es un herbicida de uso común, que causa la formación de superóxido específicamente en las mitocondrias13. Debido a la localización específica de las especies de oxígeno reactivo derivadas de las mitocondrias (ROS), los ensayos de paraquat se utilizan a menudo como un ensayo de estrés "mitocondrial". Sin embargo, el superóxido se convierte rápidamente en peróxido de hidrógeno por dismutas de superóxido mitocondrial (SOD)14. Posteriormente, el peróxido de hidrógeno puede salir de las mitocondrias y causar estrés oxidativo en otros compartimentos de la célula. Por lo tanto, describimos los ensayos de supervivencia de paraquat como la medición de la sensibilidad al estrés mitocondrial y oxidativo (otros ensayos de estrés oxidativo se pueden encontrar15).
Los ensayos de termotolerancia se realizan en C. elegans colocando animales a temperaturas elevadas. Las temperaturas ambiente de los nematodos son de 15-20 oC y se induce tensión térmica a temperaturas superiores a 25 oC16,17. Los ensayos de termotolerancia se realizan generalmente a temperaturas que oscilan entre 30-37 oC, ya que los animales presentan defectos celulares importantes a esta temperatura, y los ensayos de supervivencia se completan dentro de las 24 horas16,,18. Aquí, se proporcionan dos métodos alternativos para la realización de ensayos de termotolerancia: crecimiento a 34 oC y crecimiento a 37 oC. Juntos, los protocolos presentados aquí se pueden utilizar para realizar pantallas a gran escala cuando se combinan con el derribo de genes estándar utilizando interferencia de ARN o bibliotecas de fármacos químicos.
El protocolo se puede dividir en 4 procedimientos generales: crecimiento de C. elegans y preparación para la toma de imágenes (secciones 1 y 2), imágenes de reporteros transcripcionales mediante microscopía fluorescente (secciones 3-5), mediciones cuantitativas de reporteros utilizando un citómetro de flujo de partículas grandes (sección 6), y ensayos fisiológicos para medir la sensibilidad al estrés en C. elegans (sección 7).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>for mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118072</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco granulated agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-782</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>C0051-25</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>350-5000-000</td>
			<td>equipped with a 488 nm light source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Cleaning Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5072-000</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Sheath Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5070-100</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG dioxane free</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>CI8280-4</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426500</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M205FA stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450040</td>
			<td>equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0070-3</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>75990-514</td>
			<td>equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289-50G</td>
			<td>for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tert-butyl hydroperoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>458139</td>
			<td>for oxidative stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660-5G</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurements of physiological stress responses in c. elegans

Los organismos a menudo están expuestos a ambientes fluctuantes y cambios en la homeostasis intracelular, que pueden tener efectos perjudiciales en su proteome y fisiología. Por lo tanto, los organismos han evolucionado respuestas de estrés específicas y específicas dedicadas a reparar el daño y mantener la homeostasis. Estos mecanismos incluyen la respuesta proteica desplegada del retículo endoplasmático (UPRER),la respuesta proteica desplegada de las mitocondrias (UPRMT),la respuesta de choque térmico (HSR) y la respuesta de estrés oxidativo (OxSR). Los protocolos aquí presentados describen métodos para detectar y caracterizar la activación de estas vías y sus consecuencias fisiológicas en el nematodo, C. elegans. En primer lugar, se describe el uso de reporteros transcripcionales fluorescentes específicos de la vía para la caracterización celular rápida, la detección de drogas o la detección genética a gran escala (por ejemplo, RNAi o bibliotecas mutantes). Además, se describen ensayos fisiológicos complementarios y robustos, que pueden utilizarse para evaluar directamente la sensibilidad de los animales a factores de estrés específicos, sirviendo como validación funcional de los reporteros transcripcionales. Juntos, estos métodos permiten una rápida caracterización de los efectos celulares y fisiológicos de las perturbaciones proteotóxicas internas y externas.

Uso de reporteros transcripcionales para medir la activación de las respuestas de estrés Aquí, se utilizan reporteros transcripcionales fluorescentes, que sirven como herramientas robustas para medir la activación de la mayoría de las respuestas de estrés en C. elegans. La expresión gFP se impulsa bajo el promotor de objetivos canónicos de los reguladores transcripcionales maestros involucrados en la respuesta a las tensiones específicas del compartim...

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Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Aquí, caracterizamos las respuestas de estrés proteotóxico celular en el nematodo C. elegans midiendo la activación de los reporteros transcripcionales fluorescentes y diciendo sensibilidad al estrés fisiológico.

Mediciones de las respuestas fisiológicas de estrés en C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Estos métodos se pueden utilizar para caracterizar las respuestas al estrés en C.elegans y para determinar si las perturbaciones genéticas o farmacológicas afectan la activación de las vías celulares protectoras. Estos métodos permiten pruebas rápidas y de alto rendimiento de cientos de perturbaciones como la reducción genética tanto en los niveles moleculares como fisiológicos. Para asegurarse de que el ensayo se realiza correctamente, incluya controles positivos y negativos.Sincronice animales sanos y bien alimentados a la etapa adecuada y use platos frescos para el experimento. La visualización de la micromanipulación de los gusanos con una selección puede ayudar a los nuevos usuarios a entender cómo se pueden alinear y evaluar los gusanos para su viabilidad. Demostrando los procedimientos estarán Phil Frankino, Holly Gildea y Melissa Metcalf, estudiantes graduados en nuestro laboratorio.Utilizar animales que expresen GFP bajo el promotor de la proteína de choque térmico cuatro para la activación de la respuesta de proteína desdoplasmática desplegada de retículo, crecer animales reporteros sincronizados a 20 grados celsius hasta la etapa L4 y lavar los gusanos de la placa utilizando el medio M9 y transferirlos a un tubo. Después de recoger los gusanos por centrifugación, reemplace el M9 por 25 nanogramos por mililitro del fármaco de interés en M9 o sulfóxido de dimetil en M9 en los tubos de control de los animales. A continuación, coloque los gusanos en una plataforma giratoria durante tres a cuatro horas a 20 grados centígrados.Al final de la incubación, centrifugar los gusanos para asentarse antes de reemplazar la solución de tratamiento con 15 mililitros de M9 solo. Después de dos lavados, transfiera a los animales a placas NGM o placas de interferencia de ARN NGM según corresponda y permita que los gusanos se recuperen durante la noche a 20 grados centígrados. Cuando los gusanos se hayan recuperado, agregue de cinco a 10 microlitros de azida sódica de 100 milimolares a una placa NGM estándar sin bacterias y coloque una placa de gusanos bajo un microscopio de disección.Transfiera de 10 a 20 animales del plato a la mancha de azida sódica. Los animales deben tomar el movimiento poco después de aterrizar en la solución de sal. Una vez que el azida sódica se haya evaporado, alinee a los animales en la configuración de imagen deseada con los lados anterior y posterior en la misma orientación para todos los animales e inmediatamente coloque la placa de los animales bajo un microscopio estéreo.Inicie el software de imágenes del microscopio estéreo y, en la pestaña de adquisiciones, haga clic en abrir proyectos y carpetas para abrir un nuevo proyecto. Haga clic con el botón derecho y seleccione cambiar el nombre para cambiar el nombre de la carpeta. Coloque la muestra de gusano bajo el objetivo del microscopio y utilice el ajuste Brightfield para localizar el punto focal correcto de los gusanos para minimizar el blanqueo fluorescente.El centro de la muestra será el punto en el que la línea de huevos es claramente visible y no difusa. Establezca el tiempo de exposición para asegurarse de que los píxeles no están saturados y también para asegurarse de que la señal está por encima del límite de detección. Después de ajustar el tiempo de exposición, el zoom, el enfoque y los condensadores Brightfield a los ajustes adecuados, haga clic en el botón Capturar imagen para adquirir una imagen.Para obtener imágenes con un microscopio compuesto de campo ancho, coloque la placa de tratamiento de control basal en la etapa del microscopio de campo ancho compuesto y utilice el panel táctil para iniciar el programa de control. Cree un nuevo álbum y nombre de archivo y coloque la placa debajo de la lente objetivo. Utilice el control de línea base y las placas de control positivas para ajustar el tiempo de exposición y la intensidad de fluorescencia de modo que la señal sea visible pero no saturada.A continuación, guarde las imágenes FITC de Brightfield y GFP. Para cuantificar la inducción del reportero por citometría de flujo de partículas grandes, primero encienda los láseres del citometro y abra el software del citometro. Haga clic en Iniciar para encender los láseres en la ventana del software y haga clic en Ejecutar para iniciar el láser en la ventana emergente de control láser de argón.Cuando el láser alcanza alrededor de 12 milivatios y el nivel de fuente de luz 488 sube a alrededor de 12, haga clic en hecho y compruebe los cuatro valores de presión. Si los valores son similares a los observados en la configuración original, marque la casilla de presión OK. A continuación, para asegurarse de que no haya burbujas de aire o escombros que bloqueen el flujo de vaina y la muestra a través de la celda de flujo, haga clic en limpiar varias veces.A continuación, desactive la ordenación y la vaina para reiniciar el flujo. Para comprobar el caudal, recoja la vaina durante 60 segundos. Recoger la vaina en un tubo de 15 mililitros durante 60 segundos.El caudal debe ser de nueve a 10 mililitros por minuto. Para ejecutar las muestras, ajuste la potencia del fotomultiplicación láser a un nivel lo suficientemente alto como para que la señal esté por encima del límite de detección, pero no por encima del límite de saturación. Realice gating de tamaño para excluir burbujas, escombros, huevos y otras partículas pequeñas no deseadas e incluir solo a los animales de interés como los adultos.Cuando se hayan establecido los parámetros de cribado, agregue los gusanos preparados a una taza y haga clic en adquirir. Observe para asegurarse de que todo el líquido no se lleva a la máquina, ya que esto hará que el citometro de flujo tome aire y cree burbujas dentro del detector. Cuando la muestra sea baja y/o se hayan recogido suficientes animales, haga clic en stop.Para almacenar datos cerrados basándose únicamente en las restricciones de tamaño, haga clic en configuración, almacenamiento de datos, solo cerrado y almacenar cerrado para guardar los datos. A continuación, enjuague la taza de recogida con agua desionizada y retire el lavado al vacío tres veces antes de repetir el análisis con la siguiente muestra. Para medir la sensibilidad al estrés mitocondrial y oxidativo, agregue de 50 a 75 microlitros de Paraquat en M9 a ocho a 10 pozos por condición de una placa plana inferior de 96 pozos y transfiera de ocho a 10 gusanos por condición a cada pozo de Paraquat.Cada dos horas, toque el plato suavemente para hacer que los animales vivos golpee o se doble para permitir la puntuación del número de animales muertos por pozo. Para medir la sensibilidad a la temperatura de los animales, incubar los gusanos durante tres a cuatro días a 20 grados centígrados antes de chapar de 10 a 15 animales por placa por condición para un total de cuatro a seis placas. A continuación, coloque las placas en una incubadora de 34 o 37 grados Celsius y puntues la supervivencia del gusano cada dos horas como se acaba de demostrar.El reportero hsp-4 tiene una mínima impresión basal en ausencia de estrés, pero exhibe una expresión robusta de la GFP cuando los animales están expuestos al estrés retículo endoplasmático usando el medicamento Tunicamicina. Estas diferencias también se pueden cuantificar utilizando un gran citometro de flujo de partículas. Además, la inducción del transgén bajo tensión de retículo endoplasmático puede ser completamente suprimida por derribo de XBP-1 a través de interferencia de ARN.Se pueden realizar ensayos similares para medir el estrés mitocondrial, el estrés oxidativo y el estrés por calor. Las respuestas fisiológicas de animales enteros al estrés también se pueden medir utilizando varios ensayos de supervivencia. Por ejemplo, la exposición a tunicamicina se utiliza para medir la sensibilidad al estrés retículo endoplasmático.El derribo del gen XBP-1 da como resultado un aumento significativo en la sensibilidad a la tunicamicina. Además, la exposición al agente químico Paraquat se utiliza para medir la sensibilidad al estrés oxidativo y mitocondrial. El derribo del gen DAF-2 da como resultado un aumento significativo en la resistencia a Paraquat.La termolerancia se puede medir determinando la supervivencia de los animales a temperaturas elevadas y se puede trazar como una curva de supervivencia. Estos ensayos deben realizarse al menos cuatro a seis veces y todas las réplicas deben trazarse entre sí, ya que la termotolerancia demuestra una variabilidad increíblemente alta en comparación con otros ensayos de estrés. Al tomar imágenes de animales, es fundamental establecer los parámetros de manera que no haya una saturación excesiva o inferior de la señal y asegurarse de que se utilizan los mismos parámetros durante todo el experimento.Los protocolos de diagnóstico por imágenes descritos aquí son susceptibles de detección a gran escala, incluidas las pantallas de ancho del genoma, y son ideales tanto para estudios exploratorios como confirmatorios que pueden ser seguidos por los ensayos fisiológicos descritos.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

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Investigación

Biología

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

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Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística

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RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

Vinculación de riesgo de depredación, Estrés Fisiológico herbívoro y descomposición microbiana de los desechos de las plantas

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C. elegans Chemotaxis Assay

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Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

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Tinción de anticuerpos en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso de &quot;Freeze-Cracking&quot;

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Un Modelo Anoxia inanición por isquemia / reperfusión en el<em&gt; C. elegans</em

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Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

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Los métodos para la piel Heridas y ensayos para Respuestas de heridas en<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Métodos para evaluar subcelulares compartimentos de músculo en<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...