Name: measurements of physiological stress responses in c. elegans
Uploaded: 2020-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

R.BZ. stöds av EMBO:s långsiktiga stipendium och Larry L. Hillbloms stiftelse. R.H.S stöds av bidrag 5F32AG032023-02 genom National Institute of Aging (NIA) och Glenn Foundation for Medical Research Postdoc Fellowship. A.F. stöds genom bidrag F32AG0513555 genom NIA. H.K.G. stöds av grant DGE1752814 genom National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. stöds av 1F31AG060660-01 genom NIA. AD stöds av Thomas och Stacey Siebel Foundation, Howard Hughes Medical Institute, och 4R01AG042679-04 och 5R01AG055891-02 från NIA, och 5R01ES021667-09 från NIEHS. Vi tackar Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet och Anel Esquivel för betydande tekniskt stöd. Vi tackar Morimoto labbet och CGC (finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) för stammar.

1. Standardtillväxtförhållanden för temperaturer och OP50 vs HT115
<ol><li>Standardtillväxt och expansion<ol>
<li>Odla en odling av OP50 i LB(tabell 1)eller motsvarande media val för 24-48 h vid rumstemperatur (~ 22-25 °C). Odla bakterier i rumstemperatur eftersom OP50 är en uracil auxotroph och det finns en högre incidens av revertants (t.ex. suppressor mutanter) när de odlas vid 37 °C. Långtidslagring av OP50-kulturer rekommenderas inte (max 1 vecka vid 4 °C).</li>
		<li>Sådd en volym a...

Här beskrivs metoder för att förhöra cellulära stressreaktioner i C. elegans– med hjälp av fluorescerande transkriptionsreportrar och fysiologiska stressöverlevnadsanalyser. Reportrarna använder alla GFP uttryck drivs under initiativtagare till en nedströms transkriptionella mål för transkription faktorer som är inblandade i montering cellulära stressreaktioner. Användningen av hsp-4p::GFP moduleras av XBP-1s-medierad UPRER, hsp-6p::GFP kontrolleras av ATFS-1-medierad...

En organisms förmåga att reagera på förändringar i den intra- och extracellulära miljön är avgörande för dess överlevnad och anpassning. Detta sker på cellnivå genom många skyddande vägar som säkerställer integriteten i cellen. Medan många cellulära komponenter är föremål för stress-associerade skador, en stor inblandning av cellulära stress svar är att reparera och skydda homeostas av cellulära proteom. Men uppdelningen av proteiner i speciella strukturer, som kallas organeller, utgör en utmaning för cellen, eftersom den inte kan förlita sig på en centraliserad form av proteinkvalitetskontroll för att säkerställa att alla proteiner i cellen är ordentligt vikta och funktionella. Därför, för att hantera störningar i sina proteiner, organeller har utvecklats dedikerade mekanismer för kvalitetskontroll, som kan känna felvikta proteiner och aktivera en stressrespons i ett försök att lindra stress inom detta utrymme. Cytosolen förlitar sig till exempel på värmechocksvaret (HSR), medan det endoplasmatiska reticulum (ER) och mitokondrierna förlitar sig på sina fackspecifika ovikta proteinsvar (UPR). OxSR tjänar till att lindra de toxiska effekterna av reaktiva syrearter (ROS). Varje stressrespons utlöses i närvaro av cellulära utmaningar och miljöföreskrifter och inducerar ett skräddarsytt transkriptionellt svar. Kännetecknen för dessa svar inkluderar syntetiserande molekyler som åter vika felvikta proteiner (såsom förkläde) riktade till rätt organell, eller alternativt ta bort skadade proteiner genom proteinnedbrytning. Underlåtenhet att aktivera dessa stressreaktioner resulterar i ansamling av skadade proteiner, cellulär dysfunktion förökas till systemisk fel i vävnader, och så småningom död av organismen. Funktionen och regleringen av de olika stressreaktionerna ses över någon annanstans1.
Många insikter om reglering och aktivitet av cellulära stressreaktioner har tillskrivits nematoden, Caenorhabditis elegans, en flercellig modell organism i genetisk forskning. Nematoder tillåter inte bara att studera aktivering av stressreaktioner på cellnivå, men också på organismnivå; nematoder har använts för att studera effekterna av genetiska störningar eller exponering för läkemedel och föroreningar på deras tillväxt och överlevnad. Deras snabba generationstid, isogeny, öppenhet, genetisk tractability, och användarvänlighet under experiment gör dem idealiska för sådana studier. Dessutom, den relativt snabba fysiologiska svar på stress (mellan timmar och några dagar) och den evolutionära bevarande av cellulära vägar gör nematoder ett framträdande verktyg för att studera stresstålighet.
Det finns två vanliga E. coli stammar som används som en näringskälla för att odla C. elegans:standard OP50, en B-stam där de flesta experiment har historiskt utförts2 och HT115, en K-12 stam som används för nästan alla RNAi experiment3,4. Det är viktigt att notera att det finns betydande skillnader mellan OP50 och HT115 bakteriell kost. Tillväxt på dessa olika bakteriella källor har visat sig orsaka stora skillnader i metabolisk profil, mitokondriellt DNA-kopieringsnummer, och flera stora fenotyper, inklusive livslängd5. Några av dessa skillnader tillskrivs vitamin B12 brist i samband med tillväxt på OP50 bakterier, vilket kan resultera i defekter i mitokondriell homeostas och ökad känslighet för patogener och påfrestningar. Alla dessa fenotyper har visat sig lindras genom tillväxt på HT115 bakterier, som har högre nivåer av vitamin B126. Därför rekommenderas att alla experiment på fysiologiska stressreaktioner utförs på HT115-bakterier, oavsett nödvändigheten av RNAi-tillstånd. På grund av att djuren är lätta att underhålla op50 kan dock all standardtillväxt (dvs. underhåll och förstärkning av djur) utföras på OP50, eftersom betydande skillnader i de experimentella paradigm som beskrivs här inte upptäcktes i maskar som upprätthålls på OP50 så länge de flyttades till HT115 efter synkronisering (dvs. från kläckning efter blekning med eller utan L1 gripande) fram till experiment.
Här beskrivs karakteriseringen av aktiviteten hos cellulära stressreaktioner med hjälp av två funktionella metoder. Det bör noteras att de protokoll som presenteras är främst inriktade på cellulära stressreaktioner och deras inverkan på protein homeostas. Först används fluorescerande transkriptionsreportrar, som regleras av endogena genpromotorer som är specifikt aktiverade som svar på olika cellulära påfrestningar. Dessa fluorescerande transkriptionella reportrar är baserade på transkriptionell induktion av specifika gener som är inbyggt en del av stressresponsen. Till exempel, HSP-4, en värmechock protein orthologous till den mänskliga förkläde HSPA5/BiP, aktiveras vid ER-stress och lokaliserar till ER för att lindra stress. Under förhållanden av ER-stress (t.ex. syntetiseras exponering för tunicamycin), ett grönt fluorescerande protein (GFP), som placeras enligt hsp-4-promotorns reglering, i höga nivåer som kan bedömas genom fluorescerande mikroskopi eller kvantitativt mätas med hjälp av stor partikelflödescytometri av nematoder7. På samma sätt används promotorn för ett mitokondriellt förkläde, hsp-6 (ortos till däggdjurs-HSPA9), för att övervaka aktiveringen av UPRMT8, och promotorn av cytosolic förkläde hsp-16,2 (ortos till de mänskliga crystallin alfagener) används för att bedöma aktiviteten hos HSR9. Dessa reportrar möjliggör en snabb karakterisering av de vägar som aktiveras som svar på olika störningar.
Ofta är de reportrar som presenteras här avbildade med hjälp av mikroskopi, vilket ger en kvalitativ effekt av aktivering av stressreaktioner. Men medan bildframställning tekniker ger både information om intensitet och vävnad plats för reportrar som beskrivs ovan, är dess kvantifiering inte alltid korrekt eller robust. Även om det är möjligt att kvantifiera fluorescerande aktivering med hjälp av bildanalysverktyg, är dessa metoder relativt låga genomströmning och provstorleken är liten, på grund av det relativt låga antalet avbildade djur. Den lätthet och förmåga att få stora mängder djur snabbt göra C. elegans en idealisk modell system för att analysera aktivering av fluorescerande stress reportrar med hjälp av en stor partikel flöde cytometer. En stor partikelflödescytmeter kan registrera, analysera och sortera baserat på storlek och fluorescens från många levande djur. Med den här metoden är det möjligt att få fluorescerande intensitet, storlek och även rumslig (2D) information för tusentals maskar. Systemet styrs med FlowPilot, vilket möjliggör datainsamling och analys i realtid av de uppmätta parametrarna. Här erbjuds metoder för både mikroskopisk avbildning och kvantitativ analys med hjälp av en stor partikelflödescytometer som metoder för att mäta aktivering av stressreaktioner.
Utöver reporteranalys kan djurens känslighet eller motståndskraft mot stress mätas med hjälp av fysiologiska stressanalyser. Detta uppnås genom att utsätta djur för stressiga miljöer som aktiverar specifika cellulära stressvägar. Här finns flera metoder för att mäta hela djurs känslighet för specifika typer av stressfaktorer.
ER stress appliceras på C. elegans med hjälp av det kemiska medlet, tunicamycin, som blockerar N-linked glykosylering, orsakar ansamling av felvikta proteiner i ER10. I C. elegans, tillväxt vid exponering för tunicamycin resulterar i stora störningar i ER funktion, och en betydligt minskad livslängd11. Genom att mäta djurens överlevnad på tunicamycinhaltiga plattor kan ER-stresskänsligheten hos djur kvantifieras. Till exempel, djur med ectopic UPRER induktion och därmed ökad motståndskraft mot protein felvikning stress i ER har en ökad överlevnad vid tunicamycin exponering jämfört med vilda djur12.
Oxidativ och mitokondriell stress appliceras på C. elegans genom att utsätta djur för det kemiska medlet, parakvat. Parakvat är en vanligt förekommande herbicid, som orsakar superoxid bildning specifikt i mitokondrierna13. På grund av den specifika lokaliseringen av mitokondrierna-härledda reaktiva syrearter (ROS), parakvat analyser används ofta som en "mitokondriell" stressanalys. Superoxid omvandlas dock snabbt till väteperoxid genom mitokondriell superoxiddismutaser (SODs)14. Väteperoxid kan därefter sprida sig ur mitokondrierna och orsaka oxidativ stress i andra delar av cellen. Därför beskriver vi parakvat överlevnadsanalyser som mätkänslighet för både mitokondriell och oxidativ stress (andra oxidativa stressanalyser kan hittas15).
Termotolerance analyser utförs i C. elegans genom att placera djur i förhöjda temperaturer. Omgivningstemperaturen för nematoder är ~15-20 °C och termisk stress framkallas vid temperaturer över 25 °C16,17. Termotolerance analyser utförs i allmänhet vid temperaturer från 30-37 °C, eftersom djur uppvisar stora cellulära defekter vid denna temperatur, och överlevnadsanalyser slutförs inom 24 timmar16,18. Här finns två alternativa metoder för att utföra termotoleranceanalyser: tillväxt vid 34 °C och tillväxt vid 37 °C. Tillsammans kan de protokoll som presenteras här användas för att utföra storskaliga skärmar i kombination med standardgen knock-down med RNA-interferens eller kemiska läkemedelsbibliotek.
Protokollet kan delas upp i 4 breda förfaranden- tillväxt av C. elegans och förberedelse för bildbehandling (avsnitt 1 och 2), avbildning av transkriptionella reportrar med fluorescerande mikroskopi (avsnitt 3-5), kvantitativa mätningar av reportrar med hjälp av en stor partikelflödescytometer (avsnitt 6) och fysiologiska analyser för att mäta stresskänslighet i C. elegans (avsnitt 7).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>for mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118072</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco granulated agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-782</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>C0051-25</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>350-5000-000</td>
			<td>equipped with a 488 nm light source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Cleaning Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5072-000</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Sheath Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5070-100</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG dioxane free</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>CI8280-4</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426500</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M205FA stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450040</td>
			<td>equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0070-3</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>75990-514</td>
			<td>equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289-50G</td>
			<td>for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tert-butyl hydroperoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>458139</td>
			<td>for oxidative stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660-5G</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurements of physiological stress responses in c. elegans

Organismer utsätts ofta för fluktuerande miljöer och förändringar i intracellulära homeostas, vilket kan ha skadliga effekter på deras proteom och fysiologi. Således har organismer utvecklats riktade och specifika stressreaktioner avsedda för att reparera skador och upprätthålla homeostas. Dessa mekanismer inkluderar det ovikta proteinsvaret hos den endoplasmatiska reticulum (UPRER),mitokondriernas (UPRMT)utvecklade proteinrespons (HSR) och oxidativstressrespons (OxSR). De protokoll som presenteras här beskriver metoder för att upptäcka och karakterisera aktiveringen av dessa vägar och deras fysiologiska konsekvenser i nematoden, C. elegans. För det första beskrivs användningen av pathway-specifika fluorescerande transkriptionella reportrar för snabb cellulär karakterisering, läkemedelsscreening eller storskalig genetisk screening (t.ex. RNAi eller mutantbibliotek). Dessutom beskrivs kompletterande, robusta fysiologiska analyser, som kan användas för att direkt bedöma djurens känslighet för specifika stressfaktorer, vilket fungerar som funktionell validering av de transkriptionsreportrar. Tillsammans möjliggör dessa metoder snabb karakterisering av de cellulära och fysiologiska effekterna av interna och externa proteotoxiska störningar.

Använda transkriptionella reportrar för att mäta aktivering av stressreaktioner Här används fluorescerande transkriptionsreportrar, som fungerar som robusta verktyg för att mäta aktivering av de flesta stressreaktioner i C. elegans. GFP-uttrycket drivs under initiativtagare till kanoniska mål för master transkriptionella tillsynsmyndigheter som arbetar med att reagera på fackspecifika påfrestningar. En omfattande förteckning över vanliga transkrip...

Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Här karakteriserar vi cellulära proteotoxiska stresssvar i nematoden C. elegans genom att mäta aktiveringen av fluorescerande transkriptionella reportrar och analysera känslighet för fysiologisk stress.

Mätningar av fysiologiska stressreaktioner i C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Dessa metoder kan användas för att karakterisera stressrespons i C.elegans och för att avgöra om genetiska eller farmakologiska perturbationer påverkar aktiveringen av skyddande cellulära vägar. Dessa metoder möjliggör snabb och hög genomströmning testning av hundratals perturbations såsom gen knockdown både på molekylära och fysiologiska nivåer. För att säkerställa analysen utförs på rätt sätt, inkludera positiva och negativa kontroller.Synkronisera friska, välmatade djur till rätt stadium och använd färska plattor för experimentet. Visualisering av mikromanipulation av maskarna med en plockning kan hjälpa nya användare att förstå hur maskarna kan ställas upp och bedömas för lönsamhet. Demonstrera förfarandena kommer att Phil Frankino, Holly Gildea, och Melissa Metcalf, doktorander i vårt laboratorium.För att använda djur som uttrycker GFP under främjaren av värmechockproteinet fyra för aktivering av endoplasmatiskt reticulum ovikta protein svar, odla synkroniserade reporter djur på 20 grader Celsius tills L4 scenen och tvätta maskarna från plattan med M9 medium och överföra till ett rör. Efter att ha samlat maskarna genom centrifugering, ersätt M9 med 25 nanogram per milliliter av drogen av intresse i M9 eller dimetylsulfoxid i M9 i kontrolldjurrören. Placera sedan maskarna på en roterande plattform i tre till fyra timmar vid 20 grader Celsius.Vid slutet av inkubationen centrifugerar maskarna att sätta sig innan behandlingslösningen ersätts med 15 milliliter enbart M9. Efter två tvättar, överför djuren till NGM-plattor eller NGM RNA-interferensplattor i förekommande fall och låta maskarna återhämta sig över natten vid 20 grader Celsius. När maskarna har återhämtat sig, tillsätt fem till 10 mikroliter av 100 millimolar natriumazid på en vanlig NGM-platta utan bakterier och placera en plattstår under ett dissekerande mikroskop.Överför 10 till 20 djur från plattan till platsen för natriumazid. Djuren bör gripa rörelse kort efter landning i saltlösningen. När natriumazid har avdunstat, rada upp djuren i önskad bildframställning med främre och bakre sidor i samma orientering för alla djur och omedelbart placera plattan av djur under ett stereomikroskop.Starta programvaran för avbildning av stereomikroskop och under fliken förvärv klickar du på öppna projekt och mappen för att öppna ett nytt projekt. Högerklicka och välj byt namn för att byta namn på mappen. Placera maskprovet under mikroskopmålet och använd Brightfield-inställningen för att lokalisera maskarnas rätta brännpunkt för att minimera fluorescerande blekning.Mitten av provet kommer att vara den punkt där raden av ägg är tydligt synlig och inte luddig. Ställ in exponeringstiden för att säkerställa att pixlar inte är mättade och även för att säkerställa att signalen ligger över detektionsgränsen. Efter att ha satt exponeringstiden, zoom, fokus och Brightfield kondensorer till lämpliga inställningar, klicka på knappen fånga bilden för att skaffa en bild.För avbildning med hjälp av ett sammansatt brett fältmikroskop, placera baslinjen kontroll behandlingsplatta på föreningen brett fält mikroskop skede och använda touch pad för att starta kontrollprogrammet. Skapa ett nytt album och filnamn och placera plattan under objektivet. Använd baslinjekontrollen och de positiva kontrollplattorna för att ställa in exponeringstiden och fluorescensintensiteten så att signalen syns men inte är mättad.Spara sedan Brightfield och GFP FITC bilder. För att kvantifiera induktionen av reportern genom stor partikelflödescytometri, slå först på cytometerlasrarna och öppna cytometermjukvaran. Klicka på start för att slå på lasrarna i mjukvarufönstret och klicka på Run för att initiera lasern i fönstret argon laser control popup.När lasern når runt 12 milliwatt och 488 ljuskällan nivå går upp till runt 12, klicka på gjort och kontrollera de fyra tryckvärden. Om värdena liknar de som observerats i den ursprungliga inställningen, kontrollera rutan tryck OK. Nästa, för att se till att det inte finns några luftbubblor eller skräp blockerar flödet av mant och prov genom flödescellen, klicka på Rengör flera gånger.Stäng sedan av sortera och på snyte för att starta om flödet. Om du vill kontrollera flödeshastigheten, samla in satsen i 60 sekunder. Samla in lysstninnan i ett 15 milliliterrör i 60 sekunder.Flödeshastigheten bör vara nio till 10 milliliter per minut. Om du vill köra proverna justerar du laserfotomultipliereffekten till en nivå som är tillräckligt hög för att signalen ligger över detektionsgränsen men inte högre än mättnadsgränsen. Utför storlek gating att utesluta bubblor, skräp, ägg, och andra oönskade små partiklar och att endast omfatta de djur av intresse såsom vuxna.När screening parametrar har ställts in, lägga till de beredda maskarna till en kopp och klicka på förvärva. Titta för att se till att all vätska inte tas upp i maskinen eftersom detta kommer att orsaka flödet cytometer att ta in luft och skapa bubblor inom detektorn. När provet är lågt och/eller tillräckligt många djur har samlats in klickar du på stopp.Om du vill lagra gated-data baserat endast på storleksbegränsningarna klickar du på installationsprogrammet, datalagringen, endast gated och store gated för att spara data. Skölj sedan uppsamlingskoppen med avjoniserat vatten och ta bort tvätten genom vakuum tre gånger innan analysen upprepas med nästa prov. För att mäta mitokondriell och oxidativ stresskänslighet, tillsätt 50 till 75 mikroliter av Parakvat i M9 till åtta till 10 brunnar per villkor av en platt botten 96-brunnsplatta och överför åtta till 10 maskar per tillstånd till varje brunn av Paraquat.Varannan timme, knacka på plattan försiktigt för att få de levande djuren att slå eller böja för att möjliggöra poängsättning av antalet döda djur per brunn. För att mäta djurens temperaturkänslighet, ruva maskarna i tre till fyra dagar vid 20 grader Celsius innan du pläterar 10 till 15 djur per platta per villkor för totalt fyra till sex plattor. Placera sedan plattorna i en 34 eller 37 grader Celsius inkubator och poäng masken överlevnad varannan timme som bara visat.HSP-4 reporter har minimalt basalt intryck i avsaknad av stress men uppvisar en robust GFP uttryck när djuren utsätts för endoplasmic reticulum stress med hjälp av läkemedlet Tunicamycin. Dessa skillnader kan också kvantifieras med hjälp av en stor partikelflödescytometer. Dessutom kan induktion av transgenen under endoplasmatisk reticulum stress vara helt supressed genom knockdown av XBP-1 via RNA-interferens.Liknande analyser kan utföras för att mäta mitokondriell stress, oxidativ stress, och värmestress. Hela djur fysiologiska reaktioner på stress kan också mätas med hjälp av flera överlevnadsanalyser. Till exempel används exponering för Tunicamycin för att mäta endoplasmatisk retikulum stresskänslighet.Den knockdown av XBP-1 genen resulterar i en betydande ökning av känsligheten för Tunicamycin. Exponering för det kemiska agenset Paraquat används dessutom för att mäta oxidativ och mitokondriell stresskänslighet. Knockdown av DAF-2 genen resulterar i en betydande ökning av resistens mot Parakvat.Termotolerans kan mätas genom att bestämma djurens överlevnad vid förhöjda temperaturer och kan ritas som en överlevnadskurva. Dessa analyser bör utföras minst fyra till sex gånger och alla replikat bör ritas mot varandra som termotolerance visar en otroligt hög variabilitet jämfört med andra stress analyser. Vid bildframställning av djur är det viktigt att ställa in parametrarna så att det inte finns någon över eller under mättnad av signal och att säkerställa att samma parametrar används under hela experimentet.De bildframställningsprotokoll som beskrivs här är mottagliga för storskalig screening inklusive genom-wide skärmar och är bra för både undersökande och bekräftande studier som sedan kan följas upp av fysiologiska analyser som beskrivs.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generering av Stabil Transgena C. elegans Använda mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Övervakning växt hormoner under stressreaktioner

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generering av Transgena C. elegans Genom Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

Länka Predation Risk, växtätare fysiologisk stress och mikrobiell nedbrytning av växt kullen

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans kemotaxianalys

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antikropp färgning i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Använda &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

En Anoxia-svält modell för ischemi / reperfusion i<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder för Skin såra och Analyser för Wound-svar i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Metoder för att bedöma Subcellulära Fack för Muscle in<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...