Name: measurements of physiological stress responses in c. elegans
Uploaded: 2020-05-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

R.BZ. EMBO uzun vadeli burs ve Larry L. Hillblom Vakfı tarafından desteklenir. R.H.S, Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA) ve Glenn Tıbbi Araştırma Doktora Sonrası Burs Vakfı aracılığıyla 5F32AG032023-02 hibe ile desteklenir. A.F. NIA aracılığıyla Hibe F32AG051355 tarafından desteklenir. H.K.G. Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu Programı ile DGE1752814 hibe ile desteklenir. M.G.M. NIA ile 1F31AG060660-01 tarafından desteklenir. A.D. Thomas ve Stacey Siebel Vakfı, Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve 4R01AG042679-04 ve 5R01AG05891-02 NIA ve 5R01ES021667-09 NIEHS tarafından desteklenir. Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet ve Anel Esquivel'e önemli teknik yardımlar için teşekkür ederiz. Biz Morimoto laboratuvar ve CGC (NIH Office Araştırma Altyapı Programı P40 OD010440 tarafından finanse edilen) suşları için teşekkür ederiz.

1. Standart sıcaklık ve OP50 vs HT115 büyüme koşulları
<ol><li>Standart büyüme ve genişleme<ol>
<li>LB(Tablo 1)veya ortam sıcaklığında (~22-25 °C) 24-48 saat için tercih edilen eşdeğer ortamda OP50 kültürünü büyütün. OP50 bir urasil auxotroph olduğu için oda sıcaklığında bakteri yetiştirmek ve 37 °C'de yetiştirildiğinde daha yüksek bir geri revertant (örn. baskılayıcı mutantlar) insidansı vardır. OP50 kültürlerinin uzun süreli depolanması önerilmez (4 °C'd...

Burada, C. eleganshücresel stres yanıtlarını sorgulamak için yöntemler , floresan transkripsiyonel muhabirler ve fizyolojik stres sağkalım tahlilleri kullanılarak açıklanmıştır. Muhabirlerin hepsi, hücresel stres tepkilerinin artmasıyla ilgili transkripsiyon faktörlerinin aşağı transkripsiyon hedefinin organizatörü altında yönlendirilen GFP ifadesini kullanırlar. HSP-4p kullanımı::GFP XBP-1s-aracılı UPRERtarafından modüle , hsp-6p::GFP ATFS-1-aracılı ...

Bir organizmanın hücre içi ve hücre dışı ortamdaki değişikliklere yanıt verebilme yeteneği hayatta kalması ve adaptasyonu için çok önemlidir. Bu hücre bütünlüğünü sağlamak çok sayıda koruyucu yollar aracılığıyla hücresel düzeyde gerçekleştirilir. Çok sayıda hücresel bileşenler stresle ilişkili hasara maruz kalırken, hücresel stres yanıtlarının önemli bir tutulumu hücresel proteomun homeostazını onarmak ve korumaktır. Ancak, proteinlerin organel adı verilen özel yapılara bölünmesi, hücre içindeki tüm proteinlerin düzgün bir şekilde katlanıp işlevsel olmasını sağlamak için merkezi bir protein kalite kontrolü formuna güvenemeyeceği nden, hücre için bir sorun teşkil etmektedir. Bu nedenle, proteinleri için tedirginlikile başa çıkmak için, organeller yanlış katlanmış proteinleri algılamak ve bu bölme içinde stresi hafifletmek için bir girişim bir stres yanıtı etkinleştirmek özel kalite kontrol mekanizmaları, gelişti. Örneğin, sitosol ısı şoku tepkisine (HSR) dayanırken, endoplazmik retikulum (ER) ve mitokondriler kompartmana özgü açılmakta olan protein yanıtlarına (UPR) güvenirler. OxSR reaktif oksijen türlerinin toksik etkilerini hafifletmek için hizmet vermektedir (ROS). Her stres tepkisi hücresel sorunlar ve çevresel hakaretvarlığında tetiklenir ve özel bir transkripsiyonel tepki neden olur. Bu yanıtların ayırıcı özellikleri, yanlış katlanmış proteinleri (şaperonlar gibi) uygun organelle yeniden katlayan veya alternatif olarak protein yıkımı ile hasarlı proteinleri ortadan kaldıran moleküllerin sentezlemesidir. Bu stres yanıtlarının etkinleştirilmesinin sağlanamaması hasarlı proteinlerin birikmesine, dokuların sistemik yetmezliğine yayılan hücresel disfonksiyona ve sonunda organizmanın ölümüne yol açar. Farklı stres yanıtlarının işlevi ve düzenlenmesi başka bir yerde gözden geçirilir1.
Hücresel stres yanıtlarının düzenlenmesi ve aktivitesi ile ilgili birçok anlayışlar nematod atfedilmiştir, Caenorhabditis elegans, genetik araştırmalarda çok hücreli model organizma. Nematodlar sadece hücredüzeyinde stres yanıtlarının aktivasyonçalışmasına izin değil, aynı zamanda organizma düzeyinde; nematodlar genetik tedirginliklerin veya ilaçlara ve kirleticilere maruz kalmanın büyüme ve hayatta kalma üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Onların hızlı nesil zaman, izojeni, şeffaflık, genetik sistemlilik, ve deneme sırasında kullanım kolaylığı onları bu tür çalışmalar için ideal olun. Ayrıca, strese nispeten hızlı fizyolojik tepki (saat ve birkaç gün arasında) ve hücresel yolların evrimsel korunması nematodlar stres direnci çalışmalarında önemli bir araç olun.
C. elegansbüyümek için bir besin kaynağı olarak kullanılan iki yaygın olarak kullanılan E. coli suşları vardır: standart OP50, hangi en deney tarihsel2 ve HT115, hemen hemen tüm RNAi deneyleri için kullanılan bir K-12 suşu yapılmıştır bir B suşu3,4. OP50 ve HT115 bakteriyel diyetler arasında önemli farklılıklar olduğunu unutmayın. Bu farklı bakteriyel kaynaklarda büyüme metabolik profil, mitokondriyal DNA kopya numarası ve yaşam süresi5de dahil olmak üzere birçok önemli fenotipler, önemli farklılıklara neden olduğu gösterilmiştir . Bu farklılıkların bazıları OP50 bakteri büyüme ile ilişkili Vitamin B12 eksikliği atfedilir, mitokondriyal homeostaz kusurları ve patojenler ve streslere karşı artan duyarlılık neden olabilir. Tüm bu fenotiplerin HT115 bakterisi üzerinde büyüme ile hafifletilmiş olduğu gösterilmiştir, Hangi B12 vitamini daha yüksek düzeyde var6. Bu nedenle, rnai koşullarının gerekliliğine bakılmaksızın HT115 bakterileri üzerinde fizyolojik stres yanıtları üzerinde tüm deneylerin yapılması tavsiye edilir. Ancak, OP50'de hayvanların bakım kolaylığı nedeniyle, tüm standart büyüme (yani hayvanların bakımı ve amplifikasyonu) OP50 üzerinde gerçekleştirilebilir, çünkü burada açıklanan deneysel paradigmalarda önemli farklılıklar saptanamamıştır, op50'de tutulan solucanlarda, ht115 sonrası senkronizasyona (yani, l1 tutuklaması ile veya l1 tutuklaması olmadan yumurta dan beyazlatma dan) geçirilmelerinden itibaren fark edilmemiştir.
Burada iki fonksiyonel yöntem kullanılarak hücresel stres yanıtlarının aktivitesinin karakterizasyonu açıklanmıştır. Bu protokoller sunulan öncelikle hücresel stres yanıtları ve protein homeostaz üzerindeki etkileri üzerinde duruldu unutulmamalıdır. İlk olarak, floresan transkripsiyonel muhabirler kullanılmaktadır, hangi özellikle farklı hücresel streslere yanıt olarak aktive endojen gen organizatörleri tarafından düzenlenir. Bu floresan transkripsiyonel muhabirler, stres yanıtının doğal olarak bir parçası olan spesifik genlerin transkripsiyonel indüksiyonuna dayanmaktadır. Örneğin, HSP-4, insan refakatçih HSPA5/BiP bir ısı şok proteinorolog, ER-stres üzerine aktive edilir ve stresi hafifletmek için ER lokalize. ER stres koşullarında (örneğin, tunicamycin maruz imal), yeşil floresan protein (GFP), hsp-4 organizatörü nyönetmeliği altında yer, floresan mikroskopisi ile değerlendirilebilir veya kantitatif nematodların büyük parçacık akış sitometri kullanılarak ölçülebilir yüksek seviyelerde sentezlenir7. Benzer şekilde, bir mitokondriyal şaperon organizatörü, hsp-6 (memeli HSPA9 ortologous), UPRMT8aktivasyonunu izlemek için kullanılır , ve sitosolik şaperon organizatörü-16.2 (insan kristalin alfa genlerine ortologous) HSR aktivitesini değerlendirmek için kullanılır9. Bu muhabirler çeşitli tedirginliklere yanıt olarak aktive yolları hızlı bir karakterizasyon sağlar.
Genellikle, burada sunulan muhabirler stres yanıtlarının aktivasyonu nitel bir çıkış sağlayan mikroskopi kullanılarak görüntülenir. Ancak, görüntüleme teknikleri yukarıda açıklanan gazetecilerin yoğunluğu ve doku konumu hakkında hem bilgi sağlarken, onun nicelliği her zaman doğru veya sağlam değildir. Görüntüleme analiz araçları kullanılarak floresan aktivasyonu ölçmek mümkün olmakla birlikte, bu yöntemler nispeten düşük iş akışı ve örnek boyutu küçüktür, çünkü görüntülenmiş hayvan sayısı nispeten düşüktür. Kolaylık ve hayvanların büyük miktarlarda elde etmek için yeteneği hızla C. elegans ideal bir model sistemi büyük bir parçacık akışı sitometre kullanımı ile floresan stres muhabirlerinin aktivasyonunu titretmek için olun. Büyük parçacık akış sitometresi, birçok canlı hayvanın boyutuna ve floresansına göre kayıt, analiz ve sıralama yeteneğine sahiptir. Bu yöntemi kullanarak, binlerce solucan için floresan yoğunluğu, boyutu ve mekansal (2D) bilgi almak mümkündür. Sistem flowpilot kullanılarak kontrol edilir, hangi gerçek zamanlı veri toplama ve ölçülen parametrelerin analizi sağlar. Burada, büyük parçacık akış sitometresi kullanarak hem mikroskobik görüntüleme hem de kantitatif analiz yöntemleri stres yanıtlarının aktivasyonunu ölçmek için yöntemler olarak sunulmuştur.
Muhabir analizinin ötesinde, hayvanların strese karşı duyarlılığı veya direnci fizyolojik stres tahlilleri kullanılarak ölçülebilir. Bu belirli hücresel stres yollarını etkinleştirmek stresli ortamlara hayvanların maruz kalma ile elde edilir. Burada, tüm hayvanların belirli stres türlerine karşı duyarlılığını ölçmek için çeşitli yöntemler sağlanmaktadır.
ER stres ilerkist asyon, n-bağlı glikozilasyon blokları, ER10yanlış katlanmış proteinlerin birikimine neden kimyasal ajan, tunicamycin kullanılarak C. elegans uygulanır. C. elegansolarak , ER fonksiyonunda majör pertüreasyonlar tunicamycin sonuçlarına maruz kalma üzerine büyüme, ve önemli ölçüde azalmış ömrü11. Tunicamisin içeren plakalar üzerinde hayvanların hayatta kalma ölçümü ile, hayvanların ER stres duyarlılığı ölçülebilir. Örneğin, ektopik UPRER indüksiyonu olan ve böylece ACIL'de protein misfolding strese karşı direnci artmış olan hayvanlar yabani tip hayvanlara göre tunicamycin maruz kalma üzerine artan bir sağkalım var12.
Oksidatif ve mitokondriyal stres C. elegans kimyasal ajan, paraquat hayvanlar maruz tarafından uygulanır. Paraquat özellikle mitokondri13süperoksit oluşumuna neden olan yaygın olarak kullanılan herbisit vardır. Mitokondri kaynaklı reaktif oksijen türlerinin (ROS) spesifik lokalizasyonu nedeniyle, paraquat tahlilleri genellikle "mitokondriyal" stres tahlilleri olarak kullanılır. Ancak, süperoksit hızla mitokondriyal süperoksit dismutazlar tarafından hidrojen peroksit dönüştürülür (SODs)14. Hidrojen peroksit daha sonra mitokondri dışına yayılabilir ve hücrenin diğer bölümlerinde oksidatif strese neden olabilir. Bu nedenle, paraquat sağkalım tahlilleri hem mitokondriyal hem de oksidatif strese duyarlılık ölçümü olarak tanımlarız (diğer oksidatif stres tahlilleribulunabilir 15).
Termotolerans tahlilleri C. elegans yüksek sıcaklıklarda hayvanlar yerleştirerek yapılır. Nematodlar için ortam sıcaklıkları ~15-20 °C'dir ve termal gerilim 25 °C16,17üzerindeki sıcaklıklarda indüklenir. Termotolerans tahlilleri genellikle 30-37 °C arasında değişen sıcaklıklarda yapılır, hayvanlar bu sıcaklıkta büyük hücresel bozukluklar sergilerler ve hayatta kalma tahlilleri 24 saat içinde tamamlanır16,18. Burada termotolerans tahlillerinin icrası için iki alternatif yöntem sağlanmaktadır: 34 °C'de büyüme ve 37 °C'de büyüme. Burada sunulan protokoller birlikte, RNA paraziti veya kimyasal ilaç kütüphaneleri kullanılarak standart gen knock-down ile birleştirildiğinde büyük ölçekli ekranlar gerçekleştirmek için kullanılabilir.
Protokol, C. eleganların büyümesi ve görüntülemeye hazırlık (bölüm 1 ve 2), transkripsiyonel muhabirlerin floresan mikroskopi kullanılarak görüntülenmesi (bölüm 3-5), büyük parçacık akış sitometresi kullanan muhabirlerin kantitatif ölçümleri (bölüm 6) ve C. elegans'taki stres hassasiyetini ölçmek için fizyolojik tahliller olmak üzere 4 geniş prosedüre bölünebilir (bölüm 7).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>for mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118072</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco granulated agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-782</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-904</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>BioPioneer</td>
			<td>C0051-25</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>350-5000-000</td>
			<td>equipped with a 488 nm light source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Cleaning Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5072-000</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAS Sheath Solution</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>300-5070-100</td>
			<td>to use with COPAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG dioxane free</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>CI8280-4</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426500</td>
			<td>for LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M205FA stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450040</td>
			<td>equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0070-3</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>36541</td>
			<td>for oxidative/mitochondrial stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>for bleach soluton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1570-2</td>
			<td>for NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-PX1565-5</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revolve</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>75990-514</td>
			<td>equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289-50G</td>
			<td>for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0420-5</td>
			<td>for NGM plates, M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71003-472</td>
			<td>for M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tert-butyl hydroperoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>458139</td>
			<td>for oxidative stress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660-5G</td>
			<td>for RNAi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7765-50MG</td>
			<td>for ER stress</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurements of physiological stress responses in c. elegans

Organizmalar genellikle dalgalanan ortamlara ve hücre içi homeostazdeğişikliklerine maruz kalırlar, bu da proteom ve fizyolojileri üzerinde zararlı etkilere yol açabilir. Böylece, organizmalar hasar onarmak ve homeostaz korumak için adanmış hedefli ve özel stres yanıtları gelişti. Bu mekanizmalar arasında endoplazmik retikulum (UPRER),mitokondri (UPRMT),ısı şoku yanıtı (HSR) ve oksidatif stres tepkisinin (OxSR) ortaya çıkan protein yanıtı yer almaktadır. Burada sunulan protokoller, bu yolların aktivasyonunu ve bunların nematod, C. elegans'takifizyolojik sonuçlarını tespit etme ve karakterize etme yöntemlerini tanımlar. İlk olarak, hızlı hücresel karakterizasyon, ilaç taraması veya büyük ölçekli genetik tarama (örneğin, RNAi veya mutant kütüphaneler) için yola özgü floresan transkripsiyonel muhabirlerin kullanımı açıklanmıştır. Buna ek olarak, tamamlayıcı, sağlam fizyolojik tahliller açıklanmıştır, hangi doğrudan belirli stres hayvanların duyarlılığını değerlendirmek için kullanılabilir, transkripsiyonel muhabirlerin fonksiyonel doğrulama olarak hizmet vermektedir. Birlikte, bu yöntemler iç ve dış proteotoksik pertürbations hücresel ve fizyolojik etkileri hızlı karakterizasyonu için izin verir.

Stres yanıtlarının aktivasyonunu ölçmek için transkripsiyonel muhabirleri kullanma Burada, floresan transkripsiyonel muhabirler kullanılır, Hangi C. elegansen stres yanıtlarının aktivasyon ölçmek için sağlam araçlar olarak hizmet vermektedir. GFP ifadesi, bölmeye özgü streslere yanıt veren ana transkripsiyonel düzenleyicilerin kanonik hedeflerinin organizatörü altında yürütülür. Yaygın olarak kullanılan transkripsiyonel muhabirler...

Watch this Scientific Journal Video about Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans at JoVE.com

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Burada, nematod C. elegans hücresel proteotoksik stres yanıtları floresan transkripsiyonel muhabirlerin aktivasyonunu ölçerek ve fizyolojik strese duyarlılık belirterek karakterize.

C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Bu yöntemler C.elegans stres yanıtlarını karakterize etmek ve genetik veya farmakolojik pertürbations koruyucu hücresel yolların aktivasyonunu etkileyip etkilemediğini belirlemek için kullanılabilir. Bu yöntemler, gen nakavtı gibi yüzlerce tedirginliğin hem moleküler hem de fizyolojik düzeyde hızlı ve yüksek iş elde etme testine olanak sağlar. Tamanın düzgün yapıldığından emin olmak için pozitif ve negatif denetimler ekleyin.Sağlıklı, iyi beslenmiş hayvanları uygun aşamaya senkronize edin ve deney için taze tabaklar kullanın. Solucanların mikromanipülasyonunun bir kazma ile görselleştirilmesi, yeni kullanıcıların solucanların nasıl dizilmiş ve canlılık açısından değerlendirilebileceğini anlamalarına yardımcı olabilir. Prosedürleri gösteren Phil Frankino, Holly Gildea ve Melissa Metcalf, laboratuvarımızda yüksek lisans öğrencileri olacak.Endoplazmik retikulum aktivasyonu için ısı şok proteini dört organizatörü altında GFP ifade hayvanları kullanmak için protein yanıtı ortaya çıktı, L4 aşamasına kadar 20 derece santigrat senkronize muhabir hayvanlar büyümek ve M9 orta kullanarak plaka solucanları yıkayın ve bir tüp içine transfer. Solucanları santrifüj le topladıktan sonra, Kontrol hayvan tüplerinde M9'daki ilgi ilacının mililitresi başına 25 nanogram veya M9'da meçtil sülfoksit ile M9'u değiştirin. Daha sonra solucanları 20 santigrat derecede 3-4 saat döner bir platforma yerleştirin.Kuluçka sonunda, sadece 15 mililitre M9 ile tedavi çözeltisi değiştirmeden önce yerleşmek için solucanlar santrifüj. İki yıkamadan sonra, hayvanları uygun şekilde NGM plakalarına veya NGM RNA girişim plakalarına aktarın ve solucanların bir gecede 20 santigrat derecede iyileşmesini bekleyin. Solucanlar iyileştiğinde, bakteri içermeyen standart bir NGM plakasına 100 milimolar sodyum azitin 5 ila 10 mikrolitresini ekleyin ve bir parçalama mikroskobunun altına bir tabak solucan yerleştirin.10-20 hayvanı tabaktan sodyum azit noktasına aktarın. Hayvanlar tuz çözeltisi indikten kısa bir süre sonra hareket ele geçirmelidir. Sodyum azit buharlaştıktan sonra, tüm hayvanlar için ön ve arka yanlarla istenilen görüntüleme düzeninde hayvanları hizalayın ve hemen bir stereo mikroskop altında hayvan plakayerleştirin.Stereo mikroskop görüntüleme yazılımını başlatın ve satın almalar sekmesi altında, yeni bir proje açmak için projeleri ve klasörü açın' ı tıklatın. Klasörü yeniden adlandırmak için sağ tıklatın ve yeniden adlandır'ı seçin. Solucan örneğini mikroskop hedefinin altına yerleştirin ve floresan ağartmayı en aza indirmek için solucanların doğru odak noktasını bulmak için Brightfield ayarını kullanın.Örneğin merkezi, yumurta çizgisinin açıkça görülebilen ve bulanık olmadığı nokta olacaktır. Piksellerin doygun olmadığından emin olmak ve sinyalin algılama sınırının üzerinde olduğundan emin olmak için pozlama süresini ayarlayın. Pozlama süresini, yakınlaştırmayı, netleştirme ve Brightfield kondansatörlerini uygun ayarlara ayarladıktan sonra, görüntü elde etmek için görüntü yakalama düğmesini tıklatın.Bileşik geniş alan mikroskobu kullanarak görüntüleme için, anapara kontrol işlem plakasını bileşik geniş alan mikroskop aşamasına yerleştirin ve kontrol programını başlatmak için dokunmatik yüzeyi kullanın. Yeni bir albüm ve dosya adı oluşturun ve plakayı objektif lensin altına yerleştirin. Sinyalin görünür olmasına ancak doymamış olması için pozlama süresini ve floresan yoğunluğunu ayarlamak için taban çizgisi kontrol ve pozitif kontrol plakalarını kullanın.Ardından Brightfield ve GFP FITC görüntülerini kaydedin. Büyük parçacık akış sitometrisi ile muhabirin indüksiyonölçmek için, ilk sitometre lazerler açın ve sitometre yazılımı açın. Yazılım penceresindelazerleri açmak için başlat'ı tıklatın ve argon lazer kontrol açılır penceresinde lazer başlatmak için çalıştır'ı tıklatın.Lazer yaklaşık 12 miliwatt'a ulaştığında ve 488 ışık kaynağı seviyesi 12 civarına ulaştığında, yapılanı tıklatın ve dört basınç değerini kontrol edin. Değerler orijinal kurulumda gözlenendeğerlere benziyorsa, basınç Tamam kutusunu işaretleyin. Daha sonra, akış hücresi aracılığıyla kılıf ve örnek akışını engelleyen hiçbir hava kabarcıkları veya enkaz olduğundan emin olmak için, birkaç kez temiz tıklatın.Sonra akışı yeniden başlatmak için sıralama ve kılıf kapatın. Akış hızını kontrol etmek için, 60 saniye boyunca kılıf toplayın. 60 saniye boyunca 15 mililitrelik bir tüp içine kılıf toplayın.Akış hızı dakikada 9 ila 10 mililitre olmalıdır. Örnekleri çalıştırmak için, lazer fotoçarpıtıcı gücünü sinyalin algılama sınırının üzerinde, ancak doygunluk sınırından yüksek olmayan bir seviyeye ayarlayın. Kabarcıklar, enkaz, yumurta ve diğer istenmeyen küçük parçacıklar hariç ve yetişkinler gibi ilgi sadece hayvanları dahil etmek için boyut gating gerçekleştirin.Tarama parametreleri ayarlandığında, hazırlanan solucanları bir bardağa ekleyin ve satın almak'a tıklayın. Bu akış sitometre hava almak ve dedektör içinde kabarcıklar oluşturmak neden olur gibi tüm sıvı makineye alınmadığından emin olmak için izleyin. Örnek düşük ve/veya yeterli hayvan toplandığında, durdurma'yı tıklatın.Yalnızca boyut kısıtlamalarına dayalı olarak kapılı verileri depolamak için kurulum, veri depolama, yalnızca geçitli ve verileri kaydetmek için geçitli depolamayı tıklatın. Daha sonra toplama kabını deiyonize suyla durulayın ve bir sonraki numuneyle analizi tekrarlamadan önce vakumla yıkamayı üç kez çıkarın. Mitokondriyal ve oksidatif stres hassasiyetini ölçmek için, M9'da 50 ila 75 mikrolitre Paraquat ekleyin, düz bir alt 96 kuyunun durumu başına 8 ila 10 kuyu ekleyin ve Paraquat'ın her kuyuya her bir kuyuya 8 ila 10 solucan aktarın.Her iki saatte bir, canlı hayvanların dayak veya iyi başına ölü hayvan sayısının puanlama sağlamak için viraj neden olarak yavaşça plaka dokunun. Hayvanların sıcaklık hassasiyetini ölçmek için, solucanları 20 santigrat derecede 3-4 gün kuluçkaya yatırın ve toplam dört ila altı tabak için her bir koşul başına 10 ila 15 hayvanı kaplamadan önce. Sonra 34 veya 37 derece santigrat santigrat kantimetre içine plakaları yerleştirin ve sadece gösterildiği gibi her iki saatte bir solucan hayatta kalma puan.HSP-4 muhabiri stres yokluğunda minimal bazal izlenime sahiptir ancak hayvanlar tunicamycin ilacını kullanarak endoplazmik retikulum stresine maruz kaldığında sağlam bir GFP ifadesi sergiler. Bu farklılıklar da büyük bir parçacık akış sitometresi kullanılarak ölçülebilir. Ayrıca, transgenin endoplazmik retikulum stresi altında indüksiyonu, RNA müdahalesi ile XBP-1'in yıkılması ile tamamen bastırılabilir.Benzer tahliller mitokondriyal stresi, oksidatif stresi ve ısı stresini ölçmek için yapılabilir. Strese tüm hayvan fizyolojik tepkiler de birkaç hayatta kalma tahlilleri kullanılarak ölçülebilir. Örneğin, Tunicamycin maruz iyelik endoplazmik retikulum stres duyarlılığını ölçmek için kullanılır.XBP-1 geninin yıkılması Tunicamisin duyarlılığında önemli bir artışa yol açabedilir. Ayrıca, kimyasal ajan Paraquat maruz oksidatif ve mitokondriyal stres hassasiyetini ölçmek için kullanılır. DAF-2 geninin yıkılması Paraquat'a karşı direncinde önemli bir artışa yol açabıla sonuçlanır.Termotolerans yüksek sıcaklıklarda hayvanların hayatta kalma belirlenmesi ile ölçülebilir ve bir hayatta kalma eğrisi olarak çizilebilir. Bu tahliller en az dört ila altı kez yapılmalıdır ve termotolerans diğer stres tahlillerine göre inanılmaz derecede yüksek bir değişkenlik gösterdiğinden, tüm kopyalar birbirine karşı çizilmelidir. Hayvanları görüntülerken, sinyalin üzerinde veya altında bir şey olmayacak parametrelerin ayarlanması ve deney boyunca aynı parametrelerin kullanılmasını sağlamak önemlidir.Burada açıklanan görüntüleme protokolleri genom genişliğinde ekranlar da dahil olmak üzere büyük ölçekli tarama için uygun olup, hem araştırmacı hem de doğrulayıcı çalışmalar için mükemmeldir ve daha sonra açıklanan fizyolojik tahlillerle takip edilebilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Stres Cevaplarının sırasında Bitki Hormonları İzlenmesi

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

Predasyon Risk, Herbivore Fizyolojik Stres ve Bitki Çöp mikrobiyal bozunma Bağlama

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antikor boyamasında<em&gt; C. Elegans</em&gt; &quot;Freeze-Cracking kullanma&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Içinde Yara Yanıtları Cilt yaralayarak Yöntemleri ve Testler<em&gt; ° C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP<em&gt; ° C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...