Name: isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer
Uploaded: 2020-05-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer at JoVE.com

Dette projekt blev finansieret af AFM-Telethon og A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies. Forfatterne ønsker at anerkende skaberen af de produkter, der er nævnt i denne artikel, IONOptix Inc.

Protokollen for opnåelse af humane biopsier blev godkendt af den institutionelle review board på VU University Medical Center (#2014/396) og skriftligt informeret samtykke blev indhentet fra forsøgspersonerne. Protokollen for opnåelse af dyremuskelbiopsier blev godkendt af den lokale dyreetikkomité ved VU University (AVD114002016501)
1. Forberedelse og myofibril isolation
BEMÆRK: Brug tidligere beskrevne metoder til glycerinering af biopsier, klargør de forskel...

<ol>
	<li>Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcomere+Dysfunction+in+Nemaline+Myopathy.">Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy.</a> J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).</li><li>Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+and+passive+forces+of+isolated+myofibrils+from+cardiac+and+fast+skeletal+muscle+of+the+frog.">Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog.</a> Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).</li><li>Kulke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+major+source+of+myofibrillar+stiffness+in+Drosophila+indirect+flight+muscle.">a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle.</a> Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).</li><li>Stehle, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isometric+force+kinetics+upon+rapid+activation+and+relaxation+of+mouse,+guinea+pig+and+human+heart+muscle+studied+on+the+subcellular+myofibrillar+level.">Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level.</a> Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).</li><li>Ribeiro, P. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+Effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Joureau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+sarcomere+contractility+contributes+to+muscle+weakness+in+ACTA1-related+nemaline+myopathy+(NEM3).">Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3).</a> Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).</li><li>de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+perfusion+shows+intersarcomere+dynamics+within+single+skeletal+muscle+myofibrils.">Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).</li><li>Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+force+enhancement+is+regulated+by+titin+in+skeletal+and+cardiac+myofibrils.">Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils.</a> Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).</li><li>Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+non-cross-bridge+forces+after+stretch+of+activated+striated+muscle+is+related+to+titin+isoforms.">The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).</li><li>Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+system+for+probing+cantilever+deflections+parallel+to+a+sample+surface.">Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface.</a> Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).</li><li>Chavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferrule-top+nanoindenter:+an+optomechanical+fiber+sensor+for+nanoindentation.">Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation.</a> Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).</li><li>Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metrological+approach+for+the+calibration+of+force+transducers+with+interferometric+readout.">A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout.</a> Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).</li><li>van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+dynamic+mechanical+analysis+for+heterogeneous+soft+matter+using+ferrule-top+indentation.">Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation.</a> Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KBTBD13+is+an+actin-binding+protein+that+modulates+muscle+kinetics.">KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2019).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-specific+effects+on+thin+filament+length+in+thin+filament+myopathy.">Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy.</a> Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).</li><li>Ottenheijm, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleting+exon+55+from+the+nebulin+gene+induces+severe+muscle+weakness+in+a+mouse+model+for+nemaline+myopathy.">Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy.</a> Brain. 136, 1718-1731 (2013).</li><li>Ribeiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+Myosin-II+Inhibitor+(N-benzyl-p-toluene+Sulphonamide,+BTS)+on+Contractile+Characteristics+of+Intact+Fast-twitch+Mammalian+Muscle+Fibres.">Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).</li><li>Stehle, R., Kr&#252;ger, M., Pfitzer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+kinetics+and+individual+sarcomere+dynamics+in+cardiac+myofibrils+after+rapid+Ca(2+)+changes.">Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes.</a> Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).</li><li>Najafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-diastolic+force+pre-activates+cardiomyocytes+and+determines+contractile+force:+role+of+titin+and+calcium.">End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium.</a> Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).</li></ol>

Beskrevet er en protokol til vurdering af kontraktile funktion myofibrils isoleret fra menneskelige eller animalske skeletmuskulatur væv. Kraftopløsningen af denne opsætning er tidligere blevet beskrevet af Chavan et al.12. Kort sagt bestemmes det af de tilfældige udsving i længden af Fabry-Pérot-hulrummet mellem detektionsfiberen og den udkrøje, der producerer den dominerende del af støjen ved udlæsningens output (udtrykt i V), der ganget med afbøjningsfølsomhed (udtrykt i m/V) og af u...

Nedstribede muskelceller er uundværlige for dagligdagen aktiviteter. Lemmer bevægelse, respiratorisk funktion, og pumpe bevægelse af hjertet stole på den kraft, der genereres af muskelceller. Skeletmuskulatur består af muskelfacukkler indeholdende bundter af enkelt muskelfibre (Figur 1A). Disse muskelfibre består af myofibrils, som er dannet af serielt forbundne sarcomeres(Figur 1B,D). Sarcomeres indeholder tynde og tykke filamenter. Disse består primært af kæder af actin og myosin molekyler, henholdsvis (Figur 1B). Actin-myosin interaktioner er ansvarlige for den kraft-genererende kapacitet af muskler. Patienter med mutationer i gener kodning for sarkomeriske proteiner, såsom nebulin, actin, og troponin T, lider af muskelsvaghed på grund af kontraktile dysfunktion1.
Kvaliteten af muskel kontraktilitet kan studeres på forskellige niveauer af organisationen, lige fra in vivo hele muskler til actin-myosin interaktioner i in vitro motility assays. I løbet af de seneste årtier har flere forskningsgrupper udviklet opsætninger til at bestemme kontraktilitet af de enkelte myofibrils2,3,4,5,6,7,8,9,10. Disse opsætninger er baseret på påvisning af ændringer i laserafbøjning fra en cantilever (dvs. optisk stråleafbøjning) forårsaget af sammentrækning af myofibril (for detaljer, se Labuda et al.11). Selv om bestemmelse af kontraktile funktion myofibrils har nogle begrænsninger (f.eks dynamikken i excitation-sammentrækning kobling processer, der er opstrøms for myofibrils mangler), der er flere fordele ved denne tilgang. Disse omfatter: 1) evnen til at vurdere actin-myosin interaktioner i overværelse af de geometriske begrænsninger af sarcomeres; 2) evnen til at vurdere actin-myosin interaktioner uden potentielle konfunderende virkninger af beskadigede, tilstødende myofibrils (ved måling af kontraktilitet af enkelt muskelfibre ultrastrukturelle skader og forskydning af myofibrils kan bidrage til nedsat kontraktilitet) (Figur 1D); 3) den lille diameter myofibrils (~ 1 μm, figur 2A) og manglen på membraner giver mulighed for næsten øjeblikkelig calcium diffusion i sarcomeres. Desuden, hvis strukturelle skader er til stede i myofibrils, de sandsynligvis pause under deres isolation eller under forsøget. Derfor, vurdering myofibril kontraktilitet er en elegant metode til at studere de grundlæggende mekanismer i muskelsammentrækning og til at forstå, om forstyrret actin-myosin interaktioner er den primære årsag til muskelsygdom forårsaget af mutationer i sarkomiske proteiner.
Denne protokol præsenterer en nyudviklet opsætning til at bestemme kontraktilitet myofibrils indarbejde en cantilever kraft sonde med nano-Newton opløsning (dvs. Optiforce). Denne kraftsonde er baseret på princippet om interferometri. Interferometri muliggør brug af relativt stive cantilevers. Dette gør det muligt at måle kraft med lidt afbøjning af cantilever, nærmer isometriske sammentrækninger af myofibril. Sonden giver mulighed for vurdering af lav passive og aktive kræfter, der er produceret af en enkelt myofibril isoleret fra forskellige muskelbiopsier, herunder dem fra mennesker, med et højt signal-støj-forhold. Den optiske cantilever force sonde indarbejdet i denne opsætning er baseret på en Fabry-Pérot interferometer12. Interferometeret registrerer små forskydninger mellem en optisk fiber og en guldbelagt cantilever monteret på en ferrule (Figur 3). Kløften mellem den optiske fiber og cantilever kaldes Fabry-Pérot hulrum. Myofibrils er monteret mellem sonden og piezomotoren ved hjælp af to limbelagte glasmonteringsfibre. Den kraft, der produceres af myofibril, kan matematisk udledes af interferometerdataene. Interferometri er baseret på overlejring eller interferens af to eller flere bølger (i denne opsætning tre lysbølger). Laserlys med en bølgelængde mellem 1.528,77-1.563,85 nm udsendes fra interferometeret og sendes gennem den optiske fiber. I sonden reflekteres lyset 1) ved grænsefladen mellem den optiske fiber og mediet (Figur 3A); 2) på grænsefladen af mediet og cantilever (Figur 3B); og 3) på grænsefladen mellem metal og guld belægning af cantilever (Figur 3C). Refleksionen ved grænseflade A og B afhænger af brydningsindekset (n) for det medium, hvori sonden er nedsænket. Lyset, der består af de tre overlejrede refleksioner, vender tilbage til en fotodiode i interferometeret. Fotodioden måler lysets intensitet, hvilket er resultatet af interferensmønsteret af de tre overlejrede refleksioner. Når kontraktile kraft genereres ved at aktivere eller strække en myofibril, myofibril trækker på cantilever. Denne bevægelse ændrer hulrummets størrelse(d) og dermed antallet af bølgelængder, der passer ind i hulrummet. Lyset reflekteres ved cantilever vil have en anden fase, hvilket resulterer i et andet interferensmønster. Fotodioden registrerer denne ændring af interferensmønsterintensiteten som en ændring i Volts. Efterfølgende beregnes myofibril kraftgenerering ud fra denne ændring under hensyntagen til den cantilever stivhed. Kraftsonden kalibreres af fabrikanten ved at skubbe spidsen af monteringsnålen, der er fastgjort til den frie håndslut af cantilever, mod en vægtskala, samtidig med at udkrævningen af cantileveren er lig med et multiplum af bølgelængden på udlæsningslaseren13. Således interferometri er en meget følsom metode til at opdage små ændringer i afstand, giver mulighed for måling af kræfter med nano-Newton opløsning. Denne beslutning gør det muligt at vurdere myofibrillar kraftproduktion med et højt signal-støj-forhold. Mens traditionel interferometri begrænser måleområdet til den lineære del af interferenskurven, overvinder denne begrænsning ved hjælp af en indlåsningsforstærker og modulering af laserbølgelængden denne begrænsning14. Dette forklares mere detaljeret i diskussionsafsnittet.
For at måle myofibril aktiv spænding, en hurtig-trins perfusion system blev indarbejdet for at udsætte myofibril til calcium opløsninger (Figur 4A). Det hurtige perfusionssystem gør det muligt at foretage løsningsændringer inden for 10 ms. På grund af deres lille diameter, calcium diffusion i myofibrils er næsten øjeblikkelig. Derfor er dette system er særligt velegnet til måling af satserne for actin-myosin bindende under aktivering og frigivelse under afslapning. Aktiveringshastigheden (kACT)og afslapning (kREL)kan bestemmes ud fra aktiveringsafslapningskurverne. Også, ved at udsætte myofibrils til calcium opløsninger af stigende koncentration, kan kraft-calcium forholdet og calcium følsomhed bestemmes.
Desuden en piezo længde motor muliggør hurtig strækning og afkortning af myofibril. Dette giver mulighed for at studere de viskoelastiske egenskaber (dvs. passiv spænding) af myofibril, samt udføre en hurtig afkortning og restretch af myofibril at bestemme hastigheden af spænding sanering (kTR). De parametre, der hentes fra både aktive og passive spændingsforsøg, kan ændres ved genmutationer i et sarcomerisk protein.
Denne specialbyggede opsætning blev brugt til at måle de aktive og passive kontraktile egenskaber myofibrils isoleret fra sunde mennesker, patient, og mus skeletmuskulatur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio Spec Products, Inc.</td>
			<td>985370-XL</td>
			<td>To isolate myofibrils</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom coded</td>
			<td></td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Includes Labview program to control over serial connection; To control valves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Aluminum tissue chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To control the valves; Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td>MCS100</td>
			<td>To record sarcomere length</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Force probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Data registration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-200</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529265</td>
			<td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78471</td>
			<td>Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TE-63-1.0-1.3</td>
			<td>To cool the tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20736652</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20739263</td>
			<td>Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2441081</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>TG150-4</td>
			<td>To perfuse the tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 PC for IonWizard and 1 PC for other software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer

Nedstribede muskelceller er uundværlige for aktiviteten af mennesker og dyr. Enkelt muskelfibre består af myofibrils, som består af serielt forbundet sarcomeres, de mindste kontraktile enheder i muskler. Sarkomerisk dysfunktion bidrager til muskelsvaghed hos patienter med mutationer i gener, der kodning for sarkomeriske proteiner. Undersøgelsen af myofibril mekanik giver mulighed for vurdering af actin-myosin interaktioner uden potentielle forstyrrende virkninger af beskadigede, tilstødende myofibrils når man måler kontraktilitet af enkelt muskelfibre. Ultrastrukturelle skader og forskydning af myofibrils kan bidrage til nedsat kontraktilitet. Hvis strukturelle skader er til stede i myofibrils, de sandsynligvis pause under isolationsproceduren eller under forsøget. Desuden viser undersøgelser i myofibrils en vurdering af aktin-myosin interaktioner i overværelse af de geometriske begrænsninger af sarcomeres. For eksempel kan målinger i myofibrils belyse, om myofibrillar dysfunktion er den primære effekt af en mutation i et sarkomisk protein. Desuden perfusion med calcium opløsninger eller forbindelser er næsten øjeblikkeligt på grund af den lille diameter af myofibril. Dette gør myofibrils særdeles velegnet til at måle satserne for aktivering og afslapning under kraftproduktion. Den protokol, der er beskrevet i dette papir, anvender en optisk kraftsonde baseret på princippet om et Fabry-Pérot interferometer, der kan måle kræfter i nano-Newton-området, koblet til en piezo-længdemotor og et hurtigt perfusionssystem. Dette setup gør det muligt at studere myofibril mekanik med høj opløsning kraftmålinger.

Dataspor blev registreret og åbnet med systemcontrollersoftwaren (se Materialetabel). Komplette sporinger eller udvalgte segmenter blev eksporteret til Udklipsholder eller tekstfil til yderligere analyse med en ønsket software. Ventiler til at styre strømmen af de forskellige løsninger blev skiftet med brugerdefineret software eller manuelt. En brugerdefineret MATLAB script blev brugt til at analysere satserne for aktivering, spænding sanering, og afslapning. Den maksimale aktive kraft og toppen og ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer at JoVE.com

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Præsenteret her er en protokol til at vurdere kontraktile egenskaber af striated muskel myofibrils med nano-Newton opløsning. Protokollen anvender en opsætning med en interferometribaseret, optisk kraftsonde. Denne opsætning genererer data med et højt signal-støj-forhold og gør det muligt at vurdere myofibrils kontraktile kinetik.

Isolering myofibrils fra skeletmuskulatur biopsier og bestemmelse kontraktile funktion med en Nano-Newton resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Vurdering af kontraktile egenskaber myofibrils isoleret fra striated muskel kan bruges til at afgøre, om sarcomere dysfunktion er en primær årsag til muskelsvaghed på grund af mutationer i sarkomeriske proteiner. Denne teknik kan bruges til at erhverve data med et meget højt signal-støj-forhold med nanonewton opløsning. Denne protokol er også velegnet til at måle kontraktilitet i permeabiliserede kardiomyocytter.Husk, at krafttransduceren er meget skrøbelig. Så når du fjerner limen fra monteringsnålen, eller når du limer en myofibril, skal du have en rolig hånd, en masse øvelse og en masse tålmodighed. Før montering af vævet, placere en homogenisator stang i røret, der indeholder muskelvæv.Hold røret på is, drej rotoren i 15 sekunder på hastighed fem. Ved afslutningen af homogeniseringen overføres 50 mikroliter af den deraf følgende myofibrilaffussuspension og 250 mikroliter af afslappende opløsning til et poly-HEMA-belagt rutsjebane i et vævsbad. Dæk badet med et låg for at beskytte blandingen mod støv og vent 5 til 10 minutter for at tillade myofibrils at synke til bunden af dråben.Under forliset af myofibrils, varme Shellac en ethanol lim ved 65 grader Celsius i 30 til 60 sekunder, før du tilføjer omkring seks mikroliter lim på en ubestrøget glas dias. Dypper gentagne gange spidsen af hver monteringsnål i limen, indtil et lag lim er synligt. Brug derefter mikro-manipulatorer til at flytte sonden og piezo lodret for at gøre plads til vævsbadet på mikroskopet fase og fjerne glasdiaset, der indeholder limen.Efter montering af myofibrils, at måle sarcomere længde, flytte piezo og / eller kraft sonden til at indstille den oprindelige sarcomere længden af myofibril til 2,5 mikrometer. Brug fartøjets funktion af systemet controller software, måle myofibril længde og bredde. Brug mikroskopet fase til at placere myofibril i midten af videobilledet og strække et rektangel fra den ene side af myofibril til den anden, idet du skal passe på at medtage den mørke kant af lim dråber.Klik på start for at begynde at registrere dataene. Klik på pause efter fem sekunder. Længden vil være blevet registreret.For at måle bredden skal du rotere kameraet 90 grader for at se kontrasten af kanten af selve myofibril. Juster rektanglet, og klik på Start for at begynde at registrere dataene. Klik på pause efter fem sekunder.Bredden er blevet registreret. For at placere thetaglasset skal du bruge okularet og manipulatoren til forsigtigt at flytte thetaglasset mod myofibril. Juster den øverste kanal af theta glasset med myofibril og udføre en hurtig-trin for at kontrollere positionen.Tænd for baggrundsafslappende flow for at kontrollere theta glasjusteringen, og brug et Luer ventilhåndtag til at tænde for flowkammerets indstrømning. Derefter for at begynde at dræne flowkammeret og for at forhindre overløb af flowkammeret, skal du indstille udstrømningspumpeventilen til bad ventil to, mikro trin tilstand til mikro, stemplet målet til 48, 000, og stemplet hastighed til 38 til 40. For at måle hastigheden af spænding sanering, beregne piezo bevægelse er nødvendige for at slække myofibril med 15%og indtaste denne værdi i signalgeneratoren.Klik genoptage for at fortsætte med at registrere data og åbne ventiler en og seks for at starte strømmen af den afslappende løsning og de forskellige calcium koncentrationer gennem theta glas henholdsvis. Vælg nulstillingsområde på interferometeret for at nulstille interferometerets område, så baselinekraften er nul volt. Når kraftsporet er stabilt, skal du udføre thetaglasset hurtigt trin med en 100 mikrometertrinstørrelse.Når kraftplateauet er nået, skal du udføre afkortningsstrækningen med piezoen. En aktivering afslapning spor vil blive registreret. Klik på pause.Hvis du vil udføre en trinvis strækning, skal du klikke på start og nulstille interferometerets område, så grundkraften er nul volt. Udfør en trinvis strækning med signalgeneratoren. Når strækningen er færdig, skal du bruge piezo at forkorte myofibril til slap længde.Tryk derefter på pause og stop og gem dataene. Her, kraft spor af en aktiv kraft eksperiment med en myofibril isoleret fra sunde menneskelige quadriceps muskel er vist. Den myofibril blev aktiveret fem gange med opløsninger med varierende calcium koncentrationer, med en gennemsnitlig maksimal kraft af alle myofibrils på ca 123 millinewtons per kvadratcillimeter.Opførelsen af en kraft calcium koncentration kurve fra plateauet kræfter nået under hver aktivering i hver af de fem calcium kurver giver mulighed for beregning af calcium koncentration på 50% af den maksimale kraft produktion. Som illustreret i denne repræsentative analyse, myofibrils kan behandles med flere forbindelser i et enkelt eksperiment for at besvare yderligere spørgsmål om myofibril type. Den aktive kraft og sarcomere længde kan også måles for at tillade beregning af satserne for ombygning, aktivering og afslapning.Den stejle stigning vist i den prikkede røde boks er forårsaget af både viskositet og elasticitet. Plateauet ligner kun den elastiske komponent. Da viskositeten modstår belastningen lineært, faldt kraften, efter at stammen blev fjernet.Når du placerer thetaglasset, skal du sørge for at justere det korrekt med myofibril. Ellers kan aktiveringsløsningen komme ind mellem den optiske fiber og den udkrævning af kraftsonden, og dette medfører, at artefakter opstår i dine data. Også, myofibril kan ikke aktivere ordentligt.Denne metode til perfusion er også egnet til at bestemme muskel fiber type af myofibril. For eksempel, du kan først gennemgå myofibril med en normal calcium opløsning efterfulgt af perfusion af samme opløsning, men derefter tilføje en muskel fiber-type specifikke kraft-styrke sammensatte.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolering og dyrkning af individuelle myofibre og deres satellit celler fra voksne skeletmuskler

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Kraftmaalingen Under Sammentrækning at vurdere muskelfunktionen hos zebrafisk Larver

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolering af Intakt Mitokondrier fra Skeletal Muscle ved differentialcentrifugering for høj opløsning respirometri Målinger

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

Immunolabelling myofiber degeneration i muskelbiopsier

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolering og karakterisering af exosomer fra skeletmuskelfibroblaster

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Indsamling af skeletmuskulatur biopsier fra superior rum humane musculus Tibialis forreste til mekanisk evaluering

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...