Name: isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer
Uploaded: 2020-05-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer at JoVE.com

Ce projet a été financé par l’AFM-Téléthon et une fondation building strength for Nemaline Myopathies. Les auteurs souhaitent reconnaître le créateur des produits mentionnés dans cet article, IONOptix Inc.

Le protocole pour l’obtention de biopsies humaines a été approuvé par la commission d’examen institutionnel du Vu University Medical Center (#2014/396) et le consentement écrit en connaissance de cause a été obtenu à partir des sujets. Le protocole d’obtention de biopsies musculaires animales a été approuvé par le comité local d’éthique animale de l’Université VU (AVD114002016501)
1. Préparation et isolement myofibril
REMARQUE : Utilisez des m?...

<ol>
	<li>Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcomere+Dysfunction+in+Nemaline+Myopathy.">Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy.</a> J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).</li><li>Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+and+passive+forces+of+isolated+myofibrils+from+cardiac+and+fast+skeletal+muscle+of+the+frog.">Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog.</a> Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).</li><li>Kulke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+major+source+of+myofibrillar+stiffness+in+Drosophila+indirect+flight+muscle.">a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle.</a> Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).</li><li>Stehle, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isometric+force+kinetics+upon+rapid+activation+and+relaxation+of+mouse,+guinea+pig+and+human+heart+muscle+studied+on+the+subcellular+myofibrillar+level.">Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level.</a> Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).</li><li>Ribeiro, P. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+Effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Joureau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+sarcomere+contractility+contributes+to+muscle+weakness+in+ACTA1-related+nemaline+myopathy+(NEM3).">Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3).</a> Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).</li><li>de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+perfusion+shows+intersarcomere+dynamics+within+single+skeletal+muscle+myofibrils.">Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).</li><li>Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+force+enhancement+is+regulated+by+titin+in+skeletal+and+cardiac+myofibrils.">Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils.</a> Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).</li><li>Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+non-cross-bridge+forces+after+stretch+of+activated+striated+muscle+is+related+to+titin+isoforms.">The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).</li><li>Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+system+for+probing+cantilever+deflections+parallel+to+a+sample+surface.">Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface.</a> Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).</li><li>Chavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferrule-top+nanoindenter:+an+optomechanical+fiber+sensor+for+nanoindentation.">Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation.</a> Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).</li><li>Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metrological+approach+for+the+calibration+of+force+transducers+with+interferometric+readout.">A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout.</a> Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).</li><li>van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+dynamic+mechanical+analysis+for+heterogeneous+soft+matter+using+ferrule-top+indentation.">Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation.</a> Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KBTBD13+is+an+actin-binding+protein+that+modulates+muscle+kinetics.">KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2019).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-specific+effects+on+thin+filament+length+in+thin+filament+myopathy.">Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy.</a> Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).</li><li>Ottenheijm, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleting+exon+55+from+the+nebulin+gene+induces+severe+muscle+weakness+in+a+mouse+model+for+nemaline+myopathy.">Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy.</a> Brain. 136, 1718-1731 (2013).</li><li>Ribeiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+Myosin-II+Inhibitor+(N-benzyl-p-toluene+Sulphonamide,+BTS)+on+Contractile+Characteristics+of+Intact+Fast-twitch+Mammalian+Muscle+Fibres.">Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).</li><li>Stehle, R., Kr&#252;ger, M., Pfitzer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+kinetics+and+individual+sarcomere+dynamics+in+cardiac+myofibrils+after+rapid+Ca(2+)+changes.">Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes.</a> Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).</li><li>Najafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-diastolic+force+pre-activates+cardiomyocytes+and+determines+contractile+force:+role+of+titin+and+calcium.">End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium.</a> Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).</li></ol>

Décrit est un protocole pour évaluer la fonction contractile des myofibrils isolés des tissus humains ou animaux de muscle squelettique. La résolution de force de cette configuration a déjà été décrite par Chavan et al.12. En bref, il est déterminé par les fluctuations aléatoires de la longueur de la cavité Fabry-Pérot formée entre la fibre de détection et le porte-à-faux, qui produisent la partie dominante du bruit à la sortie de la lecture (exprimée en V) qui, multipliée par ...

Les cellules musculaires striées sont indispensables pour les activités de la vie quotidienne. Le mouvement des membres, la fonction respiratoire et le mouvement de pompage du cœur reposent sur la force générée par les cellules musculaires. Le muscle squelettique se compose de fascicles musculaires contenant des faisceaux de fibres musculaires simples (Figure 1A). Ces fibres musculaires sont composées de myofibrils, qui sont formés par des sarcomeres liés en série (Figure 1B,D). Les sarcomeres contiennent des filaments minces et épais. Celles-ci se composent principalement de chaînes de molécules d’actine et de myosine, respectivement (figure 1B). Les interactions Actin-myosine sont responsables de la capacité de génération de force du muscle. Les patients présentant des mutations dans les gènes encodage pour les protéines sarcomériques, telles que la nébuline, l’actine, et la troponine T, souffrent d’une faiblesse musculaire due au dysfonctionnement contractile1.
La qualité de la contractilité musculaire peut être étudiée à différents niveaux d’organisation, allant des muscles entiers in vivo aux interactions actin-myosine dans les tests de motilité in vitro. Au cours des dernières décennies, plusieurs groupes de recherche ont développé des configurations pour déterminer la contractilité des myofibrils individuels2,3,4,5,6,7,8,9,10. Ces configurations sont basées sur la détection des changements dans la déviation laser d’un porte-à-faux (c.-à-d. la déviation optique du faisceau) causés par la contraction du myofibril (pour plus de détails, voir Labuda et al.11). Bien que la détermination de la fonction contractile des myofibrils ait certaines limites (p. ex., la dynamique des processus de couplage excitation-contraction qui sont en amont des myofibrils font défaut), cette approche présente de multiples avantages. Il s’agit notamment de : 1) la capacité d’évaluer les interactions actin-myosine en présence des contraintes géométriques des sarcomeres; 2) la capacité d’évaluer les interactions actin-myosine sans effets confusionnels potentiels des myofibrils endommagés et adjacents (lors de la mesure de la contractilité des fibres musculaires simples dommages ultrastructuraux et le désalignement des myofibrils pourrait contribuer à une contractilité altérée) (Figure 1D); 3) le petit diamètre des myofibrils (~1 μm, figure 2A)et l’absence de membranes permettent une diffusion presque instantanée du calcium dans les sarcomeres. En outre, si des dommages structurels sont présents dans les myofibrils, ils se brisent probablement pendant leur isolement ou pendant l’expérience. Par conséquent, l’évaluation de la contractilité myofibril est une méthode élégante pour étudier les mécanismes de base de la contraction musculaire et de comprendre si les interactions perturbées actin-myosine sont la principale cause de la maladie musculaire causée par des mutations dans les protéines sarcomériques.
Ce protocole présente une configuration nouvellement développée pour déterminer la contractilité des myofibrils incorporant une sonde de force en porte-à-faux avec la résolution nano-Newton (c.-à-d. Optiforce). Cette sonde de force est basée sur le principe de l’interférométrie. L’interférométrie permet l’utilisation de cantilevers relativement rigides. Cela permet de mesurer la force avec peu de déviation du porte-à-faux, en approchant les contractions isométriques du myofibril. La sonde permet l’évaluation des forces passives et actives faibles qui sont produites par un seul myofibril isolé de différentes biopsies musculaires, y compris celles des sujets humains, avec un rapport signal/bruit élevé. La sonde de force de cantilever optique incorporée dans cette configuration est basée sur un interféromètre Fabry-Pérot12. L’interféromètre détecte de petits déplacements entre une fibre optique et un porte-à-faux recouvert d’or monté sur une ferrule (figure 3). L’écart entre la fibre optique et le porte-à-faux est appelé la cavité Fabry-Pérot. Myofibrils sont montés entre la sonde et le moteur piezo à l’aide de deux fibres de montage en verre enduit de colle. La force produite par le myofibril peut être mathématiquement dérivée des données de l’interféromètre. L’interférométrie est basée sur la superposition ou l’interférence de deux ondes ou plus (dans cette configuration trois ondes lumineuses). La lumière laser d’une longueur d’onde comprise entre 1 528,77–1 563,85 nm est émise par l’interféromètre et est envoyée par la fibre optique. Dans la sonde, la lumière est réfléchie 1) à l’interface entre la fibre optique et le milieu (Figure 3A); 2) à l’interface du milieu et du porte-à-faux (figure 3B); et 3) à l’interface entre le revêtement métallique et or du porte-à-faux (figure 3C). La réflexion à l’interface A et B dépend del’indicede réfraction ( n ) du milieu dans lequel la sonde est submergée. La lumière, composée des trois reflets superposés, revient à une photodiode dans l’interféromètre. La photodiode mesure l’intensité de la lumière, qui est le résultat du modèle d’interférence des trois réflexions superposées. Lorsque la force contractile est générée par l’activation ou l’étirement d’un myofibril, le myofibril tire sur le porte-à-faux. Ce mouvement modifie la taille de la cavité (d) et, par conséquent, le nombre de longueurs d’onde qui s’adaptent dans la cavité. La lumière réfléchie au porte-à-faux aura une phase différente, ce qui se traduira par un modèle d’interférence différent. La photodiode enregistre ce changement d’intensité du modèle d’interférence comme un changement dans volts. Par la suite, la génération de force de myofibril est calculée à partir de ce changement, en tenant compte de la rigidité du porte-à-faux. La sonde de force est calibrée par le fabricant en poussant la pointe de l’aiguille de montage, attachée à l’extrémité libre du porte-à-faux, contre une balance tout en gardant la flexion du porte-à-faux égale à un multiple de la longueur d’onde du laser de lecture13. Ainsi, l’interférométrie est une méthode très sensible pour détecter de petits changements de distance, permettant la mesure des forces avec la résolution nano-Newton. Cette résolution permet l’évaluation de la production de force myofibrillaire avec un rapport signal/bruit élevé. Alors que l’interférométrie traditionnelle limite la gamme de mesures à la partie linéaire de la courbe d’interférence, l’utilisation d’un amplificateur de verrouillage et la modulation de la longueur d’onde laser surmonte cette limitation14. Ceci est expliqué plus en détail dans la section de discussion.
Pour mesurer la tension active de myofibril, un système de perfusion à étapes rapides a été incorporé pour exposer le myofibril aux solutions de calcium (Figure 4A). Le système de perfusion à étapes rapides permet aux modifications de solution de se produire dans les 10 ms. En raison de leur petit diamètre, la diffusion du calcium dans les myofibrils est presque instantanée. Par conséquent, ce système est particulièrement approprié pour mesurer les taux de liaison actin-myosine pendant l’activation et la libération pendant la relaxation. Le taux d’activation (kACT)et de relaxation (kREL)peut être déterminé à partir des courbes d’activation-relaxation. En outre, en exposant les myofibrils aux solutions de calcium de concentration croissante, la relation force-calcium et la sensibilité de calcium peuvent être déterminées.
En outre, un moteur de longueur piezo permet l’étirement rapide et le raccourcissement du myofibril. Cela offre la possibilité d’étudier les propriétés viscoélastiques (c’est-à-dire la tension passive) du myofibril, ainsi que d’effectuer un raccourcissement rapide et le restretch du myofibril pour déterminer le taux de réaménagement de la tension (kTR). Les paramètres récupérés à la fois des expériences de tension active et passive peuvent être modifiés par des mutations génétiques dans une protéine sarcomérique.
Cette configuration sur mesure a été utilisée pour mesurer les caractéristiques contractiles actives et passives des myofibrils isolés du muscle squelettique humain, patient et de souris en bonne santé.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio Spec Products, Inc.</td>
			<td>985370-XL</td>
			<td>To isolate myofibrils</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom coded</td>
			<td></td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Includes Labview program to control over serial connection; To control valves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Aluminum tissue chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To control the valves; Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td>MCS100</td>
			<td>To record sarcomere length</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Force probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Data registration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-200</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529265</td>
			<td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78471</td>
			<td>Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TE-63-1.0-1.3</td>
			<td>To cool the tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20736652</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20739263</td>
			<td>Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2441081</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>TG150-4</td>
			<td>To perfuse the tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 PC for IonWizard and 1 PC for other software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer

Les cellules musculaires striées sont indispensables à l’activité des humains et des animaux. Les fibres musculaires simples sont composées de myofibrils, qui se composent de sarcomeres liés en série, les plus petites unités contractiles dans le muscle. Le dysfonctionnement sarcomérique contribue à la faiblesse musculaire chez les patients présentant des mutations dans les gènes encodage pour les protéines sarcomériques. L’étude de la mécanique du myofibril permet l’évaluation des interactions actin-myosine sans effets confusionnels potentiels des myofibrils endommagés et adjacents lors de la mesure de la contractilité des fibres musculaires simples. Les dommages ultrastructuraux et le désalignement des myofibrils pourraient contribuer à une contractilité altérée. Si des dommages structurels sont présents dans les myofibrils, ils se brisent probablement pendant la procédure d’isolement ou pendant l’expérience. En outre, les études sur les myofibrils fournissent l’évaluation des interactions actin-myosine en présence des contraintes géométriques des sarcomeres. Par exemple, les mesures dans les myofibrils peuvent élucider si le dysfonctionnement myofibrillaire est l’effet primaire d’une mutation dans une protéine sarcomérique. En outre, la perfusion avec des solutions de calcium ou des composés est presque instantanée en raison du petit diamètre du myofibril. Cela rend les myofibrils éminemment appropriés pour mesurer les taux d’activation et de relaxation pendant la production de force. Le protocole décrit dans cet article utilise une sonde de force optique basée sur le principe d’un interféromètre Fabry-Pérot capable de mesurer les forces de la gamme nano-Newton, couplée à un moteur de longueur piézo et à un système de perfusion à pas rapide. Cette configuration permet l’étude de la mécanique myofibril avec des mesures de force à haute résolution.

Les traces de données ont été enregistrées et ouvertes avec le logiciel de contrôleur système (voir tableau des matériaux). Des traces complètes ou des segments sélectionnés ont été exportés vers le presse-papiers ou le fichier texte pour une analyse plus approfondie avec un logiciel souhaité. Les valves pour contrôler le flux des différentes solutions ont été commutées avec un logiciel personnalisé ou manuellement. Un script MATLAB personnalisé a été utilisé pour analyser les tau...

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Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Présenté ici est un protocole pour évaluer les propriétés contractiles des myofibrils musculaires striés avec la résolution nano-Newton. Le protocole utilise une configuration avec une sonde de force optique basée sur l’interférométrie. Cette configuration génère des données avec un rapport signal/bruit élevé et permet d’évaluer la cinétique contractile des myofibrils.

Isoler les myofibrils des biopsies des muscles squelettiques et déterminer la fonction contractile avec un transducteur de force de résolution nano-newton

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

L’évaluation des propriétés contractiles des myofibriles isolées du muscle strié peut être utilisée pour déterminer si le dysfonctionnement du sarcomere est une cause principale de faiblesse musculaire due à des mutations dans les protéines sarcomeriques. Cette technique peut être utilisée pour acquérir des données avec un rapport signal-bruit très élevé avec résolution nanonewton. Ce protocole est également approprié pour mesurer la contractilité dans les cardiomyocytes permeabilized.Gardez à l’esprit que le transducteur de force est très fragile. Donc, lors de l’enlèvement de la colle de l’aiguille de montage ou lors du collage d’un myofibril, vous devez avoir une main ferme, beaucoup de pratique, et beaucoup de patience. Avant de monter le tissu, placez une tige homogénéisante dans le tube contenant le tissu musculaire.En gardant le tube sur la glace, faites tourner le rotor pendant 15 secondes à la vitesse 5. À la fin de l’homogénéisation, transférer 50 microlitres de la suspension myofibrile résultante et 250 microlitres de solution relaxante sur une lame recouverte de poly-HEMA dans un bain de tissu. Couvrir le bain d’un couvercle pour protéger le mélange de la poussière et attendre 5 à 10 minutes pour permettre aux myofibriles de couler au fond de la goutte.Pendant le naufrage des myofibriles, chauffer shellac une colle à l’éthanol à 65 degrés Celsius pendant 30 à 60 secondes avant d’ajouter environ six microlitres de colle sur une toboggan en verre non cintré. Tremper à plusieurs reprises la pointe de chaque aiguille montante dans la colle jusqu’à ce qu’une couche de colle soit visible. Ensuite, utilisez des micro-manipulateurs pour déplacer la sonde et piezo verticalement pour faire de la place pour le bain de tissu sur le stade du microscope et enlever la glissière en verre contenant la colle.Après avoir monté les myofibriles, pour mesurer la longueur du sarcomere, déplacez le piezo et/ou la sonde de force pour régler la longueur initiale du sarcome du myofibril à 2,5 micromètres. À l’aide de la fonction de navire du logiciel de contrôleur système, mesurez la longueur et la largeur du myofibril. Utilisez l’étape du microscope pour positionner le myofibril au centre de l’image vidéo et étirer un rectangle d’un côté du myofibril à l’autre, en prenant soin d’inclure le bord sombre des gouttelettes de colle.Pour commencer à enregistrer les données, cliquez sur démarrer. Après cinq secondes, cliquez sur pause. La longueur aura été enregistrée.Pour mesurer la largeur, faites pivoter la caméra à 90 degrés pour voir le contraste du bord du myofibril lui-même. Ajustez le rectangle et cliquez sur démarrer pour commencer à enregistrer les données. Après cinq secondes, cliquez sur pause.La largeur aura été enregistrée. Pour positionner le verre theta, utilisez l’oculaire et le manipulateur pour déplacer soigneusement le verre theta vers le myofibril. Alignez le canal supérieur du verre theta avec le myofibril et effectuez une étape rapide pour vérifier la position.Allumez le flux relaxant de fond pour vérifier l’alignement du verre theta et utilisez un levier de valve Luer pour activer l’afflux de la chambre d’écoulement. Ensuite, pour commencer à vider la chambre d’écoulement et pour éviter le débordement de la chambre d’écoulement, réglez la soupape de pompe de sortie à la valve de bain deux, le mode micro-étape au micro, la cible de piston à 48.000, et la vitesse de piston à 38 à 40. Pour mesurer le taux de réaménagement des tensions, calculer le mouvement piezo nécessaire pour relâcher le myofibril de 15% et entrer cette valeur dans le générateur de signal.Cliquez sur cv pour continuer à enregistrer les données et ouvrir les valves un et six pour commencer les flux de la solution relaxante et les différentes concentrations de calcium à travers le verre theta respectivement. Sélectionnez la plage de réinitialisation sur l’interféromètre pour réinitialiser la portée de l’interféromètre de sorte que la force de base est de zéro volts. Lorsque la trace de force est stable, effectuez l’étape rapide du verre theta avec une taille d’étape de 100 micromètres.Lorsque le plateau de force est atteint, effectuer le raccourcissement re-étirer avec le piezo. Une trace de relaxation d’activation sera enregistrée. Cliquez sur pause.Pour effectuer un étirement étape-sage, cliquez sur démarrer et réinitialiser la portée de l’interféromètre de sorte que la force de base est zéro volts. Effectuez un étirement étape-sage avec le générateur de signal. Lorsque l’étirement est terminé, utilisez le piezo pour raccourcir le myofibril à la longueur de mou.Appuyez ensuite sur pause et arrêtez-vous et enregistrez les données. Ici, des traces de force d’une expérience de force active avec un myofibril isolé du muscle humain sain de quadriceps sont montrées. Le myofibril a été activé cinq fois avec des solutions avec des concentrations variables de calcium, avec une force maximale moyenne de tous les myofibrils d’environ 123 millinewtons par millimètre carré.La construction d’une courbe de concentration de calcium de force à partir des forces du plateau atteinte lors de chaque activation dans chacune des cinq courbes de calcium permet de calcul de la concentration de calcium à 50% de la production de force maximale. Comme illustré dans cette analyse représentative, les myofibrils peuvent être traités avec des composés multiples dans une seule expérience pour répondre à des questions supplémentaires sur le type myofibril. La force active et la longueur du sarcome peuvent également être mesurées pour permettre le calcul des taux de réaménagement, d’activation et de relaxation.La forte élévation indiquée dans la boîte rouge pointillée est causée à la fois par la viscosité et l’élasticité. Le plateau ne ressemble qu’à la composante élastique. Comme la viscosité résiste à la tension linéairement, la force a chuté après que la souche a été enlevée.Lorsque vous positionnez le verre theta, assurez-vous de l’aligner correctement avec le myofibril. Dans le cas contraire, la solution d’activation pourrait se trouver entre la fibre optique et le porte-à-faux de la sonde de force, ce qui provoque des artefacts dans vos données. En outre, le myofibril peut ne pas s’activer correctement.Cette méthode de perfusion est également appropriée pour déterminer le type de fibre musculaire du myofibril. Par exemple, vous pouvez d’abord parcourir le myofibril avec une solution normale de calcium suivie de la perfusion de cette même solution, puis ajouter un composé spécifique de type fibre musculaire améliorant la force.

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