Name: isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer
Uploaded: 2020-05-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer at JoVE.com

Dieses Projekt wurde von AFM-Telethon und A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies finanziert. Die Autoren möchten den Schöpfer der in diesem Artikel genannten Produkte, IONOptix Inc.

Das Protokoll zur Erlangung menschlicher Biopsien wurde vom institutionellen Prüfungsausschuss des VU University Medical Center (#2014/396) genehmigt und die schriftliche Zustimmung der Probanden in Kenntnis der Sachlage eingeholt. Das Protokoll zur Gewinnung von Tiermuskelbiopsien wurde von der lokalen Tierethikkommission der VU-Universität (AVD114002016501) genehmigt.
1. Vorbereitung und myofibril Isolation
HINWEIS: Verwenden Sie zuvor beschriebene Methoden, um Bi...

<ol>
	<li>Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcomere+Dysfunction+in+Nemaline+Myopathy.">Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy.</a> J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).</li><li>Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+and+passive+forces+of+isolated+myofibrils+from+cardiac+and+fast+skeletal+muscle+of+the+frog.">Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog.</a> Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).</li><li>Kulke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+major+source+of+myofibrillar+stiffness+in+Drosophila+indirect+flight+muscle.">a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle.</a> Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).</li><li>Stehle, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isometric+force+kinetics+upon+rapid+activation+and+relaxation+of+mouse,+guinea+pig+and+human+heart+muscle+studied+on+the+subcellular+myofibrillar+level.">Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level.</a> Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).</li><li>Ribeiro, P. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+Effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Joureau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+sarcomere+contractility+contributes+to+muscle+weakness+in+ACTA1-related+nemaline+myopathy+(NEM3).">Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3).</a> Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).</li><li>de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+perfusion+shows+intersarcomere+dynamics+within+single+skeletal+muscle+myofibrils.">Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).</li><li>Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+force+enhancement+is+regulated+by+titin+in+skeletal+and+cardiac+myofibrils.">Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils.</a> Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).</li><li>Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+non-cross-bridge+forces+after+stretch+of+activated+striated+muscle+is+related+to+titin+isoforms.">The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).</li><li>Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+system+for+probing+cantilever+deflections+parallel+to+a+sample+surface.">Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface.</a> Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).</li><li>Chavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferrule-top+nanoindenter:+an+optomechanical+fiber+sensor+for+nanoindentation.">Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation.</a> Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).</li><li>Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metrological+approach+for+the+calibration+of+force+transducers+with+interferometric+readout.">A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout.</a> Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).</li><li>van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+dynamic+mechanical+analysis+for+heterogeneous+soft+matter+using+ferrule-top+indentation.">Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation.</a> Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KBTBD13+is+an+actin-binding+protein+that+modulates+muscle+kinetics.">KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2019).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-specific+effects+on+thin+filament+length+in+thin+filament+myopathy.">Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy.</a> Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).</li><li>Ottenheijm, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleting+exon+55+from+the+nebulin+gene+induces+severe+muscle+weakness+in+a+mouse+model+for+nemaline+myopathy.">Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy.</a> Brain. 136, 1718-1731 (2013).</li><li>Ribeiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+Myosin-II+Inhibitor+(N-benzyl-p-toluene+Sulphonamide,+BTS)+on+Contractile+Characteristics+of+Intact+Fast-twitch+Mammalian+Muscle+Fibres.">Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).</li><li>Stehle, R., Kr&#252;ger, M., Pfitzer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+kinetics+and+individual+sarcomere+dynamics+in+cardiac+myofibrils+after+rapid+Ca(2+)+changes.">Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes.</a> Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).</li><li>Najafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-diastolic+force+pre-activates+cardiomyocytes+and+determines+contractile+force:+role+of+titin+and+calcium.">End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium.</a> Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).</li></ol>

Beschrieben ist ein Protokoll zur Beurteilung der kontraktilen Funktion von Myofibrils, die aus menschlichen oder tierischen Skelettmuskelgeweben isoliert sind. Die Kraftauflösung dieses Setups wurde bereits von Chavan et al.12beschrieben. Kurz gesagt, wird durch die zufälligen Schwankungen der Länge der Fabry-Pérot-Kavität zwischen der Detektionsfaser und dem Ausleger gebildet, die den dominanten Teil des Rauschens am Ausgang der Auslese erzeugen (ausgedrückt in V), die, multipliziert mit d...

Gestreifte Muskelzellen sind für den Alltag unverzichtbar. Die Bewegung der Gliedmaßen, die Atemfunktion und die Pumpbewegung des Herzens verlassen sich auf die Kraft, die von Muskelzellen erzeugt wird. Skelettmuskel besteht aus Muskelfascicles, die Bündel von einzelnen Muskelfasern enthalten (Abbildung 1A). Diese Muskelfasern bestehen aus Myofibrillen, die durch seriell verknüpfte Sarkome gebildet werden (Abbildung 1B,D). Die Sarkome enthalten dünne und dicke Filamente. Diese bestehen in erster Linie aus Ketten von Aktin- bzw. Myosinmolekülen (Abbildung 1B). Actin-Myosin-Wechselwirkungen sind verantwortlich für die krafterzeugende Kapazität der Muskeln. Patienten mit Mutationen in Genen, die für sarmere Proteine wie Nebulin, Actin und Troponin T kodieren, leiden an Muskelschwäche aufgrund kontraktiler Dysfunktion1.
Die Qualität der Muskelkontraktilität kann auf verschiedenen Ebenen der Organisation untersucht werden, von in vivo ganze Muskeln zu Actin-Myosin-Wechselwirkungen in In-vitro-Motilität assays. In den letzten Jahrzehnten haben mehrere Forschungsgruppen Setups entwickelt, um die Kontraktilität einzelner Myofibrils2,3,4,5,6,7,8,9,,10zu bestimmen. Diese Setups basieren auf der Detektion von Veränderungen der Laserablenkung durch einen Ausleger (d.h. optische Strahlverformung), die durch die Kontraktion des Myofibrils verursacht wird (Details siehe Labuda et al.11). Obwohl die Bestimmung der kontraktilen Funktion von Myofibrils einige Einschränkungen aufweist (z.B. fehlt die Dynamik der Anregungs-Kontraktions-Kopplungsprozesse, die vor den Myofibrils liegen), gibt es mehrere Vorteile für diesen Ansatz. Dazu gehören: 1) die Fähigkeit, Actin-Myosin-Wechselwirkungen in Gegenwart der geometrischen Abhängigkeiten der Sarkome zu bewerten; 2) die Fähigkeit, Actin-Myosin-Wechselwirkungen ohne mögliche verwirrende Auswirkungen von beschädigten, benachbarten Myofibrils zu bewerten (bei der Messung der Kontraktilität von einzelnen Muskelfasern ultrastrukturelle Schäden und Fehlausrichtung von Myofibrils könnte zu einer beeinträchtigten Kontraktilität beitragen) (Abbildung 1D); 3) der kleine Durchmesser von Myofibrils (1 m, Abbildung 2A) und der Mangel an Membranen ermöglichen eine fast sofortige Calciumdiffusion in die Sarkome. Wenn strukturelle Schäden in den Myofibrils vorhanden sind, brechen sie wahrscheinlich während ihrer Isolation oder während des Experiments. Daher ist die Beurteilung der myofibrilKontraktilität eine elegante Methode, um die grundlegenden Mechanismen der Muskelkontraktion zu studieren und zu verstehen, ob gestörte Actin-Myosin-Wechselwirkungen die primäre Ursache für Muskelerkrankungen sind, die durch Mutationen in sarkomerischen Proteinen verursacht werden.
Dieses Protokoll stellt ein neu entwickeltes Setup dar, um die Kontraktilität von Myofibrils zu bestimmen, die eine Freischwinger-Kraftsonde mit Nano-Newton-Auflösung (d. h. Optiforce) enthalten. Diese Kraftsonde basiert auf dem Prinzip der Interferometrie. Die Interferometrie ermöglicht die Verwendung relativ steifer Ausleger. Dies macht es möglich, Kraft mit wenig Ablenkung des Auslegers zu messen, nähern sich isometrischen Kontraktionen des Myofibrils. Die Sonde ermöglicht die Beurteilung niedriger passiver und aktiver Kräfte, die von einem einzelnen Myofibril erzeugt werden, das aus verschiedenen Muskelbiopsien, einschließlich von Menschen, mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis isoliert wird. Die in diesem Setup integrierte optische Auslegerkraftsonde basiert auf einem Fabry-Pérot Interferometer12. Das Interferometer erkennt kleine Verschiebungen zwischen einer Glasfaser und einem goldbeschichteten Ausleger, der auf einer Ferrule montiert ist (Abbildung 3). Der Spalt zwischen der Glasfaser und dem Ausleger wird Fabry-Pérot Hohlraum genannt. Myofibrils werden zwischen Sonde und Piezomotor mit zwei leimbeschichteten Glasfasern montiert. Die vom Myofibril erzeugte Kraft kann mathematisch aus den Interferometerdaten abgeleitet werden. Die Interferometrie basiert auf der Überlagerung oder Interferenz von zwei oder mehr Wellen (in diesem Setup drei Lichtwellen). Laserlicht mit einer Wellenlänge zwischen 1.528,77–1.563,85 nm wird vom Interferometer emittiert und durch die Optische Faser gesendet. In der Sonde wird das Licht 1) an der Schnittstelle zwischen der Optischen Faser und dem Medium reflektiert (Abbildung 3A); 2) an der Schnittstelle des Mediums und des Auslegers (Abbildung 3B); und 3) an der Schnittstelle zwischen der Metall- und Goldbeschichtung des Auslegers (Abbildung 3C). Die Reflexion an den Schnittstellen A und B ist abhängig vom Brechungsindex (n) des Mediums, in das die Sonde eingetaucht ist. Das Licht, bestehend aus den drei überlagerten Reflexionen, kehrt zu einer Photodiode im Interferometer zurück. Die Photodiode misst die Intensität des Lichts, die das Ergebnis des Interferenzmusters der drei überlagerten Reflexionen ist. Wenn kontraktile Kraft durch Aktivieren oder Dehnen eines Myofibril erzeugt wird, zieht das Myofibril auf den Ausleger. Diese Bewegung ändert die Hohlraumgröße(d) und damit die Anzahl der Wellenlängen, die in den Hohlraum passen. Das licht reflektiert am Ausleger hat eine andere Phase, was zu einem anderen Interferenzmuster führt. Die Photodiode zeichnet diese Änderung der Interferenzmusterintensität als Eine Änderung der Volt auf. Anschließend wird aus dieser Änderung die Myofibril-Krafterzeugung unter Berücksichtigung der Auslegersteifigkeit berechnet. Die Kraftsonde wird vom Hersteller kalibriert, indem die Spitze der Montagenadel, die am freien Handende des Auslegers befestigt ist, gegen eine Waage gedrückt wird, während die Biegung des Auslegers einem Vielfachen der Wellenlänge des Ausleselasers13entspricht. Daher ist die Interferometrie eine hochempfindliche Methode, um kleine Entfernungsänderungen zu erkennen, die eine Messung von Kräften mit Nano-Newton-Auflösung ermöglichen. Diese Auflösung ermöglicht die Beurteilung der myofibrillaren Kraftproduktion mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Während die traditionelle Interferometrie den Messbereich auf den linearen Teil der Interferenzkurve begrenzt, überwindet die Verwendung eines Einsperrverstärkers und die Modulation der Laserwellenlänge diese Einschränkung14. Dies wird im Diskussionsteil ausführlicher erläutert.
Um die myofibril aktive Spannung zu messen, wurde ein schnelles Perfusionssystem eingebaut, um das Myofibril Calciumlösungen auszusetzen (Abbildung 4A). Das schnelle Perfusionssystem ermöglicht Lösungsänderungen innerhalb von 10 ms. Aufgrund ihres geringen Durchmessers ist die Kalziumdiffusion in die Myofibrils fast augenblicklich. Daher eignet sich dieses System besonders zur Messung der Aktin-Myosin-Bindungsraten während der Aktivierung und Freisetzung während der Entspannung. Die Aktivierungsrate (kACT) und Entspannung (kREL) kann aus den Aktivierungs-Entspannungskurven bestimmt werden. Auch durch die Exposition der Myofibrils gegenüber Kalziumlösungen mit steigender Konzentration kann die Kraft-Calcium-Beziehung und Kalziumempfindlichkeit bestimmt werden.
Darüber hinaus ermöglicht ein Piezolängenmotor eine schnelle Dehnung und Verkürzung des Myofibrils. Dies bietet die Möglichkeit, die viskoelastischen Eigenschaften (d.h. passive Spannung) des Myofibrils zu untersuchen, sowie eine schnelle Verkürzung und Redehnung des Myofibrils durchzuführen, um die Spannungsrate der Neuentwicklung (kTR) zu bestimmen. Die Parameter, die sowohl aus aktiven als auch aus passiven Spannungsexperimenten gewonnen werden, können durch Genmutationen in einem sarkomischen Protein verändert werden.
Diese maßgeschneiderte Einrichtung wurde verwendet, um die aktiven und passiven kontraktilen Eigenschaften von Myofibrils zu messen, die aus gesunden menschlichen, geduldigen und Mausskelettmuskeln isoliert sind.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio Spec Products, Inc.</td>
			<td>985370-XL</td>
			<td>To isolate myofibrils</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom coded</td>
			<td></td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Includes Labview program to control over serial connection; To control valves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Aluminum tissue chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To control the valves; Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td>MCS100</td>
			<td>To record sarcomere length</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Force probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Data registration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-200</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529265</td>
			<td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78471</td>
			<td>Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TE-63-1.0-1.3</td>
			<td>To cool the tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20736652</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20739263</td>
			<td>Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2441081</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>TG150-4</td>
			<td>To perfuse the tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 PC for IonWizard and 1 PC for other software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer

Gestreifte Muskelzellen sind für die Aktivität von Mensch und Tier unverzichtbar. Einzelne Muskelfasern bestehen aus Myofibrillen, die aus seriell verbundenen Sarkomen bestehen, den kleinsten kontraktilen Einheiten im Muskel. Sarkomische Dysfunktion trägt zur Muskelschwäche bei Patienten mit Mutationen in Genen bei, die für sarkomerische Proteine kodieren. Die Untersuchung der Myofibril-Mechanik ermöglicht die Beurteilung von Actin-Myosin-Wechselwirkungen ohne mögliche verwirrende Auswirkungen von beschädigten, benachbarten Myofibrils bei der Messung der Kontraktilität einzelner Muskelfasern. Ultrastrukturelle Schäden und Fehlausrichtung von Myofibrils können zu einer beeinträchtigungen Kontraktilität beitragen. Wenn strukturelle Schäden in den Myofibrils vorhanden sind, brechen sie wahrscheinlich während des Isolationsverfahrens oder während des Experiments. Darüber hinaus liefern Studien an Myofibrils die Beurteilung von Actin-Myosin-Wechselwirkungen in Gegenwart der geometrischen Zwänge der Sarkome. Beispielsweise können Messungen in Myofibrils klären, ob myofibrillare Dysfunktion die primäre Wirkung einer Mutation in einem sarkomischen Protein ist. Darüber hinaus ist die Perfusion mit Calciumlösungen oder Verbindungen aufgrund des geringen Durchmessers des Myofibrils fast sofort. Dies macht myofibrils hervorragend geeignet, um die Aktivierungs- und Entspannungsraten während der Kraftproduktion zu messen. Das in diesem Papier beschriebene Protokoll verwendet eine optische Kraftsonde, die auf dem Prinzip eines Fabry-Pérot-Interferometers basiert, das kräfte im Nano-Newton-Bereich messen kann, gekoppelt an einen Piezolängenmotor und ein Schnellschritt-Perfusionssystem. Dieses Setup ermöglicht das Studium der myofibril Mechanik mit hochauflösenden Kraftmessungen.

Datenablaufverfolgungen wurden aufgezeichnet und mit der Systemcontroller-Software geöffnet (siehe Tabelle der Materialien). Vollständige Ablaufverfolgungen oder ausgewählte Segmente wurden zur weiteren Analyse mit einer gewünschten Software in die Zwischenablage oder Textdatei exportiert. Ventile zur Steuerung des Durchflusses der verschiedenen Lösungen wurden mit kundenspezifischer Software oder manuell geschaltet. Ein benutzerdefiniertes MATLAB-Skript wurde verwendet, um die Aktivierungs-, Spannu...

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Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Hier wird ein Protokoll zur Bewertung der kontraktilen Eigenschaften von gestreiften Muskelmyofibrils mit Nano-Newton-Auflösung vorgestellt. Das Protokoll verwendet ein Setup mit einer Interferometrie-basierten optischen Kraftsonde. Dieses Setup erzeugt Daten mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis und ermöglicht die Beurteilung der kontraktilen Kinetik von Myofibrils.

Isolieren von Myofibrils von Skelettmuskelbiopsien und Bestimmung der Kontraktilenfunktion mit einem Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Die Beurteilung der kontraktilen Eigenschaften von Myofibrils, die aus gestreiftem Muskel isoliert sind, kann verwendet werden, um festzustellen, ob Sarkome dysfunktion eine primäre Ursache für Muskelschwäche aufgrund von Mutationen in sarkomischen Proteinen ist. Diese Technik kann verwendet werden, um Daten mit einem sehr hohen Signal-Rausch-Verhältnis mit Nanonewton-Auflösung zu erfassen. Dieses Protokoll ist auch geeignet, kontraktilität in permeabilisierten Kardiomyozyten zu messen.Denken Sie daran, dass der Kraftaufnehmer sehr zerbrechlich ist. Also, wenn Sie den Kleber von der Montagenadel entfernen oder beim Kleben eines Myofibrils, müssen Sie eine ruhige Hand, viel Übung und viel Geduld haben. Vor der Montage des Gewebes eine Homogenisatorstange in das Rohr legen, das das Muskelgewebe enthält.Halten Sie die Röhre auf Eis, drehen Sie den Rotor für 15 Sekunden auf Geschwindigkeit fünf. Am Ende der Homogenisierung 50 Mikroliter der resultierenden Myofibrilsuspension und 250 Mikroliter Entspannungslösung auf einen poly-HEMA beschichteten Schlitten in einem Gewebebad übertragen. Bedecken Sie das Bad mit einem Deckel, um die Mischung vor Staub zu schützen und warten Sie 5 bis 10 Minuten, damit die Myofibrils auf den Boden des Tropfens sinken.Während des Untergangs der Myofibrils, erhitzen Shellac einen Ethanolkleber bei 65 Grad Celsius für 30 bis 60 Sekunden, bevor Sie etwa sechs Mikroliter Kleber auf einen unbeschichteten Glasschlitten geben. Tauchen Sie die Spitze jeder Montagenadel wiederholt in den Kleber, bis eine Leimschicht sichtbar ist. Dann verwenden Sie Mikromanipulatoren, um die Sonde und Piezo vertikal zu bewegen, um Platz für das Gewebebad auf der Mikroskopbühne zu schaffen und den Glasschlitten mit dem Kleber zu entfernen.Nach der Montage der Myofibrils, um die Sarkomelänge zu messen, bewegen Sie die Piezo- und/oder Kraftsonde, um die anfängliche Sarkome-Länge des Myofibrils auf 2,5 Mikrometer einzustellen. Messen Sie mit der Gefäßfunktion der Systemsteuerungssoftware die Myofibril-Länge und -Breite. Verwenden Sie die Mikroskopstufe, um das Myofibril in der Mitte des Videobildes zu positionieren und ein Rechteck von einer Seite des Myofibrils auf die andere zu strecken, wobei darauf geachtet wird, den dunklen Rand der Leimtröpfchen einzubeziehen.Um mit der Aufzeichnung der Daten zu beginnen, klicken Sie auf Start. Klicken Sie nach fünf Sekunden auf Pause. Die Länge wurde aufgezeichnet.Um die Breite zu messen, drehen Sie die Kamera um 90 Grad, um den Kontrast der Kante des Myofibrils selbst anzuzeigen. Passen Sie das Rechteck an, und klicken Sie auf Start, um mit der Aufzeichnung der Daten zu beginnen. Klicken Sie nach fünf Sekunden auf Pause.Die Breite wurde aufgezeichnet. Um das Thetaglas zu positionieren, verwenden Sie das Okular und den Manipulator, um das Thetaglas vorsichtig in Richtung des Myofibrils zu bewegen. Richten Sie den oberen Kanal des Thetaglases mit dem Myofibril aus und führen Sie einen schnellen Schritt aus, um die Position zu überprüfen.Schalten Sie den Hintergrund entspannenden Fluss ein, um die Thetaglasausrichtung zu überprüfen, und verwenden Sie einen Luer-Ventilhebel, um den Zufluss der Durchflusskammer einzuschalten. Um dann mit dem Entleeren der Durchflusskammer zu beginnen und ein Überlaufen der Durchflusskammer zu verhindern, stellen Sie das Abflusspumpenventil auf Badventil zwei, den Mikroschrittmodus auf Mikro, das Kolbenziel auf 48 000 und die Kolbendrehzahl auf 38 bis 40. Um die Geschwindigkeit der Spannungssanierung zu messen, berechnen Sie die Piezobewegung, die notwendig ist, um das Myofibril um 15% zu lockern, und geben Sie diesen Wert in den Signalgenerator ein.Klicken Sie auf "Fortsetzen", um die Aufzeichnung der Daten fortzusetzen, und öffnen Sie die Ventile eins und sechs, um die Ströme der Entspannungslösung und die verschiedenen Kalziumkonzentrationen durch das Thetaglas zu starten. Wählen Sie den Reset-Bereich auf dem Interferometer aus, um den Bereich des Interferometers so zurückzusetzen, dass die Ausgangskraft Null Volt beträgt. Wenn die Kraftspur stabil ist, führen Sie das Thetaglas mit einer Schrittgröße von 100 Mikrometern schnell aus.Wenn das Kraftplateau erreicht ist, führen Sie die Verkürzung re-Stretch mit dem Piezo. Eine Aktivierungsentspannungsspur wird aufgezeichnet. Klicken Sie auf Pause.Um eine schrittweise Dehnung durchzuführen, klicken Sie auf Starten und Setzen Sie den Bereich des Interferometers zurück, sodass die Grundkraft Null Volt beträgt. Führen Sie eine schrittweise Dehnung mit dem Signalgenerator durch. Wenn die Strecke fertig ist, verwenden Sie den Piezo, um das Myofibril auf die Lockerlänge zu verkürzen.Drücken Sie dann pause und stoppen und speichern Sie die Daten. Hier werden Kraftspuren eines aktiven Kraftexperiments mit einem Myofibril gezeigt, das aus einem gesunden menschlichen Quadrizepsmuskel isoliert ist. Das Myofibril wurde fünfmal mit Lösungen mit unterschiedlichen Calciumkonzentrationen aktiviert, mit einer durchschnittlichen maximalen Kraft aller Myofibrils von etwa 123 Millinewton pro Quadratmillimeter.Die Konstruktion einer Kraftkalziumkonzentrationskurve aus den Plateaukräften, die bei jeder Aktivierung in jeder der fünf Calciumkurven erreicht werden, ermöglicht die Berechnung der Calciumkonzentration bei 50% der maximalen Kraftproduktion. Wie in dieser repräsentativen Analyse dargestellt, können die Myofibrillen in einem einzigen Experiment mit mehreren Verbindungen behandelt werden, um zusätzliche Fragen zum Myofibril-Typ zu beantworten. Die aktive Kraft und Sarcomere-Länge kann auch gemessen werden, um die Berechnung der Raten der Sanierung, Aktivierung und Entspannung zu ermöglichen.Der steile Anstieg, der in der gepunkteten roten Box dargestellt wird, wird sowohl durch Viskosität als auch durch Elastizität verursacht. Das Plateau ähnelt nur der elastischen Komponente. Da die Viskosität der Dehnung linear widersteht, fiel die Kraft ab, nachdem die Dehnung entfernt wurde.Achten Sie bei der Positionierung des Thetaglases darauf, dass Sie es richtig mit dem Myofibril ausrichten. Andernfalls kann die aktivierende Lösung zwischen der Glasfaser und dem Ausleger der Kraftsonde liegen, und dies bewirkt, dass Artefakte in Ihren Daten auftreten. Auch kann das Myofibril nicht richtig aktivieren.Diese Methode der Perfusion ist auch geeignet, um den Muskelfasertyp des Myofibrils zu bestimmen. Zum Beispiel können Sie zuerst das Myofibril mit einer normalen Kalziumlösung gefolgt von perfusion der gleichen Lösung durchdringen, dann aber eine Muskelfaser-spezifische kraftsteigernde Verbindung hinzufügen.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Forschung

Biologie

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Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

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