Name: isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer
Uploaded: 2020-05-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer at JoVE.com

פרויקט זה מומן על ידי AFM-Telethon וקרן בניין כוח עבור מיופתיה Nemaline. המחברים רוצים להכיר את היוצר של המוצרים המוזכרים במאמר זה, IONOptix Inc.

הפרוטוקול לקבלת ביופסיות אנושיות אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית במרכז הרפואי של אוניברסיטת VU (#2014/396) והתקבלה הסכמה מדעת בכתב מהנבדקים. הפרוטוקול לקבלת ביופסיות שריר בעלי חיים אושר על ידי הוועדה המקומית לאתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת VU (AVD114002016501)
1. הכנה ובידוד מיו-פיבריל...

<ol>
	<li>Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcomere+Dysfunction+in+Nemaline+Myopathy.">Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy.</a> J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).</li><li>Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+and+passive+forces+of+isolated+myofibrils+from+cardiac+and+fast+skeletal+muscle+of+the+frog.">Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog.</a> Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).</li><li>Kulke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+major+source+of+myofibrillar+stiffness+in+Drosophila+indirect+flight+muscle.">a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle.</a> Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).</li><li>Stehle, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isometric+force+kinetics+upon+rapid+activation+and+relaxation+of+mouse,+guinea+pig+and+human+heart+muscle+studied+on+the+subcellular+myofibrillar+level.">Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level.</a> Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).</li><li>Ribeiro, P. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+Effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Joureau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+sarcomere+contractility+contributes+to+muscle+weakness+in+ACTA1-related+nemaline+myopathy+(NEM3).">Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3).</a> Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).</li><li>de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+perfusion+shows+intersarcomere+dynamics+within+single+skeletal+muscle+myofibrils.">Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).</li><li>Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+force+enhancement+is+regulated+by+titin+in+skeletal+and+cardiac+myofibrils.">Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils.</a> Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).</li><li>Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+non-cross-bridge+forces+after+stretch+of+activated+striated+muscle+is+related+to+titin+isoforms.">The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).</li><li>Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+system+for+probing+cantilever+deflections+parallel+to+a+sample+surface.">Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface.</a> Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).</li><li>Chavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferrule-top+nanoindenter:+an+optomechanical+fiber+sensor+for+nanoindentation.">Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation.</a> Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).</li><li>Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metrological+approach+for+the+calibration+of+force+transducers+with+interferometric+readout.">A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout.</a> Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).</li><li>van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+dynamic+mechanical+analysis+for+heterogeneous+soft+matter+using+ferrule-top+indentation.">Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation.</a> Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KBTBD13+is+an+actin-binding+protein+that+modulates+muscle+kinetics.">KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2019).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-specific+effects+on+thin+filament+length+in+thin+filament+myopathy.">Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy.</a> Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).</li><li>Ottenheijm, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleting+exon+55+from+the+nebulin+gene+induces+severe+muscle+weakness+in+a+mouse+model+for+nemaline+myopathy.">Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy.</a> Brain. 136, 1718-1731 (2013).</li><li>Ribeiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+Myosin-II+Inhibitor+(N-benzyl-p-toluene+Sulphonamide,+BTS)+on+Contractile+Characteristics+of+Intact+Fast-twitch+Mammalian+Muscle+Fibres.">Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).</li><li>Stehle, R., Kr&#252;ger, M., Pfitzer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+kinetics+and+individual+sarcomere+dynamics+in+cardiac+myofibrils+after+rapid+Ca(2+)+changes.">Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes.</a> Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).</li><li>Najafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-diastolic+force+pre-activates+cardiomyocytes+and+determines+contractile+force:+role+of+titin+and+calcium.">End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium.</a> Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).</li></ol>

מתואר הוא פרוטוקול כדי להעריך את הפונקציה ההתכווצות של myofibrils מבודד מרקמות שריר השלד אדם או בעלי חיים. פתרון הכוח של התקנה זו תואר בעבר על ידי Chavan ואח '12. בקיצור, הוא נקבע על ידי תנודות אקראיות של אורך חלל Fabry-Pérot שנוצר בין סיבי הזיהוי cantilever, אשר מייצרים את החלק הדומיננטי של הרעש ב...

תאי שריר מחוסנים הם הכרחיים עבור פעילויות חיי היומיום. תנועת גפיים, תפקוד נשימתי, ותנועת שאיבה של הלב להסתמך על הכוח שנוצר על ידי תאי שריר. שריר השלד מורכב fascicles שריר המכיל חבילות של סיבי שריר יחיד(איור 1A). סיבי שריר אלה מורכבים myofibrils, אשר נוצרים על ידי סרקומרים מקושרים באופן סדרתי (איור 1B,D). הסרקומרים מכילים נבטים דקים ועבים. אלה מורכבים בעיקר משרשראות של מולקולות אקין ומיוסין, בהתאמה(איור 1B). אינטראקציות Actin-מיויסין אחראים על יכולת ייצור כוח של שריר. חולים עם מוטציות בגנים קידוד חלבונים סרקומריים, כגון ערפילין, א-אקטין, וטרופונין T, סובלים חולשת שרירים עקב תפקודלקוי 1.
את איכות התכווצויות השרירים ניתן ללמוד ברמות שונות של הארגון, החל בשרירים שלמים vivo כדי אינטראקציות actin-myosin במבחנה motility אומר. במהלך העשורים האחרונים פיתחו מספר קבוצות מחקר הגדרות כדי לקבוע את ההתכווצות של myofibrilsבודדים 2, 3,4,,55,6,7,8,9,10. הגדרות אלה מבוססות על זיהוי של שינויים בהטיית לייזר מ cantilever (כלומר, סטיית קרן אופטית) הנגרמת על ידי התכווצות myofibril (לפרטים, ראה Labuda ואח'11). למרות קביעת הפונקציה ההתכווצות של myofibrils יש כמה מגבלות (למשל, הדינמיקה של תהליכי צימוד התכווצות-התכווצות הדרה כי הם במעלה הזרם של myofibrils חסרים), ישנם יתרונות מרובים לגישה זו. אלה כוללים: 1) את היכולת להעריך אינטראקציות actin-myosin בנוכחות האילוצים הגיאומטריים של הסרקומרים; 2) היכולת להעריך אינטראקציות actin-myosin ללא השפעות מבלבלות פוטנציאליות של מיופילים פגומים, סמוכים (בעת מדידת ההתכווצות של סיבי שריר יחיד נזק אולטרסטרוקטואלי ויישור של myofibrils עשוי לתרום להתכווצות לקויה) (איור 1D); 3) הקוטר הקטן של myofibrils (~ 1 μm, איור 2A)וחוסר קרום לאפשר דיפוזיה סידן כמעט מיידית לתוך הסרקומרים. יתר על כן, אם נזק מבני קיים ב myofibrils, הם צפויים לשבור במהלך הבידוד שלהם או במהלך הניסוי. לפיכך, הערכת התכווצות myofibril היא שיטה אלגנטית ללמוד את המנגנונים הבסיסיים של התכווצות שרירים ולהבין אם אינטראקציות א-אקטין-מיויסין מופרעות הן הגורם העיקרי למחלת שרירים הנגרמת על ידי מוטציות בחלבונים סרקומריים.
פרוטוקול זה מציג התקנה חדשה שפותחה כדי לקבוע את ההתכווצות של myofibrils המשלבת בדיקה כוח cantilever עם רזולוציית ננו-ניוטון (כלומר, Optiforce). גשוש כוח זה מבוסס על עקרון האינטרפרומטריה. אינטרפרומטריה מאפשרת שימוש בטילברים נוקשים יחסית. זה מאפשר למדוד כוח עם הסטה קטנה של cantilever, מתקרב התכווצויות איזומטריות של myofibril. הגשושית מאפשרת הערכה של כוחות פסיביים ופעילים נמוכים המיוצרים על ידי מיופיל אחד מבודד מבריופסיות שרירים שונות, כולל אלה של בני אדם, עם יחס אות לרעש גבוה. הגשושית האופטית של כוח cantilever המשולבת בהתקנה זו מבוססת על אינטרפרומטר Fabry-Pérot12. האינטרפרומטר מזהה תזוזות קטנות בין סיב אופטי לבין קטילבר מצופה זהב המותקן על פרול(איור 3). הפער בין הסיב האופטי לבין ה-cantilever נקרא חלל פברי-פרוט. Myofibrils מותקנים בין הגשוש מנוע piezo באמצעות שני סיבי זכוכית מצופה דבק הרכבה. הכוח המיוצר על ידי myofibril יכול להיות נגזר מתמטית מנתוני interferometer. אינטרפרומטריה מבוססת על מיקום העל או הפרעה של שני גלים או יותר (בהתקנה זו שלושה גלי אור). אור לייזר עם אורך גל בין 1,528.77-1,563.85 ננומטר נפלט מהאינטרפרומטר ונשלח דרך הסיב האופטי. בגשוש, האור משתקף 1) בממשק בין הסיב האופטי למדיום(איור 3A); 2) בממשק של המדיום ואת cantilever (איור 3B); ו 3) בממשק בין ציפוי מתכת וזהב של cantilever (איור 3C). ההשתקפות בממשק A ו- B תלויה במדד שבירה (n) של המדיום שבו הגשוש שקוע. האור, המורכב משלוש ההשתקפויות על-ידי, חוזר לפוטודיודה באינטרפרומטר. הפוטודיודה מודדת את עוצמת האור, שהיא תוצאה של דפוס ההפרעה של שלוש ההשתקפויות המודחות. כאשר כוח מתכווץ נוצר על ידי הפעלה או מתיחה myofibril, myofibril מושך על cantilever. תנועה זו משנה את גודל החלל(ד) וכתוצאה מכך, את מספר אורכי הגל המתאימים לחלל. האור הממוקם ב-cantilever יהיה שלב אחר, וכתוצאה מכך דפוס הפרעה שונה. הפוטודיודה מתעדת את השינוי הזה בעוצמת תבנית ההפרעה כשינוי בוולטס. לאחר מכן, דור כוח myofibril מחושב משינוי זה, תוך מתן בחשבון את נוקשות cantilever. גשושית הכוח מכוילת על ידי היצרן על ידי דחיפת קצה מחט ההרכבה, מחובר לקצה ההצמדה החופשי של cantilever, נגד סולם שקילה תוך שמירה על כיפוף של cantilever שווה כפול של אורך הגל של לייזר קריאה13. לכן, אינטרפרומטריה היא שיטה רגישה מאוד לזיהוי שינויים קטנים במרחק, המאפשר מדידה של כוחות עם רזולוציית ננו-ניוטון. החלטה זו מאפשרת הערכה של ייצור כוח myofibrillar עם יחס אות לרעש גבוה. בעוד אינטרפרומטריה מסורתית מגבילה את טווח המידות לחלק הליניארי של עקומת ההפרעה, באמצעות מגברים נעילה ואפנן של אורך גל הלייזר מתגבר עלמגבלה זו 14. הדבר מוסבר ביתר פירוט בסעיף הדיון.
כדי למדוד את המתח הפעיל myofibril, מערכת התזת צעד מהיר שולבה כדי לחשוף את myofibril לפתרונותסידן (איור 4A). מערכת ההתמהמה המהירה מאפשרת שינויי פתרון להתרחש בתוך 10 ms. בגלל הקוטר הקטן שלהם, דיפוזיה סידן לתוך myofibrils הוא כמעט מיידי. לפיכך, מערכת זו מתאימה במיוחד למדידת שיעורי כריכת actin-myosin במהלך ההפעלה ושחרור במהלך הרפיה. ניתן לקבוע את קצב ההפעלה (kACT)ואת ההרפיה (kREL)מהקימורים להרפיה של ההפעלה. כמו כן, על ידי חשיפת myofibrils לפתרונות סידן של הגדלת הריכוז, יחסי כוח סידן ורגישות סידן ניתן לקבוע.
יתר על כן, מנוע אורך piezo מאפשר מתיחות וקיצור מהיר של myofibril. זה מציע את האפשרות ללמוד את המאפיינים ויסולסטי (כלומר, מתח פסיבי) של myofibril, כמו גם ביצוע קיצור מהיר של מיופיל כדי לקבוע את קצב פיתוח מחדש מתח (kTR). הפרמטרים שאוחזרו מניסווני מתח אקטיביים ופסיביים יכולים להשתנות על ידי מוטציות גנטיות בחלבון סרקומרי.
התקנה זו שנבנתה בהתאמה אישית שימשה כדי למדוד את המאפיינים האקטיביים והפסיביים של myofibrils מבודדים משריר בריא של אדם, מטופל ושרד עכבר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio Spec Products, Inc.</td>
			<td>985370-XL</td>
			<td>To isolate myofibrils</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom coded</td>
			<td></td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Includes Labview program to control over serial connection; To control valves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Aluminum tissue chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To control the valves; Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td>MCS100</td>
			<td>To record sarcomere length</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Force probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Data registration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-200</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529265</td>
			<td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78471</td>
			<td>Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TE-63-1.0-1.3</td>
			<td>To cool the tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20736652</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20739263</td>
			<td>Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2441081</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>TG150-4</td>
			<td>To perfuse the tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 PC for IonWizard and 1 PC for other software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer

תאי שריר מחוסנים הם הכרחיים לפעילות של בני אדם ובעלי חיים. סיבי שריר יחיד מורכבים myofibrils, אשר מורכבים סרקומרים מקושרים באופן סדרתי, יחידות כיווץ הקטן ביותר בשריר. תפקוד סרקומרי תורם חולשת שרירים בחולים עם מוטציות בקידוד גנים עבור חלבונים סרקומריים. המחקר של מכניקה myofibril מאפשר הערכה של אינטראקציות actin-מיוסין ללא השפעות מבלבלות פוטנציאליות של מיו-בריאן פגום, סמוך בעת מדידת ההתכווצות של סיבי שריר יחיד. נזק אולטרה-סטרו-סטרו-סטריאלי ואי-יישור של מיו-בריאן עשויים לתרום להתכווצות לקויה. אם קיים נזק מבני ב myofibrils, הם צפויים לשבור במהלך הליך הבידוד או במהלך הניסוי. יתר על כן, מחקרים ב myofibrils לספק את ההערכה של אינטראקציות actin-מיוסין בנוכחות האילוצים הגיאומטריים של הסרקומרים. לדוגמה, מדידות ב myofibrils יכול להאיר אם תפקוד myofibrillar היא ההשפעה העיקרית של מוטציה בחלבון סרקומרי. בנוסף, עירוי עם פתרונות סידן או תרכובות הוא כמעט מיידי בשל הקוטר הקטן של myofibril. זה עושה myofibrils מתאים במידה רבה כדי למדוד את שיעורי ההפעלה והרפיה במהלך ייצור כוח. הפרוטוקול המתואר במאמר זה משתמש בבדיקה של כוח אופטי המבוססת על העיקרון של אינטרפרומטר Fabry-Pérot המסוגל למדוד כוחות בטווח ננו-ניוטון, בשילוב מנוע אורך piezo ומערכת התזת צעד מהירה. הגדרה זו מאפשרת את המחקר של מכניקה myofibril עם מדידות כוח ברזולוציה גבוהה.

מעקבי נתונים נרשמו ונפתחו באמצעות תוכנת בקר המערכת (ראה טבלת חומרים). מעקבים מלאים או מקטעים נבחרים יוצאו ללוח או לקובץ הטקסט לצורך ניתוח נוסף עם תוכנה רצויה. שסתומים לשליטה בזרימה של הפתרונות השונים הוחלפו עם תוכנה מותאמת אישית או באופן ידני. סקריפט MATLAB מותאם אישית שימש לניתוח ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer at JoVE.com

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

מוצג כאן פרוטוקול כדי להעריך את המאפיינים ההתכווצות של שרירים מחוסנים myofibrils עם רזולוציית ננו ניוטון. הפרוטוקול משתמש בהתקנה עם גשוש כוח אופטי מבוסס אינטרפרומטריה. הגדרה זו יוצרת נתונים עם יחס אות לרעש גבוה ומאפשרת הערכה של קינטיקה מתכוובת של myofibrils.

בידוד מיו-בריאלס מבריות מביופסיות שריר השלד וקביעת תפקוד מתכווץ עם מתמר כוח רזולוציה ננו-ניוטון

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

הערכת המאפיינים החוזיים של myofibrils מבודד שרירים מנוצים ניתן להשתמש כדי לקבוע אם תפקוד לקוי sarcomere הוא הגורם העיקרי לחולשת שרירים עקב מוטציות חלבונים סרקומריים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי להשיג נתונים עם יחס אות לרעש גבוה מאוד עם רזולוציה nanonewton. פרוטוקול זה מתאים גם למדידת התכווצות בקרדיומיוציטים מחלחלים.זכור כי מתמר הכוח הוא שביר מאוד. אז בעת הסרת הדבק ממחט ההרכבה או בעת הדבקת myofibril, אתה צריך להיות יד יציבה, הרבה תרגול, והרבה סבלנות. לפני הרכבה של הרקמה, מניחים מוט הומוגניזר בצינור המכיל את רקמת השריר.שמירה על הצינור על קרח, לסובב את הרוטור במשך 15 שניות על מהירות חמש. בסוף הומוגניזציה, להעביר 50 microliters של ההשעיה myofibril וכתוצאה מכך 250 microliters של פתרון מרגיע על מגלשה מצופה פולי HEMA באמבט רקמות. מכסים את האמבטיה במכסה כדי להגן על התערובת מפני אבק ומחכים 5 עד 10 דקות כדי לאפשר myofibrils לשקוע לתחתית הירידה.במהלך הטביעה של myofibrils, מחממים Shellac דבק אתנול ב 65 מעלות צלזיוס במשך 30 עד 60 שניות לפני הוספת על שישה microliters של דבק על מגלשת זכוכית לא צותת. טובלים שוב ושוב את קצה כל מחט הרכבה לתוך הדבק עד שכבה של דבק גלוי. לאחר מכן השתמש במיקרו-מניפולטורים כדי להזיז את הגשוש ואת הפיזו אנכית כדי לפנות מקום לאמבט הרקמות בשלב המיקרוסקופ ולהסיר את מגלשת הזכוכית המכילה את הדבק.לאחר הרכבה myofibrils, כדי למדוד את אורך sarcomere, להזיז את פיזו ו / או בדיקה כוח כדי להגדיר את אורך sarcomere הראשונית של myofibril ל 2.5 מיקרומטר. באמצעות תפקוד כלי השיט של תוכנת בקר המערכת, למדוד את האורך והרוחב myofibril. השתמש בשלב המיקרוסקופ כדי למקם את myofibril במרכז תמונת הווידאו למתוח מלבן מצד אחד של myofibril לצד השני, דואג לכלול את הקצה הכהה של טיפות דבק.כדי להתחיל בהקלטת הנתונים, לחץ על התחל. לאחר חמש שניות, לחץ על השהה. האורך יירשם.כדי למדוד את הרוחב, סובב את המצלמה ב- 90 מעלות כדי להציג את הניגודיות של קצה ה- myofibril עצמו. כוונן את המלבן ולחץ על התחל כדי להתחיל להקליט את הנתונים. לאחר חמש שניות, לחץ על השהה.הרוחב נרשם. כדי למקם את התטא, השתמש בעין ובמניפולטור כדי להזיז בזהירות את התטא לכיוון myofibril. ליישר את הערוץ העליון של תטא עם myofibril ולבצע צעד מהיר כדי לבדוק את המיקום.הפעל את זרימת מרגיע הרקע כדי לבדוק את יישור הזכוכית תטא ולהשתמש ידית שסתום לור כדי להפעיל את הזרימה של תא הזרימה. ואז להתחיל לנקז את תא הזרימה ולמנוע גלישה של תא הזרימה, להגדיר את שסתום משאבת הזרימה לשסתום אמבטיה 2, מצב צעד מיקרו למיקרו, יעד הבוכנה ל 48, 000, ואת מהירות הבוכנה ל 38 עד 40. כדי למדוד את קצב פיתוח המתח, לחשב את תנועת פייזו הדרוש כדי להתרשל myofibril על ידי 15%ולהזין ערך זה לתוך מחולל האות.לחץ על קורות חיים כדי להמשיך להקליט את הנתונים ושסתומים פתוחים אחד ושש כדי להתחיל את הזרימות של הפתרון המרגיע ואת ריכוזי הסידן השונים דרך תטא בהתאמה. בחר טווח איפוס על האינטרפרומטר כדי לאפס את טווח האינטרפרומטר כך שהכוח הבסיסי יהיה אפס וולט. כאשר עקבות הכוח יציבות, בצע את הצעד המהיר של זכוכית תטא עם גודל צעד של 100 מיקרומטר.כאשר מגיעים למישור הכוח, מבצעים את המתיחה מחדש עם הפייזו. עקבות הרפיה הפעלה יירשמו. לחץ על השהה.כדי לבצע מתיחה מבחינת שלב, לחץ על התחל ואפס את טווח האינטרפרומטר כך שהכוח הבסיסי יהיה אפס וולט. בצע מתיחה צעד חכם עם מחולל האותות. כאשר המתיחה הסתיימה, השתמש piezo כדי לקצר את myofibril לאורך הרפוי.לאחר מכן לחץ על השהה ועוון ושמור את הנתונים. כאן, עקבות כוח של ניסוי כוח פעיל עם myofibril מבודד שרירי שרירי שרירי הארבע ראשי אנושי בריא מוצגים. myofibril הופעל חמש פעמים עם פתרונות עם ריכוזי סידן שונים, עם כוח מרבי ממוצע של כל myofibrils של כ 123 מילניטון למילימטר מרובע.בניית עקומת ריכוז סידן כוח מ לכוחות הרמה שהושגו במהלך כל הפעלה בכל אחת מחמש עקומות הסידן מאפשרת חישוב של ריכוז הסידן ב -50% מייצור הכוח המרבי. כפי שמודגם בניתוח מייצג זה, myofibrils ניתן לטפל עם תרכובות מרובות בניסוי אחד כדי לענות על שאלות נוספות על סוג myofibril. ניתן למדוד גם את הכוח הפעיל ואת אורך הסרקומר כדי לאפשר חישוב של שיעורי הפיתוח מחדש, ההפעלה והרפיה.העלייה התלולה המוצגת בתיבה האדומה המנוקדת נגרמת הן על ידי צמיגות והן על ידי גמישות. הרמה דומה רק למרכיב האלסטי. כמו צמיגות מתנגדת למתח ליניארי, הכוח ירד לאחר המתח הוסר.בעת מיקום תטא, הקפד ליישר אותו כראוי עם myofibril. אחרת, פתרון ההפעלה עשוי לבוא בין הסיב האופטי ואת cantilever של בדיקה כוח וזה גורם חפצים להתרחש בנתונים שלך. כמו כן, myofibril לא יכול לפעול כראוי.שיטה זו של זיוף מתאימה גם כדי לקבוע את סוג סיבי השריר של myofibril. לדוגמה, אתה יכול קודם לבלבל את myofibril עם פתרון סידן נורמלי ואחריו תדלוק של אותו פתרון, אבל אז להוסיף תרכובת ספציפית לשיפור כוח סוג סיבי שריר.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

טיהור אבות מן שרירי השלד

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

נהלים לעכברוש<em&gt; באתר</em&gt; מאפייני התכווצות שרירי שלד

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

מדידת כוח במהלך התכווצות כדי להעריך את תפקוד שריר בזחלי דג הזברה

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

אימונוולבלינג מיוכי ניוון שרירים ביופסיות

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

אוסף של ביופסיות שריר השלד מהתאי העליון של השרירים האנושיים Tibialis הקדמי להערכה מכנית

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...