Name: isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer
Uploaded: 2020-05-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer at JoVE.com

Questo progetto è stato finanziato da AFM-Telethon e A Foundation Building Strength per le miopatie nemaline. Gli autori desiderano riconoscere il creatore dei prodotti menzionati in questo articolo, IONOptix Inc.

Il protocollo per ottenere biopsie umane è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale del VU University Medical Center (#2014/396) e il consenso scritto informato è stato ottenuto dai soggetti. Il protocollo per ottenere biopsie muscolari animali è stato approvato dal comitato etico animale locale presso l'Università VU (AVD114002016501)
1. Preparazione e isolamento miofibrile
NOTA: Utilizzare metodi descritti in precedenza per la glicecinazione delle...

<ol>
	<li>Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcomere+Dysfunction+in+Nemaline+Myopathy.">Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy.</a> J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).</li><li>Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+and+passive+forces+of+isolated+myofibrils+from+cardiac+and+fast+skeletal+muscle+of+the+frog.">Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog.</a> Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).</li><li>Kulke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+major+source+of+myofibrillar+stiffness+in+Drosophila+indirect+flight+muscle.">a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle.</a> Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).</li><li>Stehle, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isometric+force+kinetics+upon+rapid+activation+and+relaxation+of+mouse,+guinea+pig+and+human+heart+muscle+studied+on+the+subcellular+myofibrillar+level.">Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level.</a> Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).</li><li>Ribeiro, P. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+Effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Joureau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+sarcomere+contractility+contributes+to+muscle+weakness+in+ACTA1-related+nemaline+myopathy+(NEM3).">Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3).</a> Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).</li><li>de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+perfusion+shows+intersarcomere+dynamics+within+single+skeletal+muscle+myofibrils.">Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).</li><li>Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+force+enhancement+is+regulated+by+titin+in+skeletal+and+cardiac+myofibrils.">Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils.</a> Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).</li><li>Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+non-cross-bridge+forces+after+stretch+of+activated+striated+muscle+is+related+to+titin+isoforms.">The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).</li><li>Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+system+for+probing+cantilever+deflections+parallel+to+a+sample+surface.">Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface.</a> Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).</li><li>Chavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferrule-top+nanoindenter:+an+optomechanical+fiber+sensor+for+nanoindentation.">Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation.</a> Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).</li><li>Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metrological+approach+for+the+calibration+of+force+transducers+with+interferometric+readout.">A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout.</a> Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).</li><li>van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+dynamic+mechanical+analysis+for+heterogeneous+soft+matter+using+ferrule-top+indentation.">Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation.</a> Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KBTBD13+is+an+actin-binding+protein+that+modulates+muscle+kinetics.">KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2019).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-specific+effects+on+thin+filament+length+in+thin+filament+myopathy.">Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy.</a> Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).</li><li>Ottenheijm, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleting+exon+55+from+the+nebulin+gene+induces+severe+muscle+weakness+in+a+mouse+model+for+nemaline+myopathy.">Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy.</a> Brain. 136, 1718-1731 (2013).</li><li>Ribeiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+Myosin-II+Inhibitor+(N-benzyl-p-toluene+Sulphonamide,+BTS)+on+Contractile+Characteristics+of+Intact+Fast-twitch+Mammalian+Muscle+Fibres.">Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).</li><li>Stehle, R., Kr&#252;ger, M., Pfitzer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+kinetics+and+individual+sarcomere+dynamics+in+cardiac+myofibrils+after+rapid+Ca(2+)+changes.">Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes.</a> Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).</li><li>Najafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-diastolic+force+pre-activates+cardiomyocytes+and+determines+contractile+force:+role+of+titin+and+calcium.">End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium.</a> Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).</li></ol>

Descritto è un protocollo per valutare la funzione contrattile dei miofibrili isolati dai tessuti muscolari scheletrici umani o animali. La risoluzione della forza di questa configurazione è stata descritta in precedenza da Chavan et al.12. In breve, è determinato dalle fluttuazioni casuali della lunghezza della cavità Fabry-Pérot formata tra la fibra di rilevamento e il cantilever, che producono la parte dominante del rumore all'uscita del readout (espresso in V) che, moltiplicato per la sen...

Le cellule muscolari striate sono indispensabili per le attività quotidiane. Il movimento degli arti, la funzione respiratoria e il movimento di pompaggio del cuore si basano sulla forza generata dalle cellule muscolari. Il muscolo scheletrico è costituito da fascicle muscolari contenenti fasci di fibre muscolari singole (Figura 1A). Queste fibre muscolari sono costituite da miofibrils, che sono formate da sarcomere collegati in serie (Figura 1B,D). I sarcomere contengono filamenti sottili e spessi. Questi consistono principalmente in catene di molecole di actina e miosina, rispettivamente (Figura 1B). Le interazioni Actin-myosin sono responsabili della capacità di generazione della forza del muscolo. I pazienti con mutazioni nei geni che codificano per le proteine sarcomeriche, come la nebulina, l'actina e la troponina T, soffrono di debolezza muscolare dovuta alla disfunzione contrattile1.
La qualità della contrattilità muscolare può essere studiata a vari livelli di organizzazione, che vanno dai muscoli interi in vivo alle interazioni actin-myosin nei saggi di motilità in vitro. Nel corso degli ultimi decenni, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato configurazioni per determinare la contrattilità dei singoli myofibrils2,3,4,5,6,7,8,9,10. Queste configurazioni si basano sul rilevamento dei cambiamenti nella deflessione laser da un cantilever (cioè, deflessione del fascio ottico) causati dalla contrazione del miofibril (per i dettagli, vedere Labuda et al.11). Anche se determinare la funzione contrattile delle miofibrils ha alcune limitazioni (ad esempio, le dinamiche dei processi di accoppiamento eccitazione-contrazione che sono a monte delle miofibrils sono carenti), ci sono molteplici vantaggi a questo approccio. Questi includono: 1) la capacità di valutare le interazioni actin-myosin in presenza dei vincoli geometrici dei sarcomere; 2) la capacità di valutare le interazioni actin-myosin senza potenziali effetti di confusione di miofibrili danneggiati e adiacenti (quando si misura la contrattilità delle singole fibre muscolari danno ultrastrutturale e disallineamento delle miofibrils potrebbe contribuire a contrarre alterata)(Figura 1D); 3) il piccolo diametro dei miofibrili (1 m, Figura 2A) e la mancanza di membrane consentono una diffusione quasi istantanea del calcio nei sarcomere. Inoltre, se nei miofibrils sono presenti danni strutturali, probabilmente si rompono durante il loro isolamento o durante l'esperimento. Quindi, valutare la contrattilità miofibrile è un metodo elegante per studiare i meccanismi di base della contrazione muscolare e per capire se le interazioni actin-myosin disturbate sono la causa principale della malattia muscolare causata da mutazioni nelle proteine sarcomeche.
Questo protocollo presenta una configurazione di recente sviluppo per determinare la contrattilità delle miofibrils che incorporano una sonda di forza a sbalzo con risoluzione nano-Newton (cioè Optiforce). Questa sonda di forza si basa sul principio dell'interferometria. L'interferometria consente l'uso di sbalzosi relativamente rigidi. Questo permette di misurare la forza con poca deflessione del cantilever, avvicinandosi alle contrazioni isometriche del miofibrile. La sonda consente la valutazione di forze basse passive e attive prodotte da un singolo miofibrile isolato da diverse biopsie muscolari, comprese quelle di soggetti umani, con un elevato rapporto segnale-rumore. La sonda ottica a sbalzo incorporata in questa configurazione si basa su un interferometro Fabry-Pérot12. L'interferometro rileva piccoli spostamenti tra una fibra ottica e un cantilever rivestito in oro montato su un ferrule(Figura 3). Il divario tra la fibra ottica e il cantilever è chiamato cavità Fabry-Pérot. I myofibrils sono montati tra la sonda e il motore piezo utilizzando due fibre di montaggio in vetro rivestite di colla. La forza prodotta dal miofibrile può essere derivata matematicamente dai dati dell'interferometro. L'interferometria si basa sulla sovrapposizione o sull'interferenza di due o più onde (in questa configurazione tre onde luminose). La luce laser con una lunghezza d'onda compresa tra 1.528,77–1.563,85 nm viene emessa dall'interferometro e viene inviata attraverso la fibra ottica. Nella sonda, la luce viene riflessa 1) all'interfaccia tra la fibra ottica e il mezzo (Figura 3A); 2) all'interfaccia del mezzo e del cantilever (Figura 3B); e 3) all'interfaccia tra il rivestimento in metallo e oro del cantilever (Figura 3C). La reflection all'interfaccia A e B dipende dall'indice di rifrazione (n) del mezzo in cui la sonda è sommersa. La luce, costituita dai tre riflessi sovrapposti, ritorna ad un fotodiode nell'interferometro. Il fotodiode misura l'intensità della luce, che è il risultato del modello di interferenza dei tre riflessi sovrapposti. Quando la forza contrattile viene generata attivando o allungando un miofibril, il miofibrile tira sul cantilever. Questo movimento cambia la dimensione della cavità (d) e, di conseguenza, il numero di lunghezze d'onda che si adattano alla cavità. La luce riflessa sul cantilever avrà una fase diversa, con conseguente un diverso modello di interferenza. Il fotodiode registra questo cambiamento di intensità del modello di interferenza come un cambiamento in Volts. Successivamente, la generazione di forza miofibrile viene calcolata da questo cambiamento, tenendo conto della rigidità a sbalzo. La sonda di forza è calibrata dal produttore spingendo la punta dell'ago di montaggio, attaccata all'estremità libera del cantilever, contro una bilancia di pesatura mantenendo la piegatura dello sbalzo pari a un multiplo della lunghezza d'onda del laser di lettura13. Pertanto, l'interferometria è un metodo altamente sensibile per rilevare piccoli cambiamenti di distanza, consentendo la misurazione delle forze con risoluzione nano-Newton. Questa risoluzione consente di valutazione della produzione di forza miofibrillare con un elevato rapporto segnale-rumore. Mentre l'interferometria tradizionale limita la gamma di misure alla parte lineare della curva di interferenza, l'utilizzo di un amplificatore lock-in e della modulazione della lunghezza d'onda lasersupera questa limitazione 14. Ciò è spiegato in modo più dettagliato nella sezione di discussione.
Per misurare la tensione attiva miofibrile, è stato incorporato un sistema di perfusione in fase rapida per esporre il miofibril alle soluzioni di calcio (Figura 4A). Il sistema di perfusione a passo rapido consente di apportare modifiche alla soluzione entro 10 ms. A causa del loro piccolo diametro, la diffusione del calcio nelle miofibrils è quasi istantanea. Pertanto, questo sistema è particolarmente adatto per misurare i tassi di legame actin-myosin durante l'attivazione e il rilascio durante il rilassamento. La velocità di attivazione (kACT) e il rilassamento (kREL) possono essere determinati dalle curve di attivazione-rilassamento. Inoltre, esponendo i miofibrili a soluzioni di calcio di crescente concentrazione, è possibile determinare il rapporto forza-calcio e la sensibilità al calcio.
Inoltre, un motore di lunghezza piezo consente di allungare e accorciare velocemente il miofibril. Ciò offre la possibilità di studiare le proprietà viscoelastiche (cioè la tensione passiva) del miofibril, oltre ad eseguire un rapido accorciamento e riposo del miofibril per determinare il tasso di riqualificazione della tensione (kTR). I parametri recuperati dagli esperimenti di tensione attiva e passiva possono essere alterati da mutazioni genetiche in una proteina sarcomerica.
Questa configurazione su misura è stata utilizzata per misurare le caratteristiche contrattuali attive e passive dei miofibrili isolati dal muscolo scheletrico umano, paziente e topo sano.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio Spec Products, Inc.</td>
			<td>985370-XL</td>
			<td>To isolate myofibrils</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom coded</td>
			<td></td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Includes Labview program to control over serial connection; To control valves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Aluminum tissue chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To control the valves; Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td>MCS100</td>
			<td>To record sarcomere length</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Force probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Data registration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-200</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529265</td>
			<td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78471</td>
			<td>Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TE-63-1.0-1.3</td>
			<td>To cool the tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20736652</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20739263</td>
			<td>Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2441081</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>TG150-4</td>
			<td>To perfuse the tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 PC for IonWizard and 1 PC for other software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer

Le cellule muscolari striate sono indispensabili per l'attività di esseri umani e animali. Le fibre muscolari singole sono costituite da miofibrils, che consistono in sarcomere collegati in serie, le più piccole unità contraili nel muscolo. La disfunzione sarcomerica contribuisce alla debolezza muscolare nei pazienti con mutazioni nei geni che codificano per le proteine sarcomeriche. Lo studio della meccanica miofibrile consente la valutazione delle interazioni actin-myosin senza potenziali effetti confusi di miofibrili danneggiati e adiacenti quando si misura la contrattilità delle singole fibre muscolari. I danni ultrastrutture e il disallineamento dei miofibrils potrebbero contribuire a una contrattura compromessa. Se nei miofibrils sono presenti danni strutturali, probabilmente si rompono durante la procedura di isolamento o durante l'esperimento. Inoltre, gli studi in miofibrils forniscono la valutazione delle interazioni actin-myosin in presenza dei vincoli geometrici dei sarcomere. Ad esempio, le misurazioni nei miofibrils possono chiarire se la disfunzione miofibrillare sia l'effetto primario di una mutazione in una proteina sarcomerica. Inoltre, la perfusione con soluzioni di calcio o composti è quasi istantanea a causa del piccolo diametro del miofibril. Questo rende myofibrils eminentemente adatto a misurare i tassi di attivazione e rilassamento durante la produzione di forza. Il protocollo descritto in questo documento utilizza una sonda di forza ottica basata sul principio di un interferometro Fabry-Pérot in grado di misurare le forze nella gamma nano-Newton, accoppiato a un motore di lunghezza piezo e un sistema di perfusione in fase rapida. Questa configurazione consente lo studio della meccanica miofibrile con misurazioni della forza ad alta risoluzione.

Le tracce dei dati sono state registrate e aperte con il software del controllore di sistema (vedere Tabella dei materiali). Le tracce complete o i segmenti selezionati sono stati esportati negli appunti o nel file di testo per un'ulteriore analisi con il software desiderato. Le valvole per controllare il flusso delle diverse soluzioni sono state commutate con software personalizzato o manualmente. Uno script MATLAB personalizzato è stato utilizzato per analizzare i tassi di attivazione, riqualificazion...

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Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Presentato qui è un protocollo per valutare le proprietà contraili dei miofibrili muscolari striati con risoluzione nano-Newton. Il protocollo utilizza una configurazione con una sonda a forza ottica basata sull'interferometria. Questa configurazione genera dati con un elevato rapporto segnale-rumore e consente la valutazione della cinetica contrattinale delle miofibrils.

Isolamento di Myofibrils da biopsie muscolari scheletriche e determinazione della funzione Contractile con un trasduttore della forza di risoluzione Nano-Newton

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

La valutazione delle proprietà contrattili delle miofibrille isolate dal muscolo striato può essere utilizzata per determinare se la disfunzione del sarcomero è una causa primaria di debolezza muscolare a causa di mutazioni nelle proteine sarcomeriche. Questa tecnica può essere utilizzata per acquisire dati con un rapporto segnale-rumore molto elevato con risoluzione di nanonewton. Questo protocollo è adatto anche per misurare la contrattilità nei cardiomiociti permeabilizzati.Tieni presente che il trasduttore di forza è molto fragile. Quindi, quando si rimuove la colla dall'ago di montaggio o quando si incolla una miofibrile, è necessario avere una mano ferma, molta pratica e molta pazienza. Prima di montare il tessuto, posizionare un'asta di omogeneizzatore nel tubo contenente il tessuto muscolare.Mantenendo il tubo sul ghiaccio, ruotare il rotore per 15 secondi sulla velocità cinque. Al termine dell'omogeneizzazione, trasferire 50 microlitri della sospensione miofibrille risultante e 250 microlitri di soluzione rilassante su uno scivolo rivestito in poli-HEMA in un bagno di tessuto. Coprire il bagno con un coperchio per proteggere la miscela dalla polvere e attendere da 5 a 10 minuti per consentire alle miofibri di affondare sul fondo della goccia.Durante l'affondamento delle miofibrille, scaldare shellac una colla di etanolo a 65 gradi Celsius per 30-60 secondi prima di aggiungere circa sei microlitri di colla su uno scivolo di vetro non rivestito. Immergere ripetutamente la punta di ogni ago di montaggio nella colla fino a quando non è visibile uno strato di colla. Quindi utilizzare i micro manipolatori per spostare la sonda e il piezo verticalmente per fare spazio al bagno di tessuto sullo stadio del microscopio e rimuovere lo scivolo di vetro contenente la colla.Dopo aver montato le miofibrille, per misurare la lunghezza del sarcomero, spostare la sonda piezo e/o di forza per impostare la lunghezza iniziale del sarcomero del miofibrile su 2,5 micrometri. Utilizzando la funzione di contenitore del software del controller di sistema, misurare la lunghezza e la larghezza della miofibrillazione. Utilizzare lo stadio del microscopio per posizionare la miofibrile al centro dell'immagine video e allungare un rettangolo da un lato della miofibrile all'altro, facendo attenzione a includere il bordo scuro delle goccioline di colla.Per iniziare a registrare i dati, fare clic su Avvia. Dopo cinque secondi, fare clic su Pausa. La lunghezza sarà stata registrata.Per misurare la larghezza, ruotare la fotocamera di 90 gradi per visualizzare il contrasto del bordo della miofibrile stessa. Regolare il rettangolo e fare clic su Avvia per iniziare a registrare i dati. Dopo cinque secondi, fare clic su Pausa.La larghezza sarà stata registrata. Per posizionare il vetro theta, utilizzare l'oculare e il manipolatore per spostare attentamente il vetro theta verso la miofibrile. Allineare il canale superiore del vetro theta con la miofibrile ed eseguire un passo veloce per verificare la posizione.Accendere il flusso rilassante dello sfondo per controllare l'allineamento del vetro theta e utilizzare una leva della valvola Luer per accendere l'afflusso della camera di flusso. Quindi, per iniziare a drenare la camera di flusso e per evitare lo straripamento della camera di flusso, impostare la valvola della pompa di deflusso sulla valvola da bagno due, la modalità micro step a micro, il bersaglio dello stantuffo a 48.000 e la velocità dello stantuffo a 38 a 40. Per misurare il tasso di riqualificazione della tensione, calcolare il movimento piezo necessario per rallentare la miofibrile del 15% e inserire questo valore nel generatore di segnale.Fare clic su riprendi per continuare a registrare i dati e aprire le valvole uno e sei per avviare i flussi della soluzione rilassante e le diverse concentrazioni di calcio rispettivamente attraverso il vetro theta. Selezionate l'intervallo di reset sull'interferometro per ripristinare l'intervallo dell'interferometro in modo che la forza di base sia zero volt. Quando la traccia di forza è stabile, eseguire il fast-step in vetro theta con una dimensione del passo di 100 micrometri.Quando si raggiunge l'altopiano di forza, eseguire il ri-allungamento accorciamento con il piezo. Verrà registrata una traccia di rilassamento dell'attivazione. Fare clic su Pausa.Per eseguire un'estensione step-wise, fare clic su avvia e reimpostare l'intervallo dell'interferometro in modo che la forza di base sia zero volt. Eseguire un allungamento step-wise con il generatore di segnale. Al termine dell'allungamento, utilizzare il piezo per accorciare la miofibrile alla lunghezza del margine di flessibilità.Quindi premere pausa e arresto e salvare i dati. Qui, vengono mostrate tracce di forza di un esperimento di forza attiva con una miofibrile isolata dal muscolo quadricipite umano sano. La miofibrillazione è stata attivata cinque volte con soluzioni con concentrazioni di calcio variabili, con una forza massima media di tutte le miofibrille di circa 123 millinewton per millimetro quadrato.La costruzione di una curva di concentrazione di calcio di forza dalle forze dell'altopiano raggiunte durante ogni attivazione in ciascuna delle cinque curve di calcio consente il calcolo della concentrazione di calcio al 50% della produzione massima di forza. Come illustrato in questa analisi rappresentativa, le miofibrille possono essere trattate con composti multipli in un singolo esperimento per rispondere a domande aggiuntive sul tipo di miofibrillazione. La forza attiva e la lunghezza del sarcomero possono anche essere misurate per consentire il calcolo dei tassi di riqualificazione, attivazione e rilassamento.Il forte aumento mostrato nella scatola rossa punteggiata è causato sia dalla viscosità che dall'elasticità. L'altopiano assomiglia solo alla componente elastica. Poiché la viscosità resiste alla deformazione linearmente, la forza è caduta dopo che il ceppo è stato rimosso.Quando si posiziona il vetro theta, assicurarsi di allinearlo correttamente alla miofibrile. In caso contrario, la soluzione di attivazione potrebbe entrare tra la fibra ottica e il cantilever della sonda di forza e ciò causa la verifica di artefatti nei dati. Inoltre, il miofibrile potrebbe non attivarsi correttamente.Questo metodo di perfusione è adatto anche per determinare il tipo di fibra muscolare della miofibrile. Ad esempio, è possibile prima perfondere la miofibrile con una normale soluzione di calcio seguita da perfusione della stessa soluzione, ma quindi aggiungere un composto specifico per il miglioramento della forza di tipo fibra muscolare.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Ricerca

Biologia

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