Name: isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer
Uploaded: 2020-05-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer at JoVE.com

Este projeto foi financiado pela AFM-Telethon e uma Fundação Construindo Força para Miopatias Nemaline. Os autores desejam reconhecer o criador dos produtos mencionados neste artigo, IONOptix Inc.

O protocolo de obtenção de biópsias humanas foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do Vu University Medical Center (#2014/396) e o consentimento por escrito informado foi obtido dos sujeitos. O protocolo de obtenção de biópsias musculares animais foi aprovado pelo comitê local de ética animal da UNIVERSIDADE VU (AVD114002016501)
1. Preparação e isolamento miofibril
NOTA: Use métodos descritos anteriormente para glicerinar biópsias, preparar a...

<ol>
	<li>Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcomere+Dysfunction+in+Nemaline+Myopathy.">Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy.</a> J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).</li><li>Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+and+passive+forces+of+isolated+myofibrils+from+cardiac+and+fast+skeletal+muscle+of+the+frog.">Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog.</a> Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).</li><li>Kulke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+major+source+of+myofibrillar+stiffness+in+Drosophila+indirect+flight+muscle.">a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle.</a> Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).</li><li>Stehle, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isometric+force+kinetics+upon+rapid+activation+and+relaxation+of+mouse,+guinea+pig+and+human+heart+muscle+studied+on+the+subcellular+myofibrillar+level.">Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level.</a> Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).</li><li>Ribeiro, P. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+Effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Joureau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+sarcomere+contractility+contributes+to+muscle+weakness+in+ACTA1-related+nemaline+myopathy+(NEM3).">Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3).</a> Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).</li><li>de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+perfusion+shows+intersarcomere+dynamics+within+single+skeletal+muscle+myofibrils.">Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).</li><li>Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+force+enhancement+is+regulated+by+titin+in+skeletal+and+cardiac+myofibrils.">Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils.</a> Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).</li><li>Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+non-cross-bridge+forces+after+stretch+of+activated+striated+muscle+is+related+to+titin+isoforms.">The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).</li><li>Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+system+for+probing+cantilever+deflections+parallel+to+a+sample+surface.">Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface.</a> Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).</li><li>Chavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferrule-top+nanoindenter:+an+optomechanical+fiber+sensor+for+nanoindentation.">Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation.</a> Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).</li><li>Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metrological+approach+for+the+calibration+of+force+transducers+with+interferometric+readout.">A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout.</a> Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).</li><li>van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+dynamic+mechanical+analysis+for+heterogeneous+soft+matter+using+ferrule-top+indentation.">Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation.</a> Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KBTBD13+is+an+actin-binding+protein+that+modulates+muscle+kinetics.">KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2019).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-specific+effects+on+thin+filament+length+in+thin+filament+myopathy.">Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy.</a> Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).</li><li>Ottenheijm, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleting+exon+55+from+the+nebulin+gene+induces+severe+muscle+weakness+in+a+mouse+model+for+nemaline+myopathy.">Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy.</a> Brain. 136, 1718-1731 (2013).</li><li>Ribeiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+Myosin-II+Inhibitor+(N-benzyl-p-toluene+Sulphonamide,+BTS)+on+Contractile+Characteristics+of+Intact+Fast-twitch+Mammalian+Muscle+Fibres.">Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).</li><li>Stehle, R., Kr&#252;ger, M., Pfitzer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+kinetics+and+individual+sarcomere+dynamics+in+cardiac+myofibrils+after+rapid+Ca(2+)+changes.">Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes.</a> Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).</li><li>Najafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-diastolic+force+pre-activates+cardiomyocytes+and+determines+contractile+force:+role+of+titin+and+calcium.">End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium.</a> Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).</li></ol>

Descrito é um protocolo para avaliar a função conctítil de miofibrils isolados dos tecidos musculares esqueléticos humanos ou animais. A resolução de força desta configuração foi descrita anteriormente por Chavan et al.12. Em suma, é determinado pelas flutuações aleatórias do comprimento da cavidade Fabry-Pérot formada entre a fibra de detecção e o cantilever, que produzem a parte dominante do ruído na saída da leitura (expressa em V) que, multiplicada pela sensibilidade de defl...

As células musculares estriadas são indispensáveis para as atividades cotidianas. O movimento dos membros, a função respiratória e o movimento de bombeamento do coração dependem da força gerada pelas células musculares. O músculo esquelético consiste em fascicles musculares contendo feixes de fibras musculares únicas(Figura 1A). Estas fibras musculares são compostas por miofibrils, que são formados por sarcomeres serialmente ligados(Figura 1B,D). Os sarcomeres contêm filamentos finos e grossos. Estes consistem principalmente em cadeias de moléculas de actina e miosina, respectivamente(Figura 1B). As interações actina-miosina são responsáveis pela capacidade de geração de força dos músculos. Pacientes com mutações em genes codificados por proteínas sarcomericas, como nebulina, actina e troponina T, sofrem de fraqueza muscular devido à disfunção contratil1.
A qualidade da contratilidade muscular pode ser estudada em vários níveis de organização, desde músculos inteiros in vivo até interações actin-myosin em ensaios de motilidade in vitro. Durante as últimas décadas, vários grupos de pesquisa desenvolveram configurações para determinar a contralidade dos myofibrils individuais2,3,4,5,6,7,8,,9,10. Essas configurações baseiam-se na detecção de alterações na deflexão a laser de um cantilever (ou seja, deflexão óptica do feixe) causada pela contração do myofibril (para detalhes, consulte Labuda et al.11). Embora a determinação da função contratual dos myofibrils tenha algumas limitações (por exemplo, a dinâmica dos processos de acoplamento excitação-contração que estão a montante dos miofibrils são escassas), há múltiplas vantagens nessa abordagem. Estes incluem: 1) a capacidade de avaliar interações actina-miosina na presença das restrições geométricas dos sarcomeres; 2) a capacidade de avaliar as interações actina-miosina sem potenciais efeitos confusos de miofibrils danificados e adjacentes (ao medir a contratilidade de fibras musculares únicas danos ultraestruturais e desalinhamento de miofibrils podem contribuir para a contratilidade prejudicada) (Figura 1D); 3) o pequeno diâmetro dos miofibrils (~1 μm, Figura 2A) e a falta de membranas permitem uma difusão de cálcio quase instantânea nos sarcomeres. Além disso, se os danos estruturais estiverem presentes nos miofibrils, eles provavelmente quebram durante seu isolamento ou durante o experimento. Assim, avaliar a contratude do miofibril é um método elegante para estudar os mecanismos básicos de contração muscular e entender se as interações actina-miosina perturbada são a principal causa de doença muscular causada por mutações em proteínas sarcomericas.
Este protocolo apresenta uma configuração recém-desenvolvida para determinar a contratilidade dos myofibrils incorporando uma sonda de força cantilever com resolução nano-Newton (ou seja, Optiforce). Esta sonda de força é baseada no princípio da interferometria. A interferometria permite o uso de cantilevers relativamente rígidos. Isso torna possível medir a força com pouca deflexão do cantilever, aproximando-se de contrações isométricas do miofibril. A sonda permite a avaliação de forças passivas e ativas baixas que são produzidas por um único myofibril isolado de diferentes biópsias musculares, incluindo as de indivíduos humanos, com uma alta relação sinal-ruído. A sonda óptica cantilever force incorporada nesta configuração é baseada em um interferômetro Fabry-Pérot12. O interferômetro detecta pequenos deslocamentos entre uma fibra óptica e um cantilever revestido de ouro montado em uma ferrule(Figura 3). A distância entre a fibra óptica e o cantilever é chamada de cavidade Fabry-Pérot. Os myofibrils são montados entre a sonda e o motor piezo usando duas fibras de montagem de vidro revestidas de cola. A força produzida pelo myofibril pode ser matematicamente derivada dos dados do interferômetro. A interferometria é baseada na superposição ou interferência de duas ou mais ondas (nesta configuração três ondas de luz). A luz laser com comprimento de onda entre 1.528,77-1.563,85 nm é emitida a partir do interferômetro e é enviada através da fibra óptica. Na sonda, a luz é refletida 1) na interface entre a fibra óptica e o meio(Figura 3A); 2) na interface do meio e do cantilever(Figura 3B); e 3) na interface entre o revestimento metálico e dourado do cantilever(Figura 3C). A reflexão na interface A e B depende do índice de refração (n)do meio em que a sonda está submersa. A luz, composta pelas três reflexões sobrepostas, retorna a um fotodiodo no interferômetro. O fotodiodo mede a intensidade da luz, que é o resultado do padrão de interferência das três reflexões sobrepostas. Quando a força contratil é gerada ativando ou esticando um myofibril, o myofibril puxa o cantilever. Esse movimento altera o tamanho da cavidade (d) e, consequentemente, o número de comprimentos de onda que se encaixam na cavidade. A luz refletida no cantilever terá uma fase diferente, resultando em um padrão de interferência diferente. O fotodiodo registra essa mudança de intensidade de padrão de interferência como uma mudança em Volts. Posteriormente, a geração de força myofibril é calculada a partir desta mudança, levando em conta a rigidez cantilever. A sonda de força é calibrada pelo fabricante empurrando a ponta da agulha de montagem, presa à extremidade de entrega livre do cantilever, contra uma balança de pesagem, mantendo a dobra do cantilever igual a um múltiplo do comprimento de onda do laser de leitura13. Assim, a interferometria é um método altamente sensível para detectar pequenas alterações à distância, permitindo a medição de forças com resolução nano-Newton. Esta resolução permite a avaliação da produção de força miofibrilar com uma alta relação sinal-ruído. Enquanto a interferometria tradicional limita a faixa de medidas à parte linear da curva de interferência, o uso de um amplificador de travamento e modulação do comprimento de onda laser supera essa limitação14. Isso é explicado com mais detalhes na seção de discussão.
Para medir a tensão ativa do miofibril, um sistema de perfusão de passo rápido foi incorporado para expor o miofibril às soluções de cálcio(Figura 4A). O sistema de perfusão de passo rápido permite que mudanças de solução ocorram dentro de 10 ms. Devido ao seu pequeno diâmetro, a difusão de cálcio nos miofibrils é quase instantânea. Assim, este sistema é particularmente adequado para medir as taxas de ligação actin-myosin durante a ativação e liberação durante o relaxamento. A taxa de ativação (kACT) e relaxamento (kREL) podem ser determinadas a partir das curvas de ativação-relaxamento. Além disso, expondo os miofibrils a soluções de cálcio de concentração crescente, a relação força-cálcio e a sensibilidade ao cálcio podem ser determinadas.
Além disso, um motor de comprimento piezo permite alongamento rápido e encurtamento do myofibril. Isso oferece a possibilidade de estudar as propriedades viscoelásticas (ou seja, tensão passiva) do myofibril, bem como realizar um rápido encurtamento e ressuado do miofibril para determinar a taxa de reurbanização da tensão (kTR). Os parâmetros recuperados de experimentos de tensão ativa e passiva podem ser alterados por mutações genéticas em uma proteína sarcomeric.
Esta configuração personalizada foi usada para medir as características contratuais ativas e passivas de myofibrils isolados de músculos esqueléticos humanos, pacientes e camundongos saudáveis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio Spec Products, Inc.</td>
			<td>985370-XL</td>
			<td>To isolate myofibrils</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom coded</td>
			<td></td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Includes Labview program to control over serial connection; To control valves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Aluminum tissue chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To control the valves; Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td>MCS100</td>
			<td>To record sarcomere length</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Force probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Data registration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-200</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529265</td>
			<td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78471</td>
			<td>Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TE-63-1.0-1.3</td>
			<td>To cool the tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20736652</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20739263</td>
			<td>Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2441081</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>TG150-4</td>
			<td>To perfuse the tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 PC for IonWizard and 1 PC for other software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer

Células musculares estriadas são indispensáveis para a atividade de humanos e animais. As fibras musculares únicas são compostas por miofibrils, que consistem em sarcomeres serialmente ligados, as menores unidades contratuais em músculos. A disfunção sarérica contribui para a fraqueza muscular em pacientes com mutações em genes codificando proteínas sarcomericas. O estudo da mecânica miofibril permite a avaliação das interações actin-myosin sem potenciais efeitos de confusão de miofibrils danificados e adjacentes ao medir a contratilidade de fibras musculares únicas. Danos ultraestruturais e desalinhamento de miofibrils podem contribuir para a falta de comprometimento. Se houver danos estruturais nos miofibrils, eles provavelmente quebram durante o procedimento de isolamento ou durante o experimento. Além disso, estudos em miofibrils fornecem a avaliação das interações actin-myosin na presença das restrições geométricas dos sarcomeres. Por exemplo, medições em miofibrils podem elucidar se a disfunção miofibrilar é o efeito primário de uma mutação em uma proteína sarcomeric. Além disso, a perfusão com soluções ou compostos de cálcio é quase instantânea devido ao pequeno diâmetro do miofibril. Isso torna os myofibrils eminentemente adequados para medir as taxas de ativação e relaxamento durante a produção de força. O protocolo descrito neste artigo emprega uma sonda de força óptica baseada no princípio de um interferômetro Fabry-Pérot capaz de medir forças na faixa nano-Newton, acoplado a um motor de comprimento piezo e um sistema de perfusão de passo rápido. Esta configuração permite o estudo da mecânica miofibril com medições de força de alta resolução.

Os vestígios de dados foram registrados e abertos com o software do controlador do sistema (ver Tabela de Materiais). Traços completos ou segmentos selecionados foram exportados para a área de transferência ou arquivo de texto para análise posterior com um software desejado. As válvulas para controlar o fluxo das diferentes soluções foram trocadas com software personalizado ou manualmente. Um script MATLAB personalizado foi usado para analisar as taxas de ativação, redesenvolvimento de tensão ...

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Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Apresentado aqui é um protocolo para avaliar as propriedades contratuais de myofibrils musculares estriados com resolução nano-Newton. O protocolo emprega uma configuração com uma sonda de força óptica baseada em interferometria. Esta configuração gera dados com uma alta relação sinal-ruído e permite a avaliação da cinética contracttil dos myofibrils.

Isolando Myofibrils de Biópsias musculares esqueléticas e determinando função contractile com um transdutor de força de resolução nano-Newton

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Avaliar as propriedades contratuais de miofibrils isolados do músculo estriado pode ser usado para determinar se a disfunção do sarcomere é a principal causa de fraqueza muscular devido a mutações em proteínas sarcomeric. Esta técnica pode ser usada para adquirir dados com uma relação sinal-ruído muito alta com resolução de nanonewton. Este protocolo também é adequado para medir a contrativismo em cardiomiócitos permeabilizados.Tenha em mente que o transdutor de força é muito frágil. Então, ao remover a cola da agulha de montagem ou ao colar um myofibril, você precisa ter uma mão firme, muita prática, e muita paciência. Antes de montar o tecido, coloque uma haste homogeneizadora no tubo contendo o tecido muscular.Mantendo o tubo no gelo, gire o rotor por 15 segundos na velocidade cinco. Ao final da homogeneização, transfira 50 microliters da suspensão myofibril resultante e 250 microliters de solução relaxante para um slide revestido de poli-HEMA em um banho de tecido. Cubra o banho com uma tampa para proteger a mistura do pó e espere de 5 a 10 minutos para permitir que os myofibrils afundem até o fundo da gota.Durante o naufrágio dos myofibrils, aqueça Shellac uma cola de etanol a 65 graus Celsius por 30 a 60 segundos antes de adicionar cerca de seis microliters de cola em um escorregador de vidro não revestido. Mergulhe repetidamente a ponta de cada agulha de montagem na cola até que uma camada de cola seja visível. Em seguida, use micro-manipuladores para mover a sonda e piezo verticalmente para abrir espaço para o banho de tecido no estágio do microscópio e remover a lâmina de vidro contendo a cola.Depois de montar os myofibrils, para medir o comprimento do sarcomere, mova o piezo e/ou a sonda de força para definir o comprimento inicial de sarcomere do myofibril para 2,5 micrômetros. Usando a função do vaso do software do controlador do sistema, meça o comprimento e largura do myofibril. Use o estágio do microscópio para posicionar o myofibril no centro da imagem de vídeo e esticar um retângulo de um lado do myofibril para o outro, tomando o cuidado de incluir a borda escura das gotículas de cola.Para começar a gravar os dados, clique em iniciar. Após cinco segundos, clique em pausa. O comprimento terá sido gravado.Para medir a largura, gire a câmera 90 graus para ver o contraste da borda do próprio myofibril. Ajuste o retângulo e clique em iniciar a gravação dos dados. Após cinco segundos, clique em pausa.A largura terá sido registrada. Para posicionar o vidro, use a ocular e o manipulador para mover cuidadosamente o vidro em direção ao myofibril. Alinhe o canal superior do vidro com o myofibril e realize um passo rápido para verificar a posição.Ligue o fluxo relaxante de fundo para verificar o alinhamento do vidro theta e use uma alavanca de válvula Luer para ligar a entrada da câmara de fluxo. Em seguida, para começar a drenar a câmara de fluxo e evitar o transbordamento da câmara de fluxo, ajuste a válvula de bomba de saída para a válvula de banho dois, o modo micro passo para micro, o alvo do êmbolo para 48.000, e a velocidade do êmbolo para 38 a 40. Para medir a taxa de reurbanização da tensão, calcule o movimento piezo necessário para afrouxar o myofibril em 15% e inserir esse valor no gerador de sinal.Clique em retomar para continuar registrando os dados e abrir válvulas um e seis para iniciar os fluxos da solução relaxante e as diferentes concentrações de cálcio através do vidro, respectivamente. Selecione o intervalo de reset no interferômetro para redefinir o intervalo do interferômetro para que a força da linha de base seja zero volts. Quando o traço de força estiver estável, realize o vidro passo rápido com um tamanho de passo de 100 micrômetros.Quando o planalto de força for atingido, realize o encurtamento reesticuante com o piezo. Um traço de relaxamento de ativação será gravado. Clique em pausa.Para executar um trecho em forma de passo, clique em iniciar e redefinir o alcance do interferômetro para que a força da linha de base seja zero volts. Realize um trecho em passo com o gerador de sinal. Quando o trecho estiver pronto, use o piezo para encurtar o miofibril ao comprimento da folga.Em seguida, pressione pausar e parar e salvar os dados. Aqui, traços de força de um experimento de força ativa com um myofibril isolado de músculos do quadríceps humanos saudáveis são mostrados. O myofibril foi ativado cinco vezes com soluções com concentrações variadas de cálcio, com uma força máxima média de todos os myofibrils de aproximadamente 123 mililitros por milímetro quadrado.A construção de uma curva de concentração de cálcio de força das forças do planalto alcançada durante cada ativação em cada uma das cinco curvas de cálcio permite o cálculo da concentração de cálcio em 50% da produção de força máxima. Como ilustrado nesta análise representativa, os myofibrils podem ser tratados com múltiplos compostos em um único experimento para responder a perguntas adicionais sobre o tipo myofibril. A força ativa e o comprimento do sarcomere também podem ser medidos para permitir o cálculo das taxas de redesenvolvimento, ativação e relaxamento.A subida acentuada mostrada na caixa vermelha pontilhada é causada tanto pela viscosidade quanto pela elasticidade. O planalto se assemelha apenas ao componente elástico. Como a viscosidade resiste à tensão linearmente, a força caiu depois que a cepa foi removida.Ao posicionar o vidro, certifique-se de alinhá-lo corretamente com o miofibril. Caso contrário, a solução de ativação pode vir entre a fibra óptica e o cantilever da sonda de força e isso faz com que artefatos ocorram em seus dados. Além disso, o myofibril pode não ser ativado corretamente.Este método de perfusão também é adequado para determinar o tipo de fibra muscular do miofibril. Por exemplo, você pode primeiro perfumar o myofibril com uma solução normal de cálcio seguida de perfusão dessa mesma solução, mas depois adicionar um composto específico de aumento de força do tipo fibra muscular.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adultas e embrionárias Cultura Microexplant Músculo Esquelético e isolamento de células-tronco musculares

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Biologia

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Isolamento mitocondrial do músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Purificação de Progenitores do músculo esquelético

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedimentos para Rat<em&gt; In situ</em&gt; Propriedades contrátil do músculo esquelético

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Medição de força durante a contração para avaliar a função muscular em larvas do peixe

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolamento de mitocôndrias intactas de Músculo Esquelético por centrifugação diferencial para medições Respirometria de alta resolução

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

Imunolabellagem de degeneração da miofibra em biópsias musculares

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolamento e Caracterização de Exossomos de Fibroblastos de Músculo Esquelético

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Coleta de Biópsias Musculares Esqueléticas do Compartimento Superior do Musculus Tibialis Anterior para Avaliação Mecânica

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...