Name: isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer
Uploaded: 2020-05-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer at JoVE.com

Этот проект финансировался AFM-Telethon и Фондом «Строительная сила для Немалин Миопати». Авторы хотели бы отметить создателя продуктов, упомянутых в этой статье, IONOptix Inc.

Протокол для получения биопсии человека был одобрен институциональным советом по обзору в Медицинском центре Университета VU (#2014/396) и письменное информированное согласие было получено от испытуемых. Протокол для получения биопсии мышц животных был одобрен местным комитетом по этике ?...

<ol>
	<li>Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcomere+Dysfunction+in+Nemaline+Myopathy.">Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy.</a> J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).</li><li>Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+and+passive+forces+of+isolated+myofibrils+from+cardiac+and+fast+skeletal+muscle+of+the+frog.">Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog.</a> Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).</li><li>Kulke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+major+source+of+myofibrillar+stiffness+in+Drosophila+indirect+flight+muscle.">a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle.</a> Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).</li><li>Stehle, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isometric+force+kinetics+upon+rapid+activation+and+relaxation+of+mouse,+guinea+pig+and+human+heart+muscle+studied+on+the+subcellular+myofibrillar+level.">Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level.</a> Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).</li><li>Ribeiro, P. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+Effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Joureau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+sarcomere+contractility+contributes+to+muscle+weakness+in+ACTA1-related+nemaline+myopathy+(NEM3).">Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3).</a> Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).</li><li>de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+perfusion+shows+intersarcomere+dynamics+within+single+skeletal+muscle+myofibrils.">Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).</li><li>Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+force+enhancement+is+regulated+by+titin+in+skeletal+and+cardiac+myofibrils.">Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils.</a> Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).</li><li>Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+non-cross-bridge+forces+after+stretch+of+activated+striated+muscle+is+related+to+titin+isoforms.">The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).</li><li>Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+system+for+probing+cantilever+deflections+parallel+to+a+sample+surface.">Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface.</a> Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).</li><li>Chavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferrule-top+nanoindenter:+an+optomechanical+fiber+sensor+for+nanoindentation.">Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation.</a> Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).</li><li>Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metrological+approach+for+the+calibration+of+force+transducers+with+interferometric+readout.">A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout.</a> Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).</li><li>van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+dynamic+mechanical+analysis+for+heterogeneous+soft+matter+using+ferrule-top+indentation.">Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation.</a> Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KBTBD13+is+an+actin-binding+protein+that+modulates+muscle+kinetics.">KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2019).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-specific+effects+on+thin+filament+length+in+thin+filament+myopathy.">Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy.</a> Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).</li><li>Ottenheijm, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleting+exon+55+from+the+nebulin+gene+induces+severe+muscle+weakness+in+a+mouse+model+for+nemaline+myopathy.">Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy.</a> Brain. 136, 1718-1731 (2013).</li><li>Ribeiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+Myosin-II+Inhibitor+(N-benzyl-p-toluene+Sulphonamide,+BTS)+on+Contractile+Characteristics+of+Intact+Fast-twitch+Mammalian+Muscle+Fibres.">Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).</li><li>Stehle, R., Kr&#252;ger, M., Pfitzer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+kinetics+and+individual+sarcomere+dynamics+in+cardiac+myofibrils+after+rapid+Ca(2+)+changes.">Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes.</a> Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).</li><li>Najafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-diastolic+force+pre-activates+cardiomyocytes+and+determines+contractile+force:+role+of+titin+and+calcium.">End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium.</a> Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).</li></ol>

Описан протокол для оценки контрактильной функции миофибрил, изолированных от человеческих или животных скелетных мышечных тканей. Силовое разрешение этой установки было описано ранее Chavan et al.12. Короче говоря, это определяется случайными колебаниями длины полости Фабри-?...

Полосатые мышечные клетки незаменимы для повседневной жизни. Движение конечностей, дыхательная функция и насосное движение сердца зависят от силы, генерируемой мышечными клетками. Скелетная мышца состоит из мышечных фасциклов, содержащих пучки одиночных мышечных волокон(рисунок 1A). Эти мышечные волокна состоят из миофибрил, которые образуются последовательно связанных саркомеров (Рисунок 1B,D). Саркомеры содержат тонкие и толстые нити. Они в основном состоят из цепей молекул актина и миозин, соответственно (Рисунок 1B). Взаимодействия Актин-миозин отвечают за силу генерирующей способности мышц. Пациенты с мутациями в генах, кодирующих саркомерные белки, такие как небулин, актин и тропонин Т, страдают мышечной слабостью из-за контрактнойдисфункции 1.
Качество мышечной контрактности можно изучать на различных уровнях организации, начиная от in vivo целые мышцы для актин-миозин взаимодействия в пробирке подвижности анализов. За последние десятилетия несколько исследовательских групп разработали установки для определения контрактности отдельныхмиофибрил 2,,3,,4,,5,,6,,7,,8,,9,,10. Эти установки основаны на обнаружении изменений в лазерном отклонении от кантилевера (т.е. оптического отклонения пучка), вызванного сокращением миофибриля (подробнее см. Labuda et al.11). Хотя определение контрактной функции миофибриля имеет некоторые ограничения (например, динамика процессов соединения возбуждения и сокращения, которые находятся вверх по течению от миофибрил, отсутствуют), есть несколько преимуществ этого подхода. К ним относятся: 1) способность оценивать актин-миозин взаимодействия в присутствии геометрических ограничений саркомеров; 2) способность оценивать актин-миозин взаимодействия без потенциального путаницы эффекты поврежденных, смежных миофибрил (при измерении контрактности одной мышцы волокон ультраструктурного повреждения и несогласованности миофибрил может способствовать нарушению контрактности) (Рисунок 1D); 3) малый диаметр миофибринов (1 мкм, рисунок 2A) и отсутствие мембран позволяют почти мгновенное распространение кальция в саркомеры. Кроме того, если структурные повреждения присутствуют в миофибрилях, они, вероятно, ломаются во время их изоляции или во время эксперимента. Таким образом, оценка миофибриль контрактности является элегантным методом для изучения основных механизмов сокращения мышц и понять, являются ли нарушенные актин-миозин взаимодействия являются основной причиной мышечных заболеваний, вызванных мутациями в саркомерных белков.
Этот протокол представляет собой недавно разработанную установку для определения контрактности миофибриллов, включающих силовой зонд кантилевера с нано-ньютоновским разрешением (т.е. Optiforce). Этот силовой зонд основан на принципе интерферометрии. Интерферометрия позволяет использовать относительно жесткие кантилеверы. Это позволяет измерить силу с небольшим отклонением кантилевера, приближаясь к изометрическим сокращениям миофибриля. Зонд позволяет оценить низкие пассивные и активные силы, которые производятся одним миофибрилем, изолированным от различных биопсий мышц, в том числе от человека, с высоким соотношением сигнала к шуму. Оптический силовой зонд кантилевера, включенный в эту установку, основан на интерферометреФабри-Перо 12. Интерферометр обнаруживает небольшие смещения между оптическим волокном и позолоченным кантилевером, установленным на ферруле(рисунок 3). Зазор между оптическим волокном и кантилевером называется полостью Фабри-Перот. Миофибрили устанавливаются между зондом и пьезо-мотором с использованием двух стеклянных волокон, покрытых клеем. Сила, производимая миофибрилем, может быть математически получена из данных интерферометра. Интерферометрия основана на суперпозиции или вмешательстве двух или более волн (в этой установке три световые волны). Лазерный свет длиной волны от 1528,77 до 1563,85 нм излучается из интерферометра и направляется через оптическое волокно. В зонде свет отражается 1) на стыке оптического волокна и среды(рисунок 3A); 2) на интерфейсе среды и кантилевера(рисунок 3B); и 3) на стыке металлического и золотого покрытия кантилевера(рисунок 3C). Отражение в интерфейсе А и В зависит от рефракционногоиндекса (n)среды, в которую погружается зонд. Свет, состоящий из трех наложенных отражений, возвращается к фотодиоду в интерферометре. Фотодиод измеряет интенсивность света, что является результатом интерференционной картины трех наложенных отражений. Когда контрактная сила генерируется путем активации или растяжения миофибриля, миофибриль тянет на кантилевер. Это движение изменяет размер полости(d) и, следовательно, количество длин волн, которые вписываются в полость. Свет, отраженный в кантилевере, будет иметь другую фазу, что приведет к другой схеме помех. Фотодиод записывает это изменение интенсивности интерференционной модели как изменение Вольтов. Впоследствии, myofibril силовой генерации рассчитывается из этого изменения, с учетом жесткости кантилевера. Силовой зонд откалиброван производителем, нажав кончик монтажной иглы, прикрепленный к свободной передаче конца кантилевера, против весовой шкалы, сохраняя при этом изгиб кантилевера, равный кратной длине волны лазерасчитывания 13. Таким образом, интерферометрия является весьма чувствительным методом обнаружения небольших изменений расстояния, позволяющим измерять силы с нано-ньютоновым разрешением. Это разрешение позволяет оценить производство миофибрилляции с высоким соотношением сигнала к шуму. В то время как традиционная интерферометрия ограничивает диапазон измерений линейной частью кривой интерференции, используя усилитель блокировки и модуляцию длины волны лазера,преодолевает это ограничение 14. Это более подробно описано в разделе обсуждения.
Для измерения миофибриля активного напряжения, быстро шаг перфузии система была включена подвергать миофибриля кальция решений(рисунок 4A). Система быстрой перфузии позволяет вносить изменения в раствор в пределах 10 мс. Из-за их малого диаметра, диффузии кальция в миофибриль почти мгновенно. Следовательно, эта система особенно подходит для измерения скорости связывания актин-миозин во время активации и высвобождения во время релаксации. Скорость активации (kACT) и релаксации (kREL) может быть определена по кривым активации релаксации. Кроме того, подвергая миофибрилляции кальция решения повышения концентрации, сила кальция отношения и чувствительность кальция может быть определена.
Кроме того, двигатель длины пьезо позволяет быстро растягиваться и сокращать миофибриль. Это дает возможность изучить вязко-вязкие свойства (т.е. пассивное напряжение) миофибриля, а также выполнение быстрого сокращения и рестайка миофибриля для определения скорости редевелопмента напряжения (kTR). Параметры, извлеченные из экспериментов с активным и пассивным напряжением, могут быть изменены генными мутациями в саркомерном белке.
Эта специально созданная установка была использована для измерения активных и пассивных контрактильные характеристики миофибрил, изолированных от здоровых человеческих, терпеливых и мышиных скелетных мышц.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio Spec Products, Inc.</td>
			<td>985370-XL</td>
			<td>To isolate myofibrils</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom coded</td>
			<td></td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Includes Labview program to control over serial connection; To control valves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Aluminum tissue chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To control the valves; Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td>MCS100</td>
			<td>To record sarcomere length</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Force probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Data registration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-200</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529265</td>
			<td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78471</td>
			<td>Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TE-63-1.0-1.3</td>
			<td>To cool the tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20736652</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20739263</td>
			<td>Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2441081</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>TG150-4</td>
			<td>To perfuse the tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 PC for IonWizard and 1 PC for other software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer

Полосатые мышечные клетки незаменимы для активности человека и животных. Одиночные мышечные волокна состоят из миофибрил, которые состоят из последовательно связанных саркомеров, самых маленьких контрактильные единицы в мышцах. Саркомерная дисфункция способствует мышечной слабости у пациентов с мутациями в генах, кодирующих саркомерные белки. Изучение механики миофибриля позволяет оценить актин-миозин взаимодействия без потенциального путаницы эффекты поврежденных, смежных миофибрил при измерении контрактности одного мышечного волокна. Ультраструктурное повреждение и несогласованность миофибрил может способствовать нарушению контрактности. Если структурные повреждения присутствуют в миофибрилях, они, вероятно, ломаются во время процедуры изоляции или во время эксперимента. Кроме того, исследования в миофибрилях дают оценку актин-миозин взаимодействий в присутствии геометрических ограничений саркомеров. Например, измерения в миофибрилях могут выяснить, является ли дисфункция миофибриллярной является основным следствием мутации в саркомерных белках. Кроме того, перфузия с растворами кальция или соединений почти мгновенно из-за малого диаметра миофибриля. Это делает миофибриль в высшей степени подходящим для измерения темпов активации и релаксации во время силового производства. В протоколе, описанном в настоящем документе, используется оптический силовой зонд, основанный на принципе интерферометра Фабри-Перо, способного измерять силы в диапазоне нано-ньютона, в сочетании с двигателем длины пьезо и быстроступной системой перфузии. Эта установка позволяет изучать механику миофибриля с высоким разрешением измерения силы.

Следы данных были записаны и открыты с помощью программного обеспечения контроллера системы (см. таблицу материалов). Полные следы или выбранные сегменты были экспортированы в буфер обмена или текстовый файл для дальнейшего анализа с желаемым программным обеспечением. Клапа?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer at JoVE.com

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Здесь представлен протокол для оценки контрактильные свойства полосатых мышечных миофибриллей с нано-ньютоновым разрешением. Протокол использует установку с интерферометрией на основе, оптический зонд силы. Эта установка генерирует данные с высоким соотношением сигнала к шуму и позволяет оценить контрактильной кинетики миофибрил.

Изолировать миофибрили от биопсии скелетных мышц и определения контрактильной функции с помощью нано-ньютоновского разрешения силы трансдуцера

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Оценка контрактивных свойств миофибрил, изолированных от полосатых мышц, может быть использована для определения того, является ли саркомерная дисфункция основной причиной мышечной слабости из-за мутаций в саркомерных белках. Этот метод может быть использован для получения данных с очень высоким соотношением сигнала к шуму с разрешением нанонютон. Этот протокол также подходит для измерения контрактности в промеабилизированных кардиомиоцитов.Имейте в виду, что сила превлододер очень хрупкая. Поэтому при удалении клея из монтажной иглы или при склеивания миофибриля, вы должны иметь твердую руку, много практики, и много терпения. Перед монтажом ткани поместите стержень гомогенизатора в трубку, содержащую мышечную ткань.Сохраняя трубку на льду, вращаем ротор в течение 15 секунд на скорости пять. В конце гомогенизации перенесите 50 микролитров полученной подвески миофибриля и 250 микролитров расслабляющего раствора на поли-HEMA покрытием слайда в тканевой ванне. Накройте ванну крышкой, чтобы защитить смесь от пыли и ждать от 5 до 10 минут, чтобы миофибриль упасть на дно капли.Во время погружения миофибрилов, тепло Shellac этанола клей при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 30 до 60 секунд, прежде чем добавить около шести микролитров клея на неокрашенные стеклянные слайды. Неоднократно окуните кончик каждой монтажной иглы в клей до тех пор, пока не будет виден слой клея. Затем используйте микро-манипуляторы для перемещения зонда и пьезо вертикально, чтобы освободить место для ванны ткани на стадии микроскопа и удалить стеклянную горку, содержащую клей.После монтажа миофибриль, чтобы измерить длину саркомера, перемести пьезо и/или силовой зонд, чтобы установить начальную длину саркомера миофибриля до 2,5 микрометров. Используя функцию сосуда программного обеспечения системного контроллера, измерьте длину и ширину миофибриля. Используйте стадию микроскопа, чтобы распоить миофибриль в центре видео изображения и растянуть прямоугольник с одной стороны миофибриля на другую, заботясь о том, чтобы включить темный край клеевых капель.Чтобы начать запись данных, нажмите кнопку "Начать". Через пять секунд нажмите паузу. Длина будет записана.Чтобы измерить ширину, поверните камеру на 90 градусов, чтобы посмотреть контраст края самого миофибриля. Отрегулируйте прямоугольник и нажмите кнопку, чтобы начать запись данных. Через пять секунд нажмите паузу.Ширина будет записана. Чтобы распоить стекло theta, используйте окуляр и манипулятор, чтобы тщательно переместить стекло theta к миофибрилу. Выровняйте верхний канал theta стекла с миофибрилем и выполнить быстрый шаг, чтобы проверить положение.Включите фоновый расслабляющий поток, чтобы проверить выравнивание теты стекла и использовать рычаг клапана Luer, чтобы включить приток камеры потока. Затем, чтобы начать осушеть камеру потока и предотвратить переполнение камеры потока, установите клапан насоса оттока для клапана ванны два, микро-ступенчатый режим до микро, поршень цели до 48000, и скорость поршеня до 38 до 40. Чтобы измерить скорость редевелопмента напряжения, рассчитайте движение пьезо, необходимое для ослабления миофибриля на 15% и введите это значение в сигнальный генератор.Нажмите резюме, чтобы продолжить запись данных и открыть клапаны один и шесть, чтобы начать потоки расслабляющий раствор и различные концентрации кальция через стекло теты соответственно. Выберите диапазон сброса на интерферометре, чтобы сбросить диапазон интерферометра так, чтобы базовая сила была равна нулю вольт. Когда след силы стабилен, выполните theta стекло быстро шаг с размером шага 100 микрометров.Когда сила плато будет достигнута, выполнить сокращение повторно растянуть с пьезо. Будет записан след релаксации активации. Нажмите паузу.Для выполнения шаг-мудрый стрейч, нажмите кнопку запуска и сбросить диапазон интерферометра так, что базовая сила равна нулю вольт. Выполните шаг-мудрый стрейч с генератором сигнала. Когда участок закончен, используйте пьезо, чтобы сократить миофибриль до вялой длины.Затем нажмите паузу и остановитесь и сохраните данные. Здесь показаны следы силы активного силового эксперимента с миофибрилью, изолированной от здоровых человеческих четырехглавых мышц. Миофибриль активировался пять раз с растворами с различной концентрацией кальция, со средней максимальной силой всех миофибриллей около 123 миллиневтонов на квадратный миллиметр.Конструкция кривой концентрации силы кальция из сил плато, достигнутых во время каждой активации в каждой из пяти кривых кальция, позволяет вычислить концентрацию кальция на уровне 50% от максимальной силы производства. Как показано в этом репрезентативном анализе, миофибрили можно лечить несколькими соединениями в одном эксперименте, чтобы ответить на дополнительные вопросы о типе миофибриля. Активная сила и длина саркомера также могут быть измерены, чтобы позволить расчет темпов реконструкции, активации и релаксации.Крутой подъем, показанный в пунктирной красной коробке, вызван как вязкостью, так и эластичностью. Плато напоминает только эластичный компонент. Поскольку вязкость сопротивляется деформации линейно, сила упала после того, как напряжение было удалено.При позиционировании theta стекла, убедитесь, что вы выровнять его должным образом с myofibril. В противном случае, решение активации может прийти между оптическим волокном и кантилевером силового зонда, и это приводит к тому, что артефакты происходят в ваших данных. Кроме того, миофибриль не может активировать должным образом.Этот метод перфузии также подходит для определения типа мышечного волокна миофибриля. Например, вы можете сначала пронизать миофибриль с нормальным раствором кальция с последующим перфузией того же раствора, но затем добавить специфическое форс-повышательное соединение типа мышечного волокна.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Взрослые и эмбриональные скелетных мышц Microexplant культуры и выделение скелетных мышц стволовых клеток

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Митохондриальная Изоляция от скелетных мышц

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Очистка прародителей из скелетных мышц

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Процедуры для Крысы<em&gt; На месте</em&gt; Скелетных мышц сократительные свойства

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Выделение и культура Индивидуальные мышечных волокон и их сателлитные клетки от взрослых скелетных мышц

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Измерение силы при сжатии для оценки функции мышц в личинки данио

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Выделение неповрежденном Митохондрии из скелетных мышц с помощью дифференциального центрифугирования для измерения респирометрии высокого разрешения

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

Иммуномаркировка дегенерации миофибра при биопсии мышц

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Выделение и характеристика экзосом фибробластов скелетных мышц

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Коллекция скелетных биопсий мышц из Высшего отсека человеческого мускулуса Tibialis перед механической оценкой

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...