Name: isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer
Uploaded: 2020-05-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer at JoVE.com

Este proyecto fue financiado por AFM-Telethon y A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies. Los autores desean reconocer al creador de los productos mencionados en este artículo, IONOptix Inc.

El protocolo para la obtención de biopsias humanas fue aprobado por la junta de revisión institucional del Centro Médico de la Universidad VU (#2014/396) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los sujetos. El protocolo para la obtención de biopsias musculares animales fue aprobado por el comité local de ética animal de la Universidad VU (AVD114002016501)
1. Preparación y aislamiento miofibril
NOTA: Utilice métodos previamente descritos para gli...

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	<li>Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcomere+Dysfunction+in+Nemaline+Myopathy.">Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy.</a> J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).</li><li>Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+and+passive+forces+of+isolated+myofibrils+from+cardiac+and+fast+skeletal+muscle+of+the+frog.">Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog.</a> Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).</li><li>Kulke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+major+source+of+myofibrillar+stiffness+in+Drosophila+indirect+flight+muscle.">a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle.</a> Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).</li><li>Stehle, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isometric+force+kinetics+upon+rapid+activation+and+relaxation+of+mouse,+guinea+pig+and+human+heart+muscle+studied+on+the+subcellular+myofibrillar+level.">Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level.</a> Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).</li><li>Ribeiro, P. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+Effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Joureau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+sarcomere+contractility+contributes+to+muscle+weakness+in+ACTA1-related+nemaline+myopathy+(NEM3).">Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3).</a> Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).</li><li>de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+perfusion+shows+intersarcomere+dynamics+within+single+skeletal+muscle+myofibrils.">Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).</li><li>Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+force+enhancement+is+regulated+by+titin+in+skeletal+and+cardiac+myofibrils.">Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils.</a> Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).</li><li>Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+non-cross-bridge+forces+after+stretch+of+activated+striated+muscle+is+related+to+titin+isoforms.">The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).</li><li>Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+system+for+probing+cantilever+deflections+parallel+to+a+sample+surface.">Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface.</a> Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).</li><li>Chavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferrule-top+nanoindenter:+an+optomechanical+fiber+sensor+for+nanoindentation.">Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation.</a> Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).</li><li>Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metrological+approach+for+the+calibration+of+force+transducers+with+interferometric+readout.">A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout.</a> Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).</li><li>van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+dynamic+mechanical+analysis+for+heterogeneous+soft+matter+using+ferrule-top+indentation.">Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation.</a> Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KBTBD13+is+an+actin-binding+protein+that+modulates+muscle+kinetics.">KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2019).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-specific+effects+on+thin+filament+length+in+thin+filament+myopathy.">Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy.</a> Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).</li><li>Ottenheijm, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleting+exon+55+from+the+nebulin+gene+induces+severe+muscle+weakness+in+a+mouse+model+for+nemaline+myopathy.">Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy.</a> Brain. 136, 1718-1731 (2013).</li><li>Ribeiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+Myosin-II+Inhibitor+(N-benzyl-p-toluene+Sulphonamide,+BTS)+on+Contractile+Characteristics+of+Intact+Fast-twitch+Mammalian+Muscle+Fibres.">Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).</li><li>Stehle, R., Kr&#252;ger, M., Pfitzer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+kinetics+and+individual+sarcomere+dynamics+in+cardiac+myofibrils+after+rapid+Ca(2+)+changes.">Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes.</a> Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).</li><li>Najafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-diastolic+force+pre-activates+cardiomyocytes+and+determines+contractile+force:+role+of+titin+and+calcium.">End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium.</a> Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).</li></ol>

Descrito es un protocolo para evaluar la función contráctil de los miofibrils aislados de los tejidos musculares esqueléticos humanos o animales. La resolución de fuerza de esta configuración ha sido descrita anteriormente por Chavan et al.12. En resumen, está determinada por las fluctuaciones aleatorias de la longitud de la cavidad Fabry-Pérot formada entre la fibra de detección y el voladizo, que producen la parte dominante del ruido a la salida de la lectura (expresada en V) que, multip...

Las células musculares estriadas son indispensables para las actividades de la vida diaria. El movimiento de las extremidades, la función respiratoria y el movimiento de bombeo del corazón dependen de la fuerza generada por las células musculares. El músculo esquelético consiste en fascículos musculares que contienen haces de fibras musculares individuales (Figura 1A). Estas fibras musculares se componen de miofibrils, que están formados por sarcomeres conectados en serie (Figura 1B,D). Los sarcomeres contienen filamentos delgados y gruesos. Estos consisten principalmente en cadenas de moléculas de actina y miosina, respectivamente (Figura 1B). Las interacciones actin-miosina son responsables de la capacidad de generación de fuerza del músculo. Los pacientes con mutaciones en genes que codifican proteínas sarcoméricas, como la neblina, la actina y la troponina T, sufren de debilidad muscular debido a la disfunción contráctil1.
La calidad de la contractilidad muscular se puede estudiar en varios niveles de organización, que van desde músculos enteros in vivo a interacciones actina-miosina en ensayos de motilidad in vitro. Durante las últimas décadas, varios grupos de investigación han desarrollado configuraciones para determinar la contractilidad de las miofibrils individuales2,3,4,5,6,7,8,9,10. Estas configuraciones se basan en la detección de cambios en la desviación láser de un voladizo (es decir, desviación de haz óptico) causada por la contracción del myofibril (para más detalles, véase Labuda et al.11). Aunque la determinación de la función contráctil de myofibrils tiene algunas limitaciones (por ejemplo, la dinámica de los procesos de acoplamiento de excitación-contracción que están aguas arriba de los miofibrils son faltantes), hay múltiples ventajas a este enfoque. Estos incluyen: 1) la capacidad de evaluar las interacciones actin-miosina en presencia de las limitaciones geométricas de los sarcomeres; 2) la capacidad de evaluar las interacciones entre la actina y la miosina sin posibles efectos confusos de los miofibriles adyacentes dañados (al medir la contractilidad de las fibras musculares individuales daño ultraestructural y la desalineación de myofibrils podría contribuir a la contractilidad deteriorada) (Figura 1D); 3) el pequeño diámetro de las miofibriles (1 m, Figura 2A)y la falta de membranas permiten la difusión casi instantánea del calcio en los sarcomeres. Además, si hay daños estructurales en los miofibrils, es probable que se rompan durante su aislamiento o durante el experimento. Por lo tanto, evaluar la contractilidad de myofibril es un método elegante para estudiar los mecanismos básicos de la contracción muscular y para entender si las interacciones alteradas actina-miosina son la causa principal de la enfermedad muscular causada por mutaciones en proteínas sarcoméricas.
Este protocolo presenta una nueva configuración para determinar la contractilidad de los myofibrils que incorporan una sonda de fuerza en voladizo con resolución nano-Newton (es decir, Optiforce). Esta sonda de fuerza se basa en el principio de interferometría. La interferometría permite el uso de voladizos relativamente rígidos. Esto hace posible medir la fuerza con poca desviación del voladizo, acercándose a las contracciones isométricas del miofibril. La sonda permite la evaluación de fuerzas pasivas y activas bajas producidas por un solo miofibril aislado de diferentes biopsias musculares, incluidas las de sujetos humanos, con una alta relación señal-ruido. La sonda de fuerza en voladizo óptico incorporada en esta configuración se basa en un interferómetro Fabry-Pérot12. El interferómetro detecta pequeños desplazamientos entre una fibra óptica y un voladizo recubierto de oro montado en una férula (Figura 3). La brecha entre la fibra óptica y el voladizo se llama la cavidad Fabry-Pérot. Las miofibrils se montan entre la sonda y el motor piezoeléctrico utilizando dos fibras de montaje de vidrio recubiertas de pegamento. La fuerza producida por el myofibril puede derivarse matemáticamente de los datos del interferómetro. La interferometría se basa en la superposición o interferencia de dos o más ondas (en esta configuración tres ondas de luz). La luz láser con una longitud de onda entre 1.528.77–1.563.85 nm se emite desde el interferómetro y se envía a través de la fibra óptica. En la sonda, la luz se refleja 1) en la interfaz entre la fibra óptica y el medio (Figura 3A); 2) en la interfaz del medio y el voladizo (Figura 3B); y 3) en la interfaz entre el revestimiento metálico y dorado del voladizo(Figura 3C). La reflexión en la interfaz A y B depende del índice de refracción (n) del medio en el que se sumerge la sonda. La luz, que consta de los tres reflejos superpuestos, vuelve a un fotodiodo en el interferómetro. El fotodiodo mide la intensidad de la luz, que es el resultado del patrón de interferencia de los tres reflejos superpuestos. Cuando la fuerza contráctil se genera activando o estirando un miofibril, el miofibril tira del voladizo. Este movimiento cambia el tamaño de la cavidad (d) y, en consecuencia, el número de longitudes de onda que caben en la cavidad. La luz reflejada en el voladizo tendrá una fase diferente, lo que resulta en un patrón de interferencia diferente. El fotodiodo registra este cambio de la intensidad del patrón de interferencia como un cambio en Voltios. Posteriormente, la generación de la fuerza miofibril se calcula a partir de este cambio, teniendo en cuenta la rigidez en voladizo. La sonda de fuerza es calibrada por el fabricante empujando la punta de la aguja de montaje, unida al extremo de entrega libre del voladizo, contra una báscula de pesaje manteniendo la flexión del voladizo igual a un múltiplo de la longitud de onda del láser de lectura13. Por lo tanto, la interferometría es un método altamente sensible para detectar pequeños cambios en la distancia, lo que permite medir las fuerzas con resolución nano-Newton. Esta resolución permite evaluar la producción de fuerza miofibrilar con una alta relación señal-ruido. Mientras que la interferometría tradicional limita el rango de mediciones a la parte lineal de la curva de interferencia, el uso de un amplificador de bloqueo y la modulación de la longitud de onda láser supera esta limitación14. Esto se explica con más detalle en la sección de discusión.
Para medir la tensión activa de myofibril, se incorporó un sistema de perfusión de paso rápido para exponer el myofibril a soluciones de calcio (Figura 4A). El sistema de perfusión de paso rápido permite que se produzcan cambios en la solución en un plazo de 10 ms. Debido a su pequeño diámetro, la difusión de calcio en los miofibrils es casi instantánea. Por lo tanto, este sistema es particularmente adecuado para medir las tasas de unión actin-miosina durante la activación y liberación durante la relajación. La velocidad de activación (kACT) y la relajación (kREL) se pueden determinar a partir de las curvas de activación-relajación. Además, al exponer los miofibrils a soluciones de calcio de concentración creciente, se puede determinar la relación fuerza-calcio y la sensibilidad al calcio.
Además, un motor de longitud piezoeléctrica permite un rápido estiramiento y acortamiento del myofibril. Esto ofrece la posibilidad de estudiar las propiedades viscoelásticas (es decir, la tensión pasiva) del myofibril, así como realizar un rápido acortamiento y desarme de la miofibril para determinar la tasa de reurbanización de tensión (kTR). Los parámetros recuperados de experimentos de tensión activa y pasiva pueden ser alterados por mutaciones genéticas en una proteína sarcomerica.
Esta configuración personalizada se utilizó para medir las características contráctiles activas y pasivas de los myofibrils aislados del músculo esquelético humano, paciente y ratón sano.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio Spec Products, Inc.</td>
			<td>985370-XL</td>
			<td>To isolate myofibrils</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom coded</td>
			<td></td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Includes Labview program to control over serial connection; To control valves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Aluminum tissue chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To control the valves; Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td>MCS100</td>
			<td>To record sarcomere length</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Force probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Data registration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-200</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529265</td>
			<td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78471</td>
			<td>Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TE-63-1.0-1.3</td>
			<td>To cool the tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20736652</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20739263</td>
			<td>Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2441081</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>TG150-4</td>
			<td>To perfuse the tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 PC for IonWizard and 1 PC for other software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer

Las células musculares estriadas son indispensables para la actividad de los seres humanos y los animales. Las fibras musculares individuales se componen de miofibrils, que consisten en sarcomeres ligados en serie, las unidades contráctiles más pequeñas en el músculo. La disfunción sarcomerica contribuye a la debilidad muscular en pacientes con mutaciones en genes que codifican para proteínas sarcoméricas. El estudio de la mecánica de myofibril permite la evaluación de las interacciones actin-miosina sin posibles efectos confusos de myofibriles dañados, adyacentes al medir la contractilidad de fibras musculares individuales. El daño ultraestructural y la desalineación de los myofibrils podrían contribuir a la contractilidad deteriorada. Si hay daños estructurales en los miofibrils, es probable que se rompan durante el procedimiento de aislamiento o durante el experimento. Además, los estudios en miofibrils proporcionan la evaluación de las interacciones actin-miosina en presencia de las limitaciones geométricas de los sarcomeres. Por ejemplo, las mediciones en miofibrils pueden dilucidar si la disfunción miofibrilar es el efecto principal de una mutación en una proteína sarcomérica. Además, la perfusión con soluciones de calcio o compuestos es casi instantánea debido al pequeño diámetro del myofibril. Esto hace que las miofibriles sean eminentemente adecuadas para medir las tasas de activación y relajación durante la producción de fuerza. El protocolo descrito en este artículo emplea una sonda de fuerza óptica basada en el principio de un interferómetro Fabry-Pérot capaz de medir fuerzas en el rango nano-Newton, acoplado a un motor de longitud piezoeléctrica y un sistema de perfusión de paso rápido. Esta configuración permite el estudio de la mecánica myofibril con mediciones de fuerza de alta resolución.

Los seguimientos de datos se registraron y se abrieron con el software del controlador del sistema (consulte Tabla de materiales). Las trazas completas o los segmentos seleccionados se exportaron al portapapeles o al archivo de texto para su posterior análisis con el software deseado. Las válvulas para controlar el flujo de las diferentes soluciones se cambiaron con software personalizado o manualmente. Se utilizó un script MATLAB personalizado para analizar las tasas de activación, reurbanización d...

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Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Aquí se presenta un protocolo para evaluar las propiedades contráctiles de los miofibriles musculares estriados con resolución nano-Newton. El protocolo emplea una configuración con una sonda de fuerza óptica basada en interferometría. Esta configuración genera datos con una alta relación señal-ruido y permite la evaluación de la cinética contráctil de myofibrils.

Aislamiento de myofibrils de biopsias de músculo esquelético y determinación de la función contráctil con un transductor de fuerza de resolución Nano-Newton

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

La evaluación de las propiedades contráctiles de las miofibriles aisladas del músculo estriado se puede utilizar para determinar si la disfunción del sarcomere es una causa primaria de debilidad muscular debido a mutaciones en las proteínas sarcoméricas. Esta técnica se puede utilizar para adquirir datos con una relación señal-ruido muy alta con resolución nanonewton. Este protocolo también es adecuado para medir la contractilidad en cardiomiocitos permeabilizados.Tenga en cuenta que el transductor de fuerza es muy frágil. Así que al quitar el pegamento de la aguja de montaje o al pegar un myofibril, es necesario tener una mano firme, mucha práctica, y mucha paciencia. Antes de montar el tejido, coloque una varilla homogeneizadora en el tubo que contiene el tejido muscular.Manteniendo el tubo en hielo, gire el rotor durante 15 segundos a la velocidad cinco. Al final de la homogeneización, transfiera 50 microlitros de la suspensión myofibril resultante y 250 microlitros de solución relajante a un tobogán recubierto de poli-HEMA en un baño de tejido. Cubra el baño con una tapa para proteger la mezcla del polvo y espere de 5 a 10 minutos para permitir que las miofibrils se hundan hasta el fondo de la gota.Durante el hundimiento de los myofibrils, calienta Shellac un pegamento de etanol a 65 grados Celsius durante 30 a 60 segundos antes de añadir unos seis microlitros de pegamento en un portaobjetos de vidrio sin recubrimiento. Sumerja repetidamente la punta de cada aguja de montaje en el pegamento hasta que una capa de pegamento sea visible. A continuación, utilice micro-manipuladores para mover la sonda y el piezo verticalmente para hacer espacio para el baño de tejido en la etapa del microscopio y eliminar el portaobjetos de vidrio que contiene el pegamento.Después de montar las miofibriles, para medir la longitud de la sarcomere, mueva el piezo y/o la sonda de fuerza para establecer la longitud inicial de sarcomere del miofibril a 2,5 micrómetros. Usando la función de recipiente del software del controlador del sistema, mida la longitud y la anchura del myofibril. Utilice la etapa del microscopio para colocar el myofibril en el centro de la imagen de vídeo y estirar un rectángulo de un lado del myofibril al otro, teniendo cuidado de incluir el borde oscuro de las gotas de pegamento.Para comenzar a grabar los datos, haga clic en Iniciar. Después de cinco segundos, haga clic en pausar. La longitud se habrá grabado.Para medir la anchura, gire la cámara 90 grados para ver el contraste del borde del propio myofibril. Ajuste el rectángulo y haga clic en comenzar a grabar los datos. Después de cinco segundos, haga clic en pausar.El ancho se habrá grabado. Para colocar el cristal theta, utilice el ocular y el manipulador para mover cuidadosamente el vidrio theta hacia el myofibril. Alinee el canal superior del cristal theta con el myofibril y realice un paso rápido para comprobar la posición.Encienda el flujo relajante de fondo para comprobar la alineación del vidrio theta y utilice una palanca de válvula Luer para encender la entrada de la cámara de flujo. A continuación, para comenzar a drenar la cámara de flujo y evitar el desbordamiento de la cámara de flujo, ajuste la válvula de la bomba de salida a la válvula de baño dos, el modo de micro paso a micro, el objetivo del émbolo a 48.000 y la velocidad del émbolo en 38 a 40. Para medir la tasa de reurbanización de tensión, calcule el movimiento piezoeléctrico necesario para aflojar el miofibril en un 15% e introduzca este valor en el generador de señal.Haga clic en reanudar para continuar registrando los datos y abrir las válvulas uno y seis para iniciar los flujos de la solución relajante y las diferentes concentraciones de calcio a través del vidrio theta respectivamente. Seleccione el rango de reinicio en el interferómetro para restablecer el rango del interferómetro de modo que la fuerza de línea base sea cero voltios. Cuando la traza de fuerza es estable, realice el paso rápido del vidrio theta con un tamaño de paso de 100 micrómetros.Cuando se alcance la meseta de fuerza, realice el estiramiento de acortamiento con el piezo. Se registrará un rastro de relajación de activación. Haga clic en pausar.Para realizar un estiramiento escalonado, haga clic en iniciar y restablezca el rango del interferómetro para que la fuerza de línea base sea cero voltios. Realice un estiramiento escalonado con el generador de señal. Cuando el estiramiento haya terminado, utilice el piezo para acortar el myofibril a la longitud floja.A continuación, pulse pause y stop y guarde los datos. Aquí, se muestran rastros de fuerza de un experimento de fuerza activa con un miofibril aislado del músculo de cuádriceps humanos sanos. El myofibril se activó cinco veces con soluciones con diferentes concentraciones de calcio, con una fuerza máxima media de todos los miofibriles de aproximadamente 123 milinewtons por milímetro cuadrado.La construcción de una curva de concentración de calcio de fuerza a partir de las fuerzas de la meseta alcanzadas durante cada activación en cada una de las cinco curvas de calcio permite calcular la concentración de calcio al 50% de la producción de fuerza máxima. Como se ilustra en este análisis representativo, los myofibrils se pueden tratar con múltiples compuestos en un solo experimento para responder preguntas adicionales sobre el tipo myofibril. La fuerza activa y la longitud del sarcomere también se pueden medir para permitir el cálculo de las tasas de reurbanización, activación y relajación.El fuerte aumento que se muestra en la caja roja punteada es causado tanto por la viscosidad como por la elasticidad. La meseta se asemeja sólo al componente elástico. Como la viscosidad resiste la tensión linealmente, la fuerza cayó después de eliminar la tensión.Al colocar el cristal theta, asegúrese de alinearlo correctamente con el myofibril. De lo contrario, la solución de activación podría entrar entre la fibra óptica y el voladizo de la sonda de fuerza y esto hace que se produzcan artefactos en los datos. Además, es posible que el myofibril no se active correctamente.Este método de perfusión también es adecuado para determinar el tipo de fibra muscular del myofibril. Por ejemplo, primero puede perfumar el myofibril con una solución normal de calcio seguida de perfusión de esa misma solución, pero luego agregar un compuesto específico de mejora de la fuerza de tipo fibra muscular.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adultas y embrionarias del músculo esquelético Cultura Microexplant y aislamiento de células madre de músculo esquelético

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Investigación

Biología

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Purificación de los progenitores del músculo esquelético

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedimientos para la Rata In situ Propiedades contráctiles del músculo esquelético

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Medición de fuerza durante la contracción para evaluar la función muscular en larvas de pez cebra

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Aislamiento de mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial para Medidas respirometría de alta resolución

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

Inmunoetiquetado Desgeneración de miofibra en biopsias musculares

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Colección de biopsias de músculo esquelético del Compartimiento Superior del Musculus Humano Tibialis Anterior para la Evaluación Mecánica

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...