Name: isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer
Uploaded: 2020-05-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer at JoVE.com

Detta projekt finansierades av AFM-Telethon och A Foundation Building Strength för Nemaline Myopathies. Författarna vill erkänna skaparen av de produkter som nämns i denna artikel, IONOptix Inc.

Protokollet för att erhålla mänskliga tarmbiopsier godkändes av den institutionella granskningsnämnden vid VU University Medical Center (#2014/396) och skriftligt informerat samtycke erhölls från försökspersonerna. Protokollet för att erhålla djurmuskelbiopsier godkändes av den lokala djuretiska kommittén vid VU-universitetet (AVD114002016501)
1. Förberedelse och isolering av myofibril
OBS: Använd tidigare beskrivna metoder för att glycerinate biopsier...

<ol>
	<li>Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcomere+Dysfunction+in+Nemaline+Myopathy.">Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy.</a> J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).</li><li>Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+and+passive+forces+of+isolated+myofibrils+from+cardiac+and+fast+skeletal+muscle+of+the+frog.">Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog.</a> Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).</li><li>Kulke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+major+source+of+myofibrillar+stiffness+in+Drosophila+indirect+flight+muscle.">a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle.</a> Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).</li><li>Stehle, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isometric+force+kinetics+upon+rapid+activation+and+relaxation+of+mouse,+guinea+pig+and+human+heart+muscle+studied+on+the+subcellular+myofibrillar+level.">Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level.</a> Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).</li><li>Ribeiro, P. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+Effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Joureau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+sarcomere+contractility+contributes+to+muscle+weakness+in+ACTA1-related+nemaline+myopathy+(NEM3).">Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3).</a> Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).</li><li>de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+perfusion+shows+intersarcomere+dynamics+within+single+skeletal+muscle+myofibrils.">Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).</li><li>Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+force+enhancement+is+regulated+by+titin+in+skeletal+and+cardiac+myofibrils.">Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils.</a> Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).</li><li>Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+non-cross-bridge+forces+after+stretch+of+activated+striated+muscle+is+related+to+titin+isoforms.">The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).</li><li>Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+system+for+probing+cantilever+deflections+parallel+to+a+sample+surface.">Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface.</a> Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).</li><li>Chavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferrule-top+nanoindenter:+an+optomechanical+fiber+sensor+for+nanoindentation.">Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation.</a> Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).</li><li>Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metrological+approach+for+the+calibration+of+force+transducers+with+interferometric+readout.">A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout.</a> Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).</li><li>van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+dynamic+mechanical+analysis+for+heterogeneous+soft+matter+using+ferrule-top+indentation.">Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation.</a> Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KBTBD13+is+an+actin-binding+protein+that+modulates+muscle+kinetics.">KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2019).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-specific+effects+on+thin+filament+length+in+thin+filament+myopathy.">Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy.</a> Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).</li><li>Ottenheijm, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleting+exon+55+from+the+nebulin+gene+induces+severe+muscle+weakness+in+a+mouse+model+for+nemaline+myopathy.">Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy.</a> Brain. 136, 1718-1731 (2013).</li><li>Ribeiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+Myosin-II+Inhibitor+(N-benzyl-p-toluene+Sulphonamide,+BTS)+on+Contractile+Characteristics+of+Intact+Fast-twitch+Mammalian+Muscle+Fibres.">Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).</li><li>Stehle, R., Kr&#252;ger, M., Pfitzer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+kinetics+and+individual+sarcomere+dynamics+in+cardiac+myofibrils+after+rapid+Ca(2+)+changes.">Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes.</a> Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).</li><li>Najafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-diastolic+force+pre-activates+cardiomyocytes+and+determines+contractile+force:+role+of+titin+and+calcium.">End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium.</a> Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).</li></ol>

Beskrivs är ett protokoll för att bedöma kontraktil funktion myofibrils isolerade från mänskliga eller djur skelettet muskel vävnader. Kraftupplösningen av denna uppställning har beskrivits tidigare av Chavan et al.12. Kort sagt, det bestäms av slumpmässiga fluktuationer av längden på Fabry-Pérot hålighet bildas mellan detektion fiber och cantilever, som producerar den dominerande delen av buller vid utgången av avläsningen (uttryckt i V) som, multiplicerat med avböjning känsligh...

Striated muskelceller är oumbärliga för dagliga livsaktiviteter. Lem rörelse, andningsfunktion, och pumpning rörelse i hjärtat lita på den kraft som genereras av muskelceller. Skelettmuskel består av muskelfascitappar som innehåller buntar av enstaka muskelfibrer (Figur 1A). Dessa muskelfibrer består av myofibrils, som bildas av seriekopplade sarkomerer (Figur 1B,D). Sarkomerna innehåller tunna och tjocka glödtrådar. Dessa består i första hand av kedjor av aktin och myosinmolekyler, respektive (Figur 1B). Actin-myosin interaktioner är ansvariga för kraft-genererande kapacitet av muskel. Patienter med mutationer i gener kodning för sarkomiska proteiner, såsom nebulin, aktin, och troponin T, lider av muskelsvaghet på grund av kontraktil dysfunktion1.
Kvaliteten på muskelkontraktilitet kan studeras på olika nivåer av organisation, allt från in vivo hela muskler till aktin-myosin interaktioner i in vitro motility analyser. Under de senaste decennierna har flera forskargrupper utvecklat uppställningar för att bestämma kontraktiliteten hos enskilda myofibrils2,3,4,5,6,7,8,9,10. Dessa uppställningar är baserade på detektion av förändringar i laser avböjning från en cantilever (dvs, optiska strålen avböjning) som orsakas av kontraktion av myofibril (för detaljer, se Labuda et al.11). Även om fastställandet av kontraktil funktion myofibrils har vissa begränsningar (t.ex. dynamiken i excitation-kontraktionskoppling processer som är uppströms av myofibrils saknas), det finns flera fördelar med detta tillvägagångssätt. Dessa inkluderar: 1) förmågan att bedöma aktin-myosin interaktioner i närvaro av de geometriska begränsningar av sarkomerna; 2) förmågan att bedöma aktin-myosin interaktioner utan potentiella confounding effekter av skadade, intilliggande myofibrils (vid mätning av kontraktilitet av single muskelfibrer ultrastrukturella skador och feljustering av myofibrils kan bidra till nedsatt kontraktilitet) (Figur 1D); 3) den lilla diametern på myofibrils (~1 μm, figur 2A) och bristen på membran möjliggör nästan omedelbar kalcium diffusion in i sarkomerna. Vidare, om strukturella skador finns i myofibrils, de sannolikt bryta under sin isolering eller under experimentet. Därför bedöma myofibril kontraktilitet är en elegant metod för att studera de grundläggande mekanismerna för muskelkontraktion och att förstå om störd aktin-myosin interaktioner är den främsta orsaken till muskelsjukdom som orsakas av mutationer i sarcomeric proteiner.
Detta protokoll presenterar en nyutvecklad setup för att fastställa kontraktility av myofibrils införliva en cantilever kraft sond med nano-Newton upplösning (dvs. Optiforce). Denna kraftsond bygger på interferometriprincipen. Interferometry möjliggör användning av relativt styva kantilevers. Detta gör det möjlighet för att mäta styrka med lite avböjning av cantileveren som att närma sig isometric sammandragningar av myofibrilen. Sonden möjliggör bedömning av låga passiva och aktiva krafter som produceras av en enda myofibril isolerad från olika muskelbiopsier, inklusive de från mänskliga försökspersoner, med en hög signal-brus-förhållande. Den optiska cantilever kraft sond införlivas i denna setup är baserad på en Fabry-Pérot interferometer12. Interferometern detekterar små förskjutningar mellan en optisk fiber och en guldbelagd cantilever monterad på en ferrule (Figur 3). Mellanrummet mellan den optiska fibern och cantileveren kallas Fabry-Pérot håligheten. Myofibrils monteras mellan sonden och piezomotorn med hjälp av två limbelagda glasmonteringsfibrer. Kraften som produceras av myofibrilen kan matematiskt härledas från interferometerdatan. Interferometri baseras på superpositionen eller störningen av två eller flera vågor (i denna setup tre ljusvågor). Laserljus med en våglängd mellan 1 528,77–1 563,85 nm avges från interferometern och skickas genom den optiska fibern. I sonden reflekteras ljuset 1) vid gränssnittet mellan den optiska fibern och mediet (Bild 3A); 2) vid gränssnittet för mediet och den kantilever (Figur 3B); och 3) vid gränssnittet mellan metall- och guldbeläggningen på cantilever (figur 3C). Reflektionen vid gränssnitt A och B är beroende av brytningsindexet (n) för det medium där sonden är nedsänkt. Ljuset, som består av de tre överlagrade reflexerna, återgår till en fotodiod i interferometern. Fotodioden mäter ljusets intensitet, vilket är resultatet av interferensmönstret hos de tre överlagrade reflexerna. När kontraktil kraft genereras genom att aktivera eller sträcker en myofibril, den myofibril drar på cantilever. Denna rörelse ändrar hålighetsstorleken (d) och följaktligen antalet våglängder som passar i hålrummet. Ljuset som reflekteras vid cantilever kommer att ha en annan fas, vilket resulterar i ett annat störningsmönster. Fotodioden registrerar denna förändring av störningsmönster intensitet som en förändring i Volts. Därefter är myofibril kraft generation beräknas från denna förändring, med hänsyn till den cantilever styvhet. Kraftsonden kalibreras av tillverkaren genom att trycka på tippen på monteringsnålen, fäst vid fri handingänden på fri handborttagningen, mot en vågvåg samtidigt som böjningen av frisläppen är lika med en multipel av avläsningslasernsvåglängd 13. Således är interferometri en mycket känslig metod för att upptäcka små förändringar i avstånd, vilket möjliggör mätning av krafter med nano-Newton upplösning. Denna resolution möjliggör bedömningen av myofibrillar kraftproduktion med hög signal-brus-förhållande. Medan traditionella interferometri begränsar mätområdet till den linjära delen av störningskurvan, med hjälp av en inlåsningsförstärkare och modulering av laservåglängden övervinner denna begränsning14. Detta förklaras närmare i diskussionsavsnittet.
För att mäta myofibril aktiv spänning, en snabb-steg perfusion system införlivades för att exponera den myofibril till kalcium lösningar (Figur 4A). Perfusionssystemet med snabbstegs-kan lösningsändringar ske inom 10 ms. På grund av deras lilla diameter, är calciumdiffusion in i myofibrilsen nästan ögonblicklig. Därav, detta system är särskilt lämplig för att mäta satserna för actin-myosin bindning under aktivering och release under avkoppling. Aktiveringshastigheten (kACT) och avslappning (kREL) kan bestämmas från aktivering-avkopplingskurvorna. Också, genom att utsätta myofibrils för kalcium lösningar av ökande koncentration, kraft-kalcium relation och kalcium känslighet kan bestämmas.
Vidare möjliggör en motor med piezolängd snabb sträckning och förkortning av myofibrilen. Detta erbjuder möjligheten att studera de viskoelastiska egenskaperna (dvs, passiv spänning) av myofibril, samt utför en snabb förkortning och restretch av myofibril att bestämma graden av spänning ombyggnad (kTR). De parametrar som hämtas från både aktiva och passiva spänningsexperiment kan ändras av genmutationer i ett sarkomiskt protein.
Denna specialbyggda setup användes för att mäta aktiva och passiva contractile egenskaper myofibrils isolerade från friska mänskliga, patient och mus skelettmuskulaturen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio Spec Products, Inc.</td>
			<td>985370-XL</td>
			<td>To isolate myofibrils</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom coded</td>
			<td></td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Includes Labview program to control over serial connection; To control valves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Aluminum tissue chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To control the valves; Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td>MCS100</td>
			<td>To record sarcomere length</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Force probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Data registration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-200</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529265</td>
			<td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78471</td>
			<td>Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TE-63-1.0-1.3</td>
			<td>To cool the tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20736652</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20739263</td>
			<td>Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2441081</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>TG150-4</td>
			<td>To perfuse the tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 PC for IonWizard and 1 PC for other software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer

Striated muskelceller är oumbärliga för aktiviteten hos människor och djur. Single muskelfibrer består av myofibrils, som består av seriellt länkade sarkomerer, de minsta kontraktila enheter i muskel. Sarcomeric dysfunktion bidrar till muskel svaghet hos patienter med mutationer i gener kodning för sarkomiska proteiner. Studiet av myofibril mekanik möjliggör bedömning av aktin-myosin interaktioner utan potentiella confounding effekter av skadade, intilliggande myofibrils vid mätning av kontraktilitet av enstaka muskelfibrer. Ultrastructural skador och feljustering av myofibrils kan bidra till nedsatt kontraktilitet. Om strukturella skador är närvarande i myofibrils, de sannolikt bryta under isoleringen förfarandet eller under experimentet. Vidare ger studier i myofibrils bedömningen av aktin-myosin interaktioner i närvaro av de geometriska begränsningar av sarkomerna. Till exempel kan mätningar i myofibrils klargöra om myofibrillar dysfunktion är den primära effekten av en mutation i ett sarkomiskt protein. Dessutom perfusion med kalcium lösningar eller föreningar är nästan omedelbar på grund av den lilla diametern på myofibril. Detta gör myofibrils synnerligen lämplig att mäta andelen aktivering och avkoppling under kraftproduktion. Det protokoll som beskrivs i detta dokument använder en optisk kraft sond baserad på principen om en Fabry-Pérot interferometer kan mäta krafter i nano-Newton sortiment, kopplade till en piezo längd motor och en snabb-steg perfusion system. Denna uppställning möjliggör studier av myofibrilmekanik med högupplösningskraftmätningar.

Dataspår registrerades och öppnades med programvaran systemstyrenhet (se Table of Materials). Kompletta spårningar eller markerade segment exporterades till urklipps- eller textfilen för vidare analys med en önskad programvara. Ventiler för att styra flödet av de olika lösningarna byttes med anpassad programvara eller manuellt. En anpassad MATLAB skript användes för att analysera andelen aktivering, spänning ombyggnad, och avkoppling. Den maximala aktiva kraften och toppen och platåkraften f?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer at JoVE.com

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Presenteras här är ett protokoll för att bedöma de kontraktila egenskaperna hos striated muskel myofibrils med nano-Newton upplösning. Protokollet använder en inställning med en interferometri-baserad, optisk kraft sond. Denna inställning genererar data med hög signal-brus-förhållande och möjliggör bedömning av myofibrils kontraktila kinetik.

Isolera Myofibrils från skelettmuskulatur tarmbiopsier och bestämma Contractile funktion med en Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Bedöma de kontraktila egenskaperna hos myofibrils isolerats från striated muskel kan användas för att avgöra om sarcomere dysfunktion är en primär orsak till muskel svaghet på grund av att mutationer i sarcomeric proteiner. Denna teknik kan användas för att skaffa data med en mycket hög signal-brus-förhållande med nanonewton upplösning. Detta protokoll är också lämpligt att mäta kontraktilitet i permeabiliserade kardiomyocyter.Tänk på att kraftgivaren är mycket ömtålig. Så när du tar bort limmet från monteringsnålen eller när du limmar en myofibril måste du ha en stadig hand, mycket övning, och mycket tålamod. Innan du monterar vävnaden, placera en homogenisatorstång i röret som innehåller muskelvävnaden.Hålla röret på is, snurra rotorn i 15 sekunder på hastighet fem. I slutet av homogeniseringen, överföra 50 mikroliter av den resulterande myofibril suspension och 250 mikroliter av avslappnande lösning på en poly-HEMA belagda bild i en vävnad bad. Täck badet med lock för att skydda blandningen från damm och vänta 5 till 10 minuter så att myofibrils att sjunka till botten av droppen.Under förlisningen av myofibrils, värm Shellac ett etanollim på 65 grader Celsius i 30 till 60 sekunder innan du lägger till cirka sex mikroliter lim på en obestruken glasrutschbana. Upprepade gånger doppa spetsen på varje monteringsnål i limmet tills ett lager av lim är synlig. Använd sedan mikromanipulatorer för att flytta sonden och piezo vertikalt för att göra plats för vävnadsbadet på mikroskopstadiet och ta bort glasrutschkanan som innehåller limmet.Efter montering av myofibrils, för att mäta sarkomerlängden, flytta piezo och / eller kraft sond för att ställa in den initiala sarkomere längd av myofibril till 2,5 mikrometer. Med hjälp av systemets styrenhets programvaras kärlfunktion mäter du myofibrillängden och bredden. Använd mikroskopet scenen för att placera myofibril i mitten av videobilden och sträcka en rektangel från ena sidan av myofibril till den andra, var noga med att inkludera den mörka kanten av limdropparna.Om du vill börja registrera data klickar du på start. Klicka på paus efter fem sekunder. Längden kommer att ha spelats in.För att mäta bredden, rotera kameran 90 grader för att visa kontrasten av kanten av myofibril själv. Justera rektangeln och klicka på Startskärmen för att börja registrera data. Klicka på paus efter fem sekunder.Bredden kommer att ha spelats in. För att placera thetaglaset, använd okularet och manipulatorn för att försiktigt flytta thetaglaset mot myofibrilen. Rikta in den översta kanalen på thetaglaset med myofibrilen och utför ett snabbsteg för att kontrollera läget.Slå på bakgrunden avkopplande flöde för att kontrollera theta glas anpassning och använda en Luer ventil spaken för att slå på inflödet av flödet kammaren. Sedan för att börja dränera flödeskammaren och för att förhindra överfyllda av flödet kammaren, ställ utflöde pumpventilen till bad ventil två, mikro steg läge till mikro, kolvmålet till 48, 000, och kolvhastighet till 38 till 40. För att mäta graden av spänningsrenovering, beräkna piezorörelsen som är nödvändig för att avslappa myofibrilen med 15%och mata in detta värde i signalgeneratorn.Klicka på Resume för att fortsätta registrera data och öppna ventiler ett och sex för att starta flödena av avslappnande lösning och de olika kalciumkoncentrationerna genom thetaglaset respektive. Välj återställningsområde på interferometern för att återställa området för interferometern så att baslinjekraften är noll volt. När kraftspåret är stabilt, utför thetaglaset snabb-steg med en 100 mikrometer stegstorlek.När kraftplatån är nådd, utför den förkortande re-stretchen med piezoen. En aktivering avkoppling spår kommer att registreras. Klicka på paus.Om du vill utföra en stegvis sträcka klickar du på Start och återställer området för interferometern så att baslinjekraften är noll volt. Utför en stegvis sträcka med signalgeneratorn. När sträckan är klar, använd piezo för att förkorta myofibril till slack längd.Tryck sedan på paus och stoppa och spara data. Här, kraft spår av en aktiv kraft experiment med en myofibril isolerad från friska mänskliga quadriceps muskel visas. Den myofibril aktiverades fem gånger med lösningar med varierande kalcium koncentrationer, med en genomsnittlig maximal kraft av alla myofibrils på cirka 123 millinewtons per kvadratmillimeter.Konstruktionen av en kraft kalciumkoncentration kurvan från platåkrafterna som uppnåtts under varje aktivering i var och en av de fem kalciumkurvorna möjliggör beräkning av kalciumkoncentrationen vid 50%av den maximala kraftproduktionen. Som illustreras i denna representativa analys, kan de myofibrils behandlas med flera föreningar i ett enda experiment för att svara på ytterligare frågor om myofibril typ. Den aktiva kraften och sarkomerlängden kan också mätas för att möjliggöra beräkning av satserna för ombyggnad, aktivering och avkoppling.Den branta ökningen som visas i den prickade röda lådan orsakas av både viskositet och elasticitet. Platån liknar endast den elastiska komponenten. Som viskositet motstår stam linjärt, tappade kraften efter stammen togs bort.När du placerar thetaglaset, se till att du riktar det ordentligt mot myofibrilen. Annars kan den aktiverande lösningen komma in mellan den optiska fibern och den cantilever av kraft sonden och detta orsakar artefakter att uppstå i dina data. Dessutom kan det hända att myofibrilen inte aktiveras ordentligt.Denna metod för perfusion är också lämplig för att bestämma den muskel fiber typ av myofibril. Till exempel, du kan först granska myofibril med en normal kalciumlösning följt av perfusion av samma lösning, men sedan lägga till en muskelfiber-typ specifika krafthöjande förening.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulta och embryonala skelettmuskler Microexplant Kultur och Isolering av skelettet muskelceller Stem

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitokondriell Isolering från skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Rening av stamceller från skelettmuskulatur

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Förfaranden för råtta<em&gt; In situ</em&gt; Skelettmuskulaturen Kontraktila egenskaper

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolering och odling av individuella Myofibers och deras satellit celler från vuxna skelettmuskulatur

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Force Measurement under kontraktion att bedöma muskelfunktion i zebrafisk larver

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolering av Intakt Mitokondrier från skelettmuskulatur genom differentialcentrifugering för Högupplösta respirometri Mätningar

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

Immunolabelling myofiber degeneration i Muskelbiopsier

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolering och karakterisering av exosomer från skelettmuskulaturfibroblaster

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Insamling av skelettmuskulaturbiopsier från det överlägsna facket i Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...