Name: isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer
Uploaded: 2020-05-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer at JoVE.com

Bu proje AFM-Telethon ve Nemaline Myopathies için A Vakfı Yapı Gücü tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar bu makalede belirtilen ürünlerin yaratıcısı kabul etmek istiyorum, IONOptix Inc.

İnsan biyopsisi alınmasına yönelik protokol VU Üniversitesi Tıp Merkezi kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır (#2014/396) ve deneklerden yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Hayvan kas biyopsisi alma protokolü VU Üniversitesi yerel hayvan etik komitesi tarafından onaylandı (AVD114002016501)
1. Hazırlık ve miyofibril izolasyon
NOT: Biyopsigliserini gliserinlemek için daha önce açıklanan yöntemleri kullanın, farklı kalsiyum konsan...

<ol>
	<li>Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcomere+Dysfunction+in+Nemaline+Myopathy.">Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy.</a> J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).</li><li>Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+and+passive+forces+of+isolated+myofibrils+from+cardiac+and+fast+skeletal+muscle+of+the+frog.">Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog.</a> Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).</li><li>Kulke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+major+source+of+myofibrillar+stiffness+in+Drosophila+indirect+flight+muscle.">a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle.</a> Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).</li><li>Stehle, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isometric+force+kinetics+upon+rapid+activation+and+relaxation+of+mouse,+guinea+pig+and+human+heart+muscle+studied+on+the+subcellular+myofibrillar+level.">Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level.</a> Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).</li><li>Ribeiro, P. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+Effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Joureau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+sarcomere+contractility+contributes+to+muscle+weakness+in+ACTA1-related+nemaline+myopathy+(NEM3).">Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3).</a> Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).</li><li>de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+perfusion+shows+intersarcomere+dynamics+within+single+skeletal+muscle+myofibrils.">Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).</li><li>Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+force+enhancement+is+regulated+by+titin+in+skeletal+and+cardiac+myofibrils.">Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils.</a> Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).</li><li>Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+in+non-cross-bridge+forces+after+stretch+of+activated+striated+muscle+is+related+to+titin+isoforms.">The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).</li><li>Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+system+for+probing+cantilever+deflections+parallel+to+a+sample+surface.">Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface.</a> Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).</li><li>Chavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferrule-top+nanoindenter:+an+optomechanical+fiber+sensor+for+nanoindentation.">Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation.</a> Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).</li><li>Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metrological+approach+for+the+calibration+of+force+transducers+with+interferometric+readout.">A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout.</a> Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).</li><li>van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+dynamic+mechanical+analysis+for+heterogeneous+soft+matter+using+ferrule-top+indentation.">Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation.</a> Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KBTBD13+is+an+actin-binding+protein+that+modulates+muscle+kinetics.">KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2019).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-specific+effects+on+thin+filament+length+in+thin+filament+myopathy.">Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy.</a> Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).</li><li>Ottenheijm, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleting+exon+55+from+the+nebulin+gene+induces+severe+muscle+weakness+in+a+mouse+model+for+nemaline+myopathy.">Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy.</a> Brain. 136, 1718-1731 (2013).</li><li>Ribeiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers:+effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase.">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li><li>Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+Myosin-II+Inhibitor+(N-benzyl-p-toluene+Sulphonamide,+BTS)+on+Contractile+Characteristics+of+Intact+Fast-twitch+Mammalian+Muscle+Fibres.">Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).</li><li>Stehle, R., Kr&#252;ger, M., Pfitzer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+kinetics+and+individual+sarcomere+dynamics+in+cardiac+myofibrils+after+rapid+Ca(2+)+changes.">Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes.</a> Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).</li><li>Najafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-diastolic+force+pre-activates+cardiomyocytes+and+determines+contractile+force:+role+of+titin+and+calcium.">End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium.</a> Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).</li></ol>

Açıklanan insan veya hayvan iskelet kas dokularından izole miyofibrils kontraktil fonksiyondeğerlendirmek için bir protokoldür. Bu kurulumun kuvvet çözünürlüğü daha önce Chavan ve ark.12tarafından tanımlanmıştır. Kısacası, algılama lifi ile kantil arasında oluşan Fabry-Pérot boşluğunun uzunluğundaki rastgele dalgalanmalar tarafından belirlenir, bu da okuma çıkışındaki gürültünün baskın kısmını (V ile ifade edilir) oluşturur, sapma hassasiyeti (m/V ile ifa...

Burlu kas hücreleri günlük yaşam aktiviteleri için vazgeçilmezdir. Ekstremite hareketi, solunum fonksiyonu ve kalbin pompalama hareketi kas hücreleri tarafından üretilen kuvvet güveniyor. İskelet kası, tek kas liflerinin demetleri içeren kas fasiküllerinden oluşur (Şekil 1A). Bu kas lifleri seri bağlı sarcomeres tarafından oluşturulan miyofibrils oluşur (Şekil 1B,D). Sarcomeres ince ve kalın filamentler içerir. Bunlar öncelikle sırasıyla aktin ve miyozin molekülzincirlerinden oluşur (Şekil 1B). Aktin-miyozin etkileşimleri kas kuvvet üreten kapasitesi sorumludur. Nebulin, aktin ve troponin T gibi sarkoerik proteinleri kodlayan genlerde mutasyonlar olan hastalar, kontraktil disfonksiyon nedeniyle kas güçsüzlüğü muzdarip1.
Kas kontraktilite kalitesi in vivo bütün kaslar in vitro motilite tahlilleri actin-miyozin etkileşimleri arasında değişen, organizasyonun çeşitli düzeylerde çalışılabilir. Son yıllarda, çeşitli araştırma grupları,bireysel myofibrils2,3,4,5,6,7,8,9,10sözleşme belirlemek için kurulumları geliştirdik . Bu kurulumlar, miyofibrilin kasılmasından kaynaklanan bir kantileverden (yani optik ışın sapması) lazer sapmasındaki değişikliklerin algılanmasına dayanır (ayrıntılar için bkz. Labuda ve ark.11). Myofibrils kontraktil fonksiyonu belirlenmesi bazı sınırlamalar (örneğin, miyofibrils upstream olan uyarma-daralma kaplin süreçlerinin dinamikleri eksik olmasına rağmen), bu yaklaşımın birden fazla avantajı vardır. Bunlar şunlardır: 1) sarcomeres geometrik kısıtlamaları varlığında aktin-miyozin etkileşimleri değerlendirmek için yeteneği; 2) hasarlı, bitişik miyofibrillerin potansiyel kafa karıştırıcı etkileri olmadan aktin-miyozin etkileşimlerini değerlendirme yeteneği (tek kas liflerinin kontraktilitesini ölçerken ultrayapısal hasar ve miyofibrillerin yanlış hizalanması kasılvesiyetin bozulmasına neden olabilir)(Şekil 1D); 3) miyofibrillerin küçük çapı (~1 μm, Şekil 2A)ve zar eksikliği sarcomeres içine neredeyse anında kalsiyum difüzyon için izin verir. Ayrıca, miyofibrillerde yapısal hasar varsa, muhtemelen izolasyonları sırasında veya deney sırasında kırılırlar. Bu nedenle, miyofibril kontraksiyonu değerlendirmek kas kasılmasının temel mekanizmalarını incelemek ve rahatsız edici aktin-miyozin etkileşimlerinin sarkoerik proteinlerdeki mutasyonların neden olduğu kas hastalığının birincil nedeni olup olmadığını anlamak için kullanılan zarif bir yöntemdir.
Bu protokol, nano-Newton çözünürlüğüne sahip bir kantil kuvvet sondası (yani Optiforce) içeren miyofibrillerin kontraktilliğini belirlemek için yeni geliştirilmiş bir kurulum sunar. Bu kuvvet sondası interferometri prensibine dayanır. İnterferometri nispeten sert kantilevers kullanımını sağlar. Bu, miyofibrilin izometrik kasılmaları yaklaşırken, kantilever çok az sapma ile kuvvet ölçmek mümkün kılar. Prob, insan denekler de dahil olmak üzere farklı kas biyopsilerinden izole edilmiş tek bir miyofibril tarafından üretilen düşük pasif ve aktif kuvvetlerin yüksek sinyal-gürültü oranı ile değerlendirilmesini sağlar. Bu kurulumda yer alan optik kantilkuvvet prob fabry-Pérot interferometre12dayanmaktadır. İnterfermetre, optik fiber ile bir ferrule üzerine monte edilmiş altın kaplı bir kantil arasındaki küçük yer değiştirmeleri algılar (Şekil 3). Optik fiber ve kantilever arasındaki boşluk Fabry-Pérot boşluğu denir. Miyofibrils prob ve piezo motor arasında iki tutkal kaplı cam montaj lifleri kullanılarak monte edilir. Miyofibril tarafından üretilen kuvvet matematiksel olarak interferometre verilerinden elde edilebilir. İnterferometri iki veya daha fazla dalganın (bu kurulumda üç ışık dalgası) süperpozisyonuna veya girişimine dayanır. 1,528.77-1.563.85 nm arasında dalga boyuna sahip lazer ışığı interferometreden yayılır ve optik fiber üzerinden gönderilir. Sondada, ışık yansıtılır 1) optik fiber ve ortam arasındaki arabirimde(Şekil 3A); 2) orta ve cantilever arayüzünde (Şekil 3B); ve 3) kantilever metal ve altın kaplama arasındaki arabirimde (Şekil 3C). A ve B arabirimindeki yansıma, sondanın batırıldığı ortamın kırılma indisi(n)bağlıdır. Üç üst üste yerleştirilmiş yansımadan oluşan ışık, interferometredeki bir fotodiyota geri döner. Fotodiyot, üç üst üste yerleştirilmiş yansımanın girişim deseninin sonucu olan ışığın yoğunluğunu ölçer. Bir miyofibril etkinleştirilerek veya gerilerek kontraktil kuvvet oluşturulduğunda, miyofibril kantilever çeker. Bu hareket kavite boyutunu(d) ve dolayısıyla, kavite sığan dalga boylarının sayısını değiştirir. Kantilever yansıyan ışık farklı bir faz alacaktır, farklı bir girişim deseni ile sonuçlanan. Fotodiyot, bu parazit desen yoğunluğu değişimini Volt'taki bir değişiklik olarak kaydeder. Daha sonra, miyofibril kuvvet üretimi bu değişiklikten hesaplanır, cantilever sertliği dikkate alınarak. Kuvvet probu, montaj iğnesinin ucunu iterek, kantilin serbest teslim ucuna, bir tartım ölçeğine karşı tartılarak, kantilin bükülmesini okumalazer13'ündalga boyunun bir katına eşit tutarak kalibre edilir. Bu nedenle, interferometri nano-Newton çözünürlüğü ile kuvvetlerin ölçümü için izin, mesafe küçük değişiklikleri tespit etmek için son derece hassas bir yöntemdir. Bu çözünürlük, yüksek sinyal-gürültü oranı ile miyofibrillar kuvvet üretiminin değerlendirilmesini sağlar. Geleneksel interferometri, ölçüm aralığını girişim eğrisinin doğrusal kısmına sınırlarken, kilitleyici amplifikatör ve lazer dalga boyu modülasyonu kullanılarak bu sınırlamanın üstesindengelin14. Bu tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Miyofibril aktif gerilimi ölçmek için miyofibril'i kalsiyum çözeltilerine maruz bırakmak için hızlı adımlı bir perfüzyon sistemi kurulmuştur(Şekil 4A). Hızlı basamak perfüzyon sistemi, 10 ms içinde çözüm değişikliklerinin gerçekleşmesini sağlar. Küçük çapları nedeniyle miyofibrillere kalsiyum difüzyonu neredeyse anlıktır. Bu nedenle, bu sistem özellikle aktivasyon sırasında aktivasyon ve gevşeme sırasında serbest aktin-miyozin bağlanma oranlarını ölçmek için uygundur. Aktivasyon oranı (kACT)ve gevşeme (kREL)aktivasyon-gevşeme eğrilerinden belirlenebilir. Ayrıca, artan konsantrasyonun kalsiyum çözeltilerine miyofibriller maruz bırakılarak, kuvvet-kalsiyum ilişkisi ve kalsiyum duyarlılığı belirlenebilir.
Ayrıca, bir piezo uzunluğu motor hızlı germe ve miyofibril kısalma sağlar. Bu, miyofibrilin viskoelastik özelliklerini (yani pasif gerilim) inceleme ve gerilim inancını belirlemek için miyofibril'in hızlı bir kısalması ve yeniden gerilmesi (kTR)olanağı sunar. Hem aktif hem de pasif gerilim deneylerinden elde edilen parametreler sarkoerik proteindeki gen mutasyonları ile değiştirilebilir.
Bu özel yapım kurulum sağlıklı insan, hasta ve fare iskelet kas izole miyofibrils aktif ve pasif kontraktil özelliklerini ölçmek için kullanılmıştır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bio Spec Products, Inc.</td>
			<td>985370-XL</td>
			<td>To isolate myofibrils</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom coded</td>
			<td></td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Includes Labview program to control over serial connection; To control valves</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>Aluminum tissue chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom fabricated</td>
			<td></td>
			<td>To control the valves; Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td>MCS100</td>
			<td>To record sarcomere length</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td>Force probe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koolance</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td>To cool the Peltier module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Data registration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td>TH4-200</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529265</td>
			<td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78471</td>
			<td>Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TE-63-1.0-1.3</td>
			<td>To cool the tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Technology, Inc.</td>
			<td>TC-720</td>
			<td>Includes PC software to control over USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20736652</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Trading AG</td>
			<td>20739263</td>
			<td>Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2441081</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)</td>
			<td>TG150-4</td>
			<td>To perfuse the tissue</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 PC for IonWizard and 1 PC for other software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating myofibrils from skeletal muscle biopsies and determining contractile function with a nano-newton resolution force transducer

Burlu kas hücreleri insan ve hayvanların aktivitesi için vazgeçilmezdir. Tek kas lifleri miyofibrils oluşur, hangi seri bağlı sarcomeres oluşur, kas en küçük kontraktil birimleri. Sarkoerik disfonksiyon sarkoerik proteinler için kodlama genmutasyonları olan hastalarda kas güçsüzlüğüne katkıda bulunur. Miyofibril mekaniğinin çalışması, tek kas liflerinin kontraktilitesini ölçerken hasarlı, bitişik miyofibrillerin potansiyel kafa karıştırıcı etkileri olmadan aktin-miyozin etkileşimlerinin değerlendirilmesine olanak sağlar. Aşırı yapısal hasar ve miyofibrillerin yanlış hizalanması kasıldaş bozukluğuna neden olabilir. Miyofibrillerde yapısal hasar varsa, muhtemelen izolasyon işlemi sırasında veya deney sırasında kırılırlar. Ayrıca, miyofibrils çalışmaları sarcomeres geometrik kısıtlamalar varlığında aktin-miyozin etkileşimleri değerlendirilmesi sağlar. Örneğin, miyofibrils ölçümleri miyofibrillar disfonksiyon sarkoerik protein bir mutasyonun birincil etkisi olup olmadığını açıklayabilir. Buna ek olarak, kalsiyum çözeltileri veya bileşikleri ile perfüzyon miyofibril küçük çapı nedeniyle neredeyse anında. Bu da miyofibrilleri kuvvet üretimi sırasında aktivasyon ve gevşeme oranlarını ölçmek için son derece uygun hale getirir. Bu yazıda açıklanan protokol, bir piezo uzunluk motoru ve hızlı adım perfüzyon sistemi ile birleştiğinde, nano-Newton aralığındaki kuvvetleri ölçebilen bir Fabry-Pérot interferometre prensibine dayalı bir optik kuvvet sondası kullanır. Bu kurulum, yüksek çözünürlüklü kuvvet ölçümleri ile miyofibril mekaniğinin incelenmesini sağlar.

Veri izleri sistem denetleyici yazılımı ile kaydedildi ve açıldı (bkz. Malzemeler Tablosu). Tam izlemeler veya seçili segmentler, istenen bir yazılımla daha fazla analiz edilmek üzere panoya veya metin dosyasına aktarıldı. Farklı çözümlerin akışını kontrol etmek için vanalar özel yazılım veya manuel olarak değiştirildi. Etkinleştirme, gerilim yeniden geliştirme ve gevşeme oranlarını analiz etmek için özel bir MATLAB komut dosyası kullanılmıştır. Pasif kuvvet deneyle...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer at JoVE.com

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Burada nano-Newton çözünürlüğü ile striated kas miyofibrils kontraktil özelliklerini değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Protokolde interferometri tabanlı optik kuvvet sondası içeren bir kurulum uyguluyor. Bu kurulum yüksek sinyal-gürültü oranı ile veri üretir ve miyofibrils kontraktil kinetiği değerlendirilmesini sağlar.

İskelet Kas Biyopsilerinden Miyofibrillerin İzlenmesi ve Nano-Newton Çözünürlük Transdüseri ile Kontraktil Fonksiyonun Belirlenmesi

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Sarkobil disfonksiyonunun sarkoerik proteinlerdeki mutasyonlara bağlı kas güçsüzlüğü birincil nedeni olup olmadığını belirlemek için striated kas izole miyofibrillerin kontraktil özelliklerinin değerlendirilmesi için kullanılabilir. Bu teknik nanonewton çözünürlüğü ile çok yüksek sinyal-gürültü oranı ile veri elde etmek için kullanılabilir. Bu protokol aynı zamanda permeabilize kardiyomiyositlerde kontraktiliti ölçmek için de uygundur.Kuvvet dönüştürücüçok kırılgan olduğunu unutmayın. Bu yüzden yapıştırıcıyı montaj iğnesinden çıkarırken veya bir miyofibril yapıştırırken, sabit bir eliniz, çok pratik yapmanız ve çok sabırlı olmanız gerekir. Doku montaj önce, kas dokusu içeren tüp bir homogenizer çubuk yerleştirin.Tüpü buzda tutarak, 5. Homojenizasyon sonunda, ortaya çıkan miyofibril süspansiyonun 50 mikrolitresini ve 250 mikrolitre rahatlatıcı çözeltiyi doku banyosundaki poli-HEMA kaplı slayta aktarın. Karışımı tozdan korumak için banyoyu bir kapakla kapatın ve miyofibrillerin damlanın dibine batmasını sağlamak için 5 ila 10 dakika bekleyin.Miyofibrillerin batması sırasında Shellac'ı 65 santigrat derecede 30 ila 60 saniye ısıtın ve kaplamasız bir cam kaydırağa yaklaşık altı mikrolitre tutkal ekleyin. Bir tutkal tabakası görünene kadar her montaj iğnesinin ucunu tutkaliçine tekrar tekrar batırın. Sonra mikroskop aşamasında doku banyosu için yer açmak ve tutkal içeren cam slayt kaldırmak için dikey sonda ve piezo taşımak için mikro-manipülatörler kullanın.Miyofibrilleri monte ettikten sonra, sarcomere uzunluğunu ölçmek için, miyofibrilin başlangıç sarcomere uzunluğunu 2,5 mikrometreye ayarlamak için piezo ve/veya kuvvet sondasını hareket ettirin. Sistem denetleyici yazılımının gemi işlevini kullanarak, miyofibril uzunluk ve genişlik ölçün. Miyofibril'i video görüntüsünün ortasına konumlandırmak ve miyofibril'in bir tarafından diğerine bir dikdörtgen ilerlemek için mikroskop aşamasını kullanın ve tutkal damlacıklarının koyu kenarını da dahil etmeye özen inin.Verileri kaydetmeye başlamak için başlat'ı tıklatın. Beş saniye sonra duraklat'ı tıklatın. Uzunluk kaydedilmiş olacak.Genişliği ölçmek için, miyofibril kendisi kenarının kontrastgörüntülemek için kamera 90 derece döndürün. Verileri kaydetmeye başlamak için dikdörtgeni ve başlat'ı tıklatın. Beş saniye sonra duraklat'ı tıklatın.Genişlik kaydedilmiş olacak. Teta camı konumlandırmak için, teta camı dikkatle miyofibril doğru hareket etmek için gözlük ve manipülatör kullanın. Teta bardağının üst kanalını miyofibril ile hizalayın ve pozisyonu kontrol etmek için hızlı bir adım atın.Theta cam hizalama kontrol etmek için arka plan rahatlatıcı akışı açın ve akış odası girişini açmak için bir Luer vana kolu kullanın. Daha sonra akış odası drenaj başlatmak ve akış odası taşan önlemek için, banyo vanası iki, mikro adım modu mikro, 48, 000 piston hedef ve 38-40 piston hızı için çıkış pompası vana ayarlayın. Gerilim intizam oranını ölçmek için, miyofibril'i %15 oranında gevşetmek için gerekli piezo hareketini hesaplayın ve bu değeri sinyal jeneratörüne girin.Verileri ve açık vanaları kaydetmeye devam etmek için devam edin, rahatlatıcı çözeltinin akışını ve teta camından farklı kalsiyum konsantrasyonlarını sırasıyla başlatın. Temel kuvvetin sıfır volt olması için interferometrenin aralığını sıfırlamak için interferometredeki sıfırlama aralığını seçin. Kuvvet izi kararlı olduğunda, 100 mikrometre adım boyutu ile teta cam hızlı adım gerçekleştirin.Kuvvet platosu ulaşıldığında, piezo ile kısaltma yeniden germe gerçekleştirin. Bir aktivasyon gevşeme izi kaydedilir. Duraklatma'yı tıklatın.Adım adım esneme gerçekleştirmek için, başlangıç'ı tıklatın ve temel kuvvetin sıfır volt olması için interferometrenin aralığını sıfırlayın. Sinyal jeneratörü ile adım adım esneme gerçekleştirin. Streç bittiğinde, gevşek uzunluğu na miyofibril kısaltmak için piezo kullanın.Ardından duraklat tuşuna basın ve durdurun ve verileri kaydedin. Burada, sağlıklı insan kuadriseps kas izole bir miyofibril ile aktif bir kuvvet deney kuvvet izleri gösterilir. Miyofibril, değişen kalsiyum konsantrasyonlarına sahip çözeltilerle beş kez aktive edildi ve milimetrenin karesi yaklaşık 123 milinewton luk tüm miyofibrillerin ortalama maksimum kuvveti ile aktive edildi.Beş kalsiyum eğrisinin her birinde her bir aktivasyon sırasında ulaşılan plato kuvvetlerinden bir kuvvet kalsiyum konsantrasyon eğrisinin inşası, kalsiyum konsantrasyonunun maksimum kuvvet üretiminin %50'sinde hesaplanmasına olanak sağlar. Bu temsili analizde gösterildiği gibi, miyofibriller miyofibril türü hakkında ek soruları cevaplamak için tek bir deneyde birden fazla bileşikle tedavi edilebilir. Aktif kuvvet ve sarcomere uzunluğu da yeniden geliştirme, aktivasyon ve gevşeme oranlarının hesaplanmasına izin vermek için ölçülebilir.Noktalı kırmızı kutuda gösterilen dik artış hem viskozite ve elastikiyet neden olur. Plato sadece elastik bileşeni andırır. Viskozite zorlanmaya doğrusal olarak direndiği için, gerginlik çıkarıldıktan sonra kuvvet düştü.Theta camı konumlandırırken, miyofibril ile düzgün bir şekilde hizaladığınızdan emin olun. Aksi takdirde, etkinleştirme çözümü optik fiber ile kuvvet sondasının kantilever arasında gelebilir ve bu da verilerinizde yapıların oluşmasına neden olur. Ayrıca, miyofibril düzgün aktive olmayabilir.Perfüzyon Bu yöntem de miyofibril kas lifi türünü belirlemek için uygundur. Örneğin, önce normal bir kalsiyum çözeltisi ile aynı çözeltinin perfüzyon takip ile miyofibril perfuse, ama sonra bir kas liftipi özel kuvvet arttırıcı bileşik ekleyebilirsiniz.

Research

JoVE Journal

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Rat Prosedürleri<em&gt; In situ</em&gt; İskelet Kası Kontraktil Özellikleri

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebra balığı Larva kas fonksiyonu değerlendirmek için daralma sırasında Kuvvet Ölçümü

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

Kas Biyopsilerinde İmmünlabelling Miyofiber Dejenerasyon

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Mekanik Değerlendirme için İnsan Musculus Tibialis Anterior Üstün Bölmesi İskelet Kas Biyopsileri Toplama

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...