Name: retroviral overexpression of cxcr4 on murine b-1a cells and adoptive transfer for targeted b-1a cell migration to the bone marrow and igm production
Uploaded: 2020-05-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production at JoVE.c

Dette arbejde blev støttet af 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Projekt 3 af P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) og R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye blev støttet af American Heart Association Pre-ph.d.-stipendium 16PRE30300002 og 5T32AI007496-20. Vi takker Joanne Lannigan, Mike Solga, og Claude Chew fra University of Virginia Flow Cytometry Core for deres fremragende teknisk bistand.

Alle dyreprotokoller blev godkendt af Animal Care and Use Committee ved University of Virginia.
1. Magnetisk adskillelse og berigelse af peritoneale B-1-celler
<ol><li>Euthanize en 12−14-uger gammel, mand, CD45.1+ApoE-/- mus ved hjælp af CO2.</li>
	<li>Lav en overfladisk snit i maven ved hjælp af lige kirurgisk saks og skræl tilbage huden ved hjælp af buede saks til at udsætte bughinden væggen. Skylle bughulen med 10 ml 37 °C RPMI-1640 medium med en ...

<ol>
	<li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+Cell+Heterogeneity+and+the+Regulation+of+Natural+and+Antigen-Induced+IgM+Production.">B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production.</a> Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).</li><li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1a+cell+diversity:+nontemplated+addition+in+B-1a+cell+Ig+is+determined+by+progenitor+population+and+developmental+location.">B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location.</a> Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).</li><li>Prohaska, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Sequencing+of+Peritoneal+and+Splenic+B+Cell+Repertoires+Highlights+Unique+Properties+of+B-1+Cell+Antibodies.">Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies.</a> Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).</li><li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis.">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+define+murine+B+cell+lineage+immunoglobulin+heavy+chain+(IgH)+repertoires.">Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires.</a> Elife. 4, 09083 (2015).</li><li>Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+cells+in+the+bone+marrow+are+a+significant+source+of+natural+IgM.">B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM.</a> European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).</li><li>Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+secretion+by+B1+cells:+Differential+intensity+and+IRF4-dependence+of+spontaneous+IgM+secretion+by+peritoneal+and+splenic+B1+cells.">Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells.</a> European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).</li><li>Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+migration+of+peritoneal+B-1+cells+is+associated+with+upregulation+of+CXCR4+and+increased+migratory+sensitivity+to+CXCL12.">LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12.</a> Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasma+cell+alloantigen+1+defines+layered+development+of+B-1a+B-cell+subsets+with+distinct+innate-like+functions.">Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).</li><li>Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+and+differentiation+of+natural+antibody-producing+cells+in+mouse+spleen.">Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).</li><li>Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+cell+immunoglobulin+directed+against+oxidation-specific+epitopes.">B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+of+murine+B+lymphocyte+blasts+as+a+method+for+examining+gene+regulation+in+primary+B+cells.">Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells.</a> Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).</li><li>Lin, K. I., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+genes+into+primary+murine+splenic+B+cells+using+retrovirus+vectors.">Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).</li><li>Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Ex+Vivo+Gene+Transfer+to+Primary+Murine+B+Cells+Using+Plasmid+or+Viral+Vectors.">High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).</li><li>DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+expression+of+the+interleukin-7+receptor+in+lymphoid+progenitors.">PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors.</a> Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).</li><li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Decline+in+Natural+IgM+Function:+Diversification+and+Selection+of+the+B-1a+Cell+Pool+with+Age.">Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age.</a> The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).</li><li>Laurie, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+and+efficient+expression+in+mouse+and+human+B+cells+by+a+novel+hybrid+immunoglobulin+promoter+in+a+lentiviral+vector.">Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).</li><li>Warncke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vitro+transduction+of+naive+murine+B+cells+with+lentiviral+vectors.">Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).</li><li>Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IL-5+for+mature+B-1+cells+in+homeostatic+proliferation,+cell+survival,+and+Ig+production.">The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production.</a> Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).</li><li>Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+5+in+the+link+between+the+innate+and+acquired+immune+response.">Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response.</a> Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).</li><li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double+life+of+a+B-1+cell:+self-reactivity+selects+for+protective+effector+functions.">The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).</li></ol>

Den metode, der her er angivet her, muliggør stabil og relativt effektiv primær B-1a celle genlevering, in vivo adoptivoverførsel og identifikation og lokalisering af injicerede celler. Celler var i stand til at blive opdaget 17 uger post-celle overførsel og bevaret øget CXCR4 udtryk. Retrovirus-medieret levering gav 30-40% transduktion effektivitet af primære murine B-1a celler med minimal indvirkning på cellens levedygtighed i vores hænder (Figur 4e). Dette er i overensstemmelse me...

Nylige undersøgelser har vist betydelig immuncelle, og specifikt B-celle, fænotypisk og funktionel heterogenitet afhængigt af cellelokalisering1,,2,,3,,4,5. B-1a celler er en sådan population med heterogen kapacitet til at producere beskyttende IgM antistoffer; knoglemarv B-1a celler udskiller IgM konstituerende og bidrager væsentligt til plasma IgM titere6,mens peritoneale B-1a celler har lavt niveau IgM sekretion på homøostase og i stedet kan aktiveres gennem medfødte vejafgift-lignende receptor (TLR) eller cytokin-medieret signalering til hurtigt at formere sig, migrere, og udskille IgM7,8,9,10. B-1a celle IgM antistoffer genkende oxidation-specifikke epitoper (OSE), der er til stede på patogener, apoptotiske celler, og oxideret LDL, og IgM bindende til OSE kan forhindre inflammatorisknedstrøm signalering i sygdomme som åreforkalkning11. Derfor kan strategier til at øge IgM produktion via stigende peritoneal B-1a celle migration til steder som knoglemarven være terapeutisk nyttige. Det er imidlertid vigtigt, at sådanne strategier målrettes og celletypespecifikke, da virkninger uden for målet kan have en negativ indvirkning på immunforsvaret eller sundheden.
Her beskriver vi en metode til målrettet og langsigtet overekspression af CXCR4 i primære murine B-1a celler og efterfølgende adoptivoverførsel for at visualisere cellemigration og funktionel IgM antistofproduktion (Figur 1). Genetisk manipulation af primære B-celler er begrænset af lav transfektion effektivitet sammenlignet med transfection af transformerede cellelinjer. Men da transformerede cellelinjer kan afvige betydeligt fraprimærcellerne 12,13, vil brugen af primærceller sandsynligvis give resultater, der i højere grad tilpasser sig normal fysiologi. Flere teknikker er blevet beskrevet for genoverførsel i primære murine B-celler, herunder retroviral transduktion, adenoviral transduktion, lipofection, eller elektroporation-baseret transinfektion, som har varierende niveauer af effektivitet, transience, og indvirkning på celle sundhed13,,14,15. Følgende metode anvendte retroviral transduktion, da den gav en tilstrækkelig genoverførselseffektivitet på >30%, mens den minimalt påvirkede cellernes levedygtighed. Den CXCR4-ekspresserende retrovirus blev genereret ved hjælp af den tidligere beskrevne retrovirale konstruktion murine stamcellevirus-interne ribosomal indrejse site-grøn fluorescerende protein (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, hvori musen CXCR4 genet var sub-klonede4. MigR1 (kontrol(Ctl)-GFP) og CXCR4-GFP retrovirale partikler blev genereret ved hjælp af calciumphosphattransfektion som beskrevet i tidligere offentliggjorte protokoller4,14.
Succesfuld trans induceret B-1a celler blev derefter intravenøst overført til lymfocyt-mangelfuld Rag1-/- mus. Både donor- og recipientmus indeholdt desuden knockout af apolipoprotein E (ApoE) genet, hvilket resulterer i øget OSE-akkumulering og åreforkalkning, hvilket giver en model for in vivo B-1-celleaktivering og IgM-produktion. Desuden var donor- og recipientmus forskellige i CD45-allotype; donor B-1 celler kom fra CD45.1 + ApoE-/- mus og blev overført til Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- modtagere. Dette gjorde det muligt at skelne mellem donor-CD45.1 fra modtager CD45.2 B-celler efter overførslen uden yderligere at plette for B-cellemarkører under flowcytometrianalyse. Resultaterne her viser, at målrettet CXCR4 overekspression på B-1a celler forbinder med øget evne til B-1a celler til at migrere til knoglemarven, som forbinder med øget plasma anti-OSE IgM. Vi leverer desuden en metode til berigelse af peritoneale B-1 celler gennem negativ udvælgelse og demonstrerer behovet for B-1 celleaktivering for effektiv transduktion. Denne metode kan tilpasses til andre retrovirale konstruktioner for at undersøge effekten af proteinoverekspression på B-1a cellemigration, fænotype eller funktion. Desuden kan anvendelsen af CD45.1 versus CD45.2 allotype skelnen teoretisk tillade overførsel til andre immunforsynende murinemodeller, der indeholder endogene B-celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 micron filter caps</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-biotin microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD16/CD32, or Fc block</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MFCR00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0452-83</td>
			<td>Clone: RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 APCef780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0193-82</td>
			<td>Clone: eBio1D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0232-81</td>
			<td>Clone: B3B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23 PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0232-82</td>
			<td>Clone: B3B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0033-85</td>
			<td>Clone: eBio500A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 ApoE-/- mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bred in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560580</td>
			<td>Clone: A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562895</td>
			<td>Clone: 104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bred in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0051-83</td>
			<td>Clone: 53-7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctl-GFP retrovirus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9991-82</td>
			<td>Clone: 2B11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-GFP retrovirus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MF48015</td>
			<td>Clone: BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo Software v. 9.9.6</td>
			<td>Treestar Inc.</td>
			<td>License required</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr-1 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-82</td>
			<td>Clone: RB6-8C5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562565</td>
			<td>Clone: R6-60.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>029405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Yellow</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1 biotin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553163</td>
			<td>Clone: PK136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ODN 1668</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-1668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>Clone: Ter119</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral overexpression of cxcr4 on murine b-1a cells and adoptive transfer for targeted b-1a cell migration to the bone marrow and igm production

Da cellefunktion påvirkes af nichespecifikke faktorer i det cellulære mikromiljø, kan metoder til dissekering af cellelokalisering og migration give yderligere indsigt i cellefunktion. B-1a celler er en unik B-celle delmængde i mus, der producerer beskyttende naturlige IgM antistoffer mod oxidation-specifikke epitoper, der opstår under sundhed og sygdom. B-1a celle IgM produktion varierer afhængigt af B-1a celle placering, og derfor bliver det nyttigt fra et terapeutisk synspunkt at målrette B-1a lokalisering til nicher støtter høj antistofproduktion. Her beskriver vi en metode til at målrette B-1a celle migration til knoglemarven ved retroviral-medieret overekspression af C-X-C motiv chemokine receptor 4 (CXCR4). Geninduktion i primære murine B-celler kan være udfordrende og giver typisk lave transfektioner på 10-20% afhængigt af teknikken. Her viser vi, at retroviral transduktion af primær murine B-1a celler resulterer i 30-40% transduktionseffektivitet. Denne metode anvender adoptivcelleoverførsel af trans inducerede B-1a-celler til B-cellemangel recipientmus, så donor B-1a cellemigration og lokalisering kan visualiseres. Denne protokol kan ændres for andre retrovirale konstruktioner og kan anvendes i forskellige funktionelle analyser efter adoptivoverførsel, herunder analyse af donorcelle- eller værtscellefænotype og funktion, eller analyse af opløselige faktorer, der udskilles efter B-1a-celleoverførsel. Anvendelse af forskellige donor- og recipientmus, der er differentieret efter CD45.1- og CD45.2-allotype, og tilstedeværelsen af en GFP-reporter i det retrovirale plasmid kan også gøre det muligt at detektere donorceller i andre, immunforsynende musemodeller, der indeholder endogene B-cellepopulationer.

Figur 1indeholder en oversigt over protokollen . Figur 2 viser berigelse af peritoneale B-1a-celler efter magnetisk udtømning af andre peritoneale celletyper. Live singlet celler i post-udtynding fraktion har en større andel af CD19 + B-celler i forhold til F4/80+ makrofager, mangler CD5hi CD19- T-celler, og indeholder en øget hyppighed af CD19+ CD5 midten B-1a celler i forhold til pre-udtynding fraktion.mid</s...

Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production at JoVE.c

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

Her beskriver vi en metode til retroviral overekspression og adoptivoverførsel af murine B-1a celler til at undersøge in vivo B-1a cellemigration og lokalisering. Denne protokol kan udvides til forskellige downstream funktionelle analyser, herunder kvantificering af donor B-1a celle lokalisering eller analyse af donor celle-afledte udskillede faktorer post-adoptivoverførsel.

Retroviral overekspression af CXCR4 på Murine B-1a Cells og adoptivoverførsel til målrettet B-1a cellemigration til knoglemarv- og IgM-produktionen

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...

Denne protokol kan vurdere, hvordan målrettet genlevering påvirker B-1a celle lokalisering og funktion og kan være et nyttigt proof of concept tilgang til undersøgelse af gen terapeutiske potentialer in vivo. Denne metode giver en stabil og relativt effektiv genlevering til primære B-1a-celler og gør det muligt at identificere donorcellefænotype og fungere efter adoptivoverførsel. Denne metode kan bruges til at undersøge forskellige donor- og værtscelleprocesser in vivo, herunder celleoverlevelse, spredning og funktion, og kan anvendes på andre adoptivoverførselssystemer.Bughindevæske høst kan være en vanskelig vanskelig. Sørg for at frigøre cellerne grundigt for at maksimere opsvinget og for at undgå at punktere tarmene, som kan forurene din bugcellepopulation. For bughinde B-1 celle samling, bruge lige kirurgisk saks til at gøre en overfladisk snit i maven af en 12 til 14-uger gamle, mandlige, CD45.1 +apolipoprotein E knockout mus, og bruge buede saks til at skrælle tilbage huden for at afsløre bughinden væggen.Ved hjælp af en 10 milliliter sprøjte udstyret med en 25 gauge nål, skyl bughulen med 10 milliliter 37 grader Celsius RPMI-1640 medium. Og tag fat i bunden af halen, så musen kan rystes grundigt fra side til side i 15 til 20 sekunder. Efter omrystning, skal du bruge sprøjten til at aspirere væsken fra nederste højre side af bughinden lige over niveauet af hoften, nær tarmene, idet du skal passe på at undgå at forstyrre epidydimal fedt depoter og underliggende organer.Efter indsamling seks til syv milliliter lavage, dispensere væsken i en 50 milliliter konisk rør på is. Brug hvin til at gribe bugvæggen over mellemgulvet for at tillade lodret højde af dyret, således at eventuelle resterende væske forbliver i bunden af bughulen. Brug kirurgisk saks til at gøre et lille snit i bugvæggen over leveren uden at skære leveren selv.Og bruge et glas pipet og pære til at indsamle eventuelle resterende bughindevæske. Når al væsken er opsamlet, aliquot peritoneal udvaskning celler fra alle mus og tilføje op til en gange 10 til den ottende celler pr rør koncentration i 50 milliliter rør på is. Og sediment cellerne ved centrifugering.Resuspend hver pellet i en milliliter anti-CD16/CD32 antistof fortyndet ved en en til 50 forholdet i assay buffer for en 10 minutters inkubation ved fire grader Celsius. Ved inkubationens afslutning tilsættes et tilsvarende volumen biotinyleret antistofmasterblanding til hvert rør i en 20 minutters inkubation ved fire grader Celsius efterfulgt af en vask i fem milliliter analysebuffer pr. rør. Pellets skal opslæmmes med et passende volumen af antibiotinmikroper og passende inkubationsvarighed i henhold til cellekoncentrationen og fabrikantens anbefaling efterfulgt af en buffervask på fem milliliterassayr vask pr. rør.Resuspend hver pellet i 500 mikroliter af assay buffer og prime det passende antal magnetiske udvælgelse kolonner med tre milliliter assay buffer per kolonne. Cellerne overføres til primede kolonner, der samler elueringstånen indeholdende berigede B-1 celler i et 15 milliliter konisk rør på is. Hver magnetisk udvælgelsessøjle vaskes med yderligere analysebuffer, indtil det samlede indsamlede volumen er 10 milliliter, og den postrenserede cellefraktion skal resuspenres ad gange 10 til den sjette celle pr. milliliterkoncentration i B-cellekulturmedium.For at stimulere de peritoneale B-1-celler, der er afsat mindst en gange 10 til de syvende celler for en ikke-transduced kontrol og opdele de resterende celler i to lige store mængder for transduktion. Cellerne fortyndes til 1,5 gange 10 til de femte celler pr. 150 mikroliter af medium koncentration og tilsættes 150 mikroliter celler til brønde på en 96-brønd rundbundet plade til transduktionstilstand. Derefter tilsættes 100 nanomolar TLR9 agonist til hver brønd og placere pladerne i cellekultur kuvøse i 16 til 18 timer.For retroviral transduktion af bughinden B-celler tø calciumfosfat transftion retroviral partikel bestande på is og straks tilføje til kontrol og chemokine receptor retroviral supernatants til hver brønd af passende plade og mangfoldighed af infektion på 20 til en i nærvær af 8 mikrogram pr milliliter polybren og frisk beta-mercaptoethanol ved 55 mikromolar endelige koncentration. Når alle vira er blevet tilføjet, spinfect cellerne ved centrifugering og placere pladerne i cellen kultur inkubator i tre timer. Ved inkubationens afslutning høstes cellerne til relating i frisk B-cellemedium og inkubation natten over.Efter magnetisk udtynding af andre peritoneale celletyper har levende singletceller i den post-udtyndingfraktion en større andel af CD19+B-celler sammenlignet med F4/80+makrofager og mangel på CD5hi CD19-T-celler, og de indeholder en øget frekvens af CD19+CD5-medium B-1a-celler sammenlignet med den fortyndingsfraktion. Og stigning i hyppigheden af vellykket transduced GFP + B-2, B-1, B-1a, og B-1b celle delmængder er direkte korreleret med stigningen i virus mangfoldighed af infektion. Og transduktionseffektiviteten kan øges yderligere ved hjælp af 96 godt runde bundplader sammenlignet med brugen af 24-brønde eller 6-brøndplader.CXCR4-GFP retrovirus transduktion kan fremkalde en vellykket B-1 celle CXCR4 overekspression og stigning i in vitro migration mod CXCL12 uden en betydelig indvirkning på B-celle levedygtighed. Desuden, adoptivt overført CD45.1 + donorceller vedvarende deres CXCR4 overekspression efter deres helbredelse fra knoglemarven og milt af CD45.2 modtager mus 17 uger efter celleoverførsel. Bemærk, at en positiv sammenhæng mellem CXCR4-udtrykket og donorcelle lokalisering til knoglemarven, men ikke milten, er blevet bestemt.Med en positiv sammenhæng observeret mellem donorcelletal i knoglemarven og plasma mængden af anti-MDA-low density lipoprotein IgM. Mange yderligere teknikker kan udnyttes til at besvare spørgsmål som, hvad er virkningen af målrettet genlevering på sygdomsudvikling, eller som donor stammer hemmelige faktorer påvirker vært fysiologi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Isolation, rensning og mærkning af museknoglemarv Neutrophils for Funktionelle Studier og adoptiv overføring Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Bone Marrow-afledt Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Vurdere udviklingen i murine Plasmacytoid dendritiske celler i Peyer&#39;ske Patches Brug adoptiv overførsel af Hematopoietic Progenitorer

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolation og intravenøs injektion af murine knoglemarv Afledte Monocytter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion af murine tarmbetændelse ved adoptiv overførsel af effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høj</sup&gt; T celler i immunsvækkede mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Murine Hind Limb Lang Bone Dissektion og knoglemarv Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral transduktion af knoglemarven til at generere T-celle receptor Retrogenic Mus

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Femur Window Chamber Model for<em&gt; In vivo</em&gt; Cell Tracking i murine knoglemarv

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...