Name: retroviral overexpression of cxcr4 on murine b-1a cells and adoptive transfer for targeted b-1a cell migration to the bone marrow and igm production
Uploaded: 2020-05-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production at JoVE.c

Dit werk werd ondersteund door 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Project 3 van P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) en R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye werd ondersteund door American Heart Association Pre-doctorale fellowship 16PRE30300002 en 5T32AI007496-20. Wij danken Joanne Lannigan, Mike Solga, en Claude Chew van de Universiteit van Virginia Flow Cytometrie Core voor hun uitstekende technische bijstand.

Alle dierenprotocollen zijn goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Virginia.
1. Magnetische scheiding en verrijking van buikvlies B-1 cellen
<ol><li>Euthanaseren een 12−14 weken oude, man, CD45.1+ApoE-/- muis met CO2.</li>
	<li>Maak een oppervlakkige snede in de buik met behulp van rechte chirurgische schaar en schil terug huid met behulp van gebogen schaar om de buikvlieswand bloot. Spoel de buikholte met 10 mL van 37 °...

<ol>
	<li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+Cell+Heterogeneity+and+the+Regulation+of+Natural+and+Antigen-Induced+IgM+Production.">B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production.</a> Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).</li><li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1a+cell+diversity:+nontemplated+addition+in+B-1a+cell+Ig+is+determined+by+progenitor+population+and+developmental+location.">B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location.</a> Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).</li><li>Prohaska, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Sequencing+of+Peritoneal+and+Splenic+B+Cell+Repertoires+Highlights+Unique+Properties+of+B-1+Cell+Antibodies.">Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies.</a> Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).</li><li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis.">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+define+murine+B+cell+lineage+immunoglobulin+heavy+chain+(IgH)+repertoires.">Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires.</a> Elife. 4, 09083 (2015).</li><li>Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+cells+in+the+bone+marrow+are+a+significant+source+of+natural+IgM.">B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM.</a> European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).</li><li>Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+secretion+by+B1+cells:+Differential+intensity+and+IRF4-dependence+of+spontaneous+IgM+secretion+by+peritoneal+and+splenic+B1+cells.">Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells.</a> European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).</li><li>Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+migration+of+peritoneal+B-1+cells+is+associated+with+upregulation+of+CXCR4+and+increased+migratory+sensitivity+to+CXCL12.">LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12.</a> Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasma+cell+alloantigen+1+defines+layered+development+of+B-1a+B-cell+subsets+with+distinct+innate-like+functions.">Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).</li><li>Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+and+differentiation+of+natural+antibody-producing+cells+in+mouse+spleen.">Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).</li><li>Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+cell+immunoglobulin+directed+against+oxidation-specific+epitopes.">B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+of+murine+B+lymphocyte+blasts+as+a+method+for+examining+gene+regulation+in+primary+B+cells.">Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells.</a> Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).</li><li>Lin, K. I., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+genes+into+primary+murine+splenic+B+cells+using+retrovirus+vectors.">Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).</li><li>Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Ex+Vivo+Gene+Transfer+to+Primary+Murine+B+Cells+Using+Plasmid+or+Viral+Vectors.">High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).</li><li>DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+expression+of+the+interleukin-7+receptor+in+lymphoid+progenitors.">PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors.</a> Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).</li><li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Decline+in+Natural+IgM+Function:+Diversification+and+Selection+of+the+B-1a+Cell+Pool+with+Age.">Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age.</a> The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).</li><li>Laurie, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+and+efficient+expression+in+mouse+and+human+B+cells+by+a+novel+hybrid+immunoglobulin+promoter+in+a+lentiviral+vector.">Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).</li><li>Warncke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vitro+transduction+of+naive+murine+B+cells+with+lentiviral+vectors.">Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).</li><li>Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IL-5+for+mature+B-1+cells+in+homeostatic+proliferation,+cell+survival,+and+Ig+production.">The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production.</a> Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).</li><li>Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+5+in+the+link+between+the+innate+and+acquired+immune+response.">Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response.</a> Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).</li><li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double+life+of+a+B-1+cell:+self-reactivity+selects+for+protective+effector+functions.">The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).</li></ol>

De hier geboden methode maakt stabiele en relatief efficiënte primaire B-1a-celgenlevering, in vivo adoptieoverdracht en identificatie en lokalisatie van geïnjecteerde cellen mogelijk. Cellen konden worden gedetecteerd 17 weken na de cel overdracht en behouden verhoogde CXCR4 expressie. Retrovirus-gemedieerde levering leverde 30-40% transductie-efficiëntie van primaire murine B-1a cellen met minimale impact op de levensvatbaarheid van de cel in onze handen(figuur 4e). Dit is in lijn met d...

Recente studies hebben aangetoond aanzienlijke immuuncel, en met name B-cel, fenotypische en functionele heterogeniteit, afhankelijk van cellokalisatie1,2,3,4,5. B-1a cellen zijn een dergelijke populatie met heterogene capaciteit om beschermende IgM-antilichamen te produceren; beenmerg B-1a cellen scheiden IgM constitutief en dragen aanzienlijk bij aan plasma IgM titers6, terwijl peritoneale B-1a cellen hebben low-level IgM secretie op homeostase en in plaats daarvan kan worden geactiveerd door aangeboren tol-achtige receptor (TLR) of cytokine-gemedieerde signalering om snel te vermenigvuldigen, migreren en scheiden IgM7,8,9,10. B-1a-cel IgM-antilichamen herkennen oxidatiespecifieke epitopen (OSE) die aanwezig zijn op pathogenen, apoptotische cellen en geoxideerde LDL, en IgM-binding aan OSE kunnen ontstekings downstream signalering voorkomen bij ziekten zoals atherosclerose11. Daarom kunnen strategieën om de IgM-productie te verhogen via het verhogen van peritoneale B-1a-celmigratie naar sites zoals het beenmerg therapeutisch nuttig zijn. Het is echter belangrijk dat dergelijke strategieën worden gericht en cel-type specifiek, als off-target effecten kunnen een negatieve invloed hebben op de immuunfunctie of gezondheid.
Hier beschrijven we een methode voor gerichte en langdurige overexpressie van CXCR4 in primaire murine B-1a cellen en de daaropvolgende adoptieoverdracht om celmigratie en functionele IgM-antilichaamproductie te visualiseren(figuur 1). Genetische manipulatie van primaire B-cellen wordt beperkt door lage transfectie-efficiëntie in vergelijking met transfectie van getransformeerde cellijnen. Aangezien getransformeerde cellijnen echter aanzienlijk kunnen afwijken van primaire cellen12,13,biedt het gebruik van primaire cellen waarschijnlijk resultaten die beter aansluiten op de normale fysiologie. Er zijn verschillende technieken beschreven voor genoverdracht in primaire murine B-cellen, waaronder retrovirale transductie, adenovirale transductie, lipofection of transporatiegebaseerde transfectie, die verschillende niveaus van efficiëntie, vergankelijkheid en impact hebben op de gezondheid van cellen13,14,15. De volgende methode gebruikt retrovirale transductie als het leverde voldoende genoverdracht efficiëntie van >30% terwijl een minimale invloed op de levensvatbaarheid van cellen. Het CXCR4-uitdrukkende retrovirus werd gegenereerd met behulp van de eerder beschreven retrovirale constructie murine stamcelvirus-interne ribosomale entry site-groene fluorescente eiwit (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, waarin de muis CXCR4 gen was sub-gekloond4. MigR1 (control(Ctl)-GFP) en CXCR4-GFP retrovirale deeltjes werden gegenereerd met behulp van calciumfosfaattransfectie zoals beschreven in eerder gepubliceerde protocollen4,14.
Succesvol getransduceerde B-1a cellen werden vervolgens intraveneus overgebracht naar lymfocyten-deficiënte Rag1-/- muizen. Zowel donor- als ontvangermuizen bevatten bovendien knock-out van het apolipoprotein E (ApoE)-gen, wat resulteert in een verhoogde OSE-accumulatie en atherosclerose, waardoor een model wordt voor in vivo B-1 celactivering en IgM-productie. Bovendien verschilden donor- en ontvangermuizen in CD45-allotype; donor B-1 cellen kwamen van CD45.1+ ApoE-/- muizen en werden overgebracht naar Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- ontvangers. Dit toegestaan differentiatie van donor CD45.1 van ontvanger CD45.2 B cellen post-overdracht zonder de noodzaak om bovendien vlek voor B-cel markers tijdens flow cytometrie analyse. De hier verstrekte resultaten tonen aan dat gerichte CXCR4 overexpressie op B-1a cellen associeert met een verhoogd vermogen van B-1a cellen om te migreren naar het beenmerg, die associeert met verhoogde plasma anti-OSE IgM. Daarnaast bieden we een methode voor de verrijking van buikvlies B-1 cellen door negatieve selectie en tonen we de eis van B-1 celactivering voor efficiënte transductie. Deze methode kan worden aangepast voor andere retrovirale constructies om het effect van eiwitoverexpressie op B-1a-celmigratie, fenotype of functie te bestuderen. Bovendien zou het gebruik van CD45.1 versus CD45.2 allotype onderscheid theoretisch overdracht naar andere immuun-voldoende murinemodellen met endogene B-cellen mogelijk kunnen maken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 micron filter caps</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-biotin microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD16/CD32, or Fc block</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MFCR00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0452-83</td>
			<td>Clone: RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 APCef780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0193-82</td>
			<td>Clone: eBio1D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0232-81</td>
			<td>Clone: B3B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23 PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0232-82</td>
			<td>Clone: B3B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0033-85</td>
			<td>Clone: eBio500A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 ApoE-/- mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bred in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560580</td>
			<td>Clone: A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562895</td>
			<td>Clone: 104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bred in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0051-83</td>
			<td>Clone: 53-7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctl-GFP retrovirus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9991-82</td>
			<td>Clone: 2B11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-GFP retrovirus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MF48015</td>
			<td>Clone: BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo Software v. 9.9.6</td>
			<td>Treestar Inc.</td>
			<td>License required</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr-1 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-82</td>
			<td>Clone: RB6-8C5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562565</td>
			<td>Clone: R6-60.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>029405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Yellow</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1 biotin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553163</td>
			<td>Clone: PK136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ODN 1668</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-1668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>Clone: Ter119</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral overexpression of cxcr4 on murine b-1a cells and adoptive transfer for targeted b-1a cell migration to the bone marrow and igm production

Aangezien de celfunctie wordt beïnvloed door nichespecifieke factoren in de cellulaire micro-omgeving, kunnen methoden om cellokalisatie en migratie te ontleden, verder inzicht geven in de celfunctie. B-1a cellen zijn een unieke B-cel subset in muizen die beschermende natuurlijke IgM antilichamen produceren tegen oxidatie-specifieke epitopen die ontstaan tijdens de gezondheid en ziekte. B-1a cel IgM productie verschilt afhankelijk van B-1a cel locatie, en daarom wordt het nuttig vanuit een therapeutisch oogpunt te richten B-1a lokalisatie niches ondersteunen van hoge antilichaam productie. Hier beschrijven we een methode om B-1a celmigratie naar het beenmerg te richten door retrovirale gemedieerde overexpressie van het C-X-C motief chemokine receptor 4 (CXCR4). Geninductie in primaire murine B-cellen kan uitdagend zijn en levert meestal lage transfectie-efficiëntie van 10-20% op, afhankelijk van de techniek. Hier tonen we aan dat retrovirale transductie van primaire murine B-1a cellen resulteert in 30-40% transductie-efficiëntie. Deze methode maakt gebruik van adoptieceloverdracht van getransduceerde B-1a cellen in B-cel-deficiënte ontvangende muizen, zodat donor B-1a celmigratie en lokalisatie kan worden gevisualiseerd. Dit protocol kan worden gewijzigd voor andere retrovirale constructies en kan worden gebruikt in diverse functionele tests post-adoptieve overdracht, met inbegrip van analyse van donorcel of gastheer cel fenotype en functie, of analyse van oplosbare factoren afgescheiden post B-1a cel overdracht. Het gebruik van verschillende donor- en ontvangermuizen, onderscheiden door CD45.1 en CD45.2-allotype en de aanwezigheid van een GFP-verslaggever binnen het retrovirale plasmide, zou ook de detectie van donorcellen in andere, immuun-toereikende muismodellen met endogene B-celpopulaties mogelijk kunnen maken.

Een overzicht van het protocol is te vinden in figuur 1. Figuur 2 toont verrijking van buikvlies B-1a cellen na magnetische uitputting van andere peritoneale celtypen. Levende singlet cellen in de post-uitputting fractie hebben een groter percentage van CD19 + B cellen in vergelijking met F4/80+ macrofagen, gebrek aan CD5hi CD19- T cellen, en bevatten een verhoogde frequentie van CD19+ CD5mid B-1a cellen in ...

Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production at JoVE.c

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

Hier beschrijven we een methode voor retrovirale overexpressie en adoptieoverdracht van murine B-1a cellen om in vivo B-1a celmigratie en lokalisatie te onderzoeken. Dit protocol kan worden uitgebreid voor diverse downstream functionele tests, waaronder kwantificering van donor B-1a cellokalisatie of analyse van donorcel-afgeleide gedesinteveneerde factoren na adoptieve overdracht.

Retrovirale overexpressie van CXCR4 op Murine B-1a Cellen en adoptieve overdracht voor gerichte B-1a celmigratie naar het beenmerg en igm productie

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...

Dit protocol kan evalueren hoe gerichte genlevering b-1a-cellokalisatie en -functie beïnvloedt en kan een nuttige proof of concept-benadering zijn voor het onderzoeken van gentherapeutische potentialen in vivo. Deze methode biedt een stabiele en relatief efficiënte genlevering aan primaire B-1a-cellen en maakt de identificatie van donorcelfenotype en functie na adoptieve overdracht mogelijk. Deze methode kan worden gebruikt om diverse donor- en gastheercelprocessen in vivo te onderzoeken, waaronder celoverleving, proliferatie en functie, en kan worden toegepast op andere adoptiesystemen.Peritoneale vloeistof oogsten kan lastig zijn. Zorg ervoor dat u de cellen grondig losmaakt om het herstel te maximaliseren en om te voorkomen dat de darmen worden doorboren die uw buikcelpopulatie kunnen besmetten. Voor peritoneale B-1 cel collectie, gebruik rechte chirurgische schaar om een oppervlakkige snede in de buik van een 12 tot 14 weken oud, man, CD45.1 + apolipoprotein E knock-out muis te maken, en gebruik gebogen schaar terug te pellen van de huid om de peritoneale muur bloot te stellen.Met behulp van een 10 milliliter spuit uitgerust met een 25-meter naald, spoel de buikvliesholte met 10 milliliter van 37 graden Celsius RPMI-1640 medium. En pak de basis van de staart om de muis te grondig worden geschud van links naar rechts voor 15 tot 20 seconden. Na het schudden, gebruik maken van de spuit om de vloeistof aan tezuilen van de rechterbenedenzijde van het buikvlies net boven het niveau van de heup, in de buurt van de darmen, het verzorgen om te voorkomen dat het verstoren van de epidydimale vet depots en onderliggende organen.Na het verzamelen van zes tot zeven milliliter spoeling, deed de vloeistof in een 50 milliliter conische buis op ijs. Gebruik tangen om de buikvlieswand boven het middenrif te grijpen om verticale hoogte van het dier mogelijk te maken, zodat de resterende vloeistof op de bodem van de buikholte blijft. Gebruik een chirurgische schaar om een kleine snede in de buikvlieswand boven de lever te maken zonder de lever zelf te snijden.En gebruik een glazen pipet en lamp om de resterende buikvliesvloeistof te verzamelen. Wanneer alle vloeistof is verzameld, aliquot de peritoneale washout cellen van alle muizen en toe te voegen tot een keer 10 tot de achtste cellen per buis concentratie in 50 milliliter buizen op ijs. En sediment de cellen door centrifugatie.Resuspend elke pellet in een milliliter anti-CD16/CD32 antilichaam verdund op een een tot 50 verhouding in testbuffer voor een 10 minuten incubatie bij vier graden Celsius. Voeg aan het einde van de incubatie een gelijk volume van biotinylated antilichaam master mix toe aan elke buis voor een incubatie van 20 minuten bij vier graden Celsius, gevolgd door een wasbeurt in vijf milliliter testbuffer per buis. De pellets opnieuw opschorten met het juiste volume antibiotinemicrobeads en de juiste incubatieduur volgens de celconcentratie en de aanbeveling van de fabrikant, gevolgd door een bufferwassing van vijf milliliter per buis.Resuspend elke pellet in 500 microliter van testbuffer en prime het juiste aantal magnetische selectiekolommen met drie milliliter testbuffer per kolom. Breng de cellen over op geprimede kolommen die het eluent verzamelen dat verrijkte B-1 cellen bevat in een 15 milliliter conische buis op ijs. Dan was elke magnetische selectiekolom met extra testbuffer tot het totale verzamelde volume 10 milliliter is en resuspend de post-gezuiverde celfractie bij één keer 10 tot de zesde cellen per milliliterconcentratie in het celkweekmiddel van B.Om de peritoneale B-1 cellen opzij te zetten ten minste een keer 10 tot de zevende cellen voor een niet-getransduceerde controle en split de resterende cellen in twee gelijke volumes voor transductie. Verdun de cellen tot 1,5 keer 10 tot de vijfde cellen per 150 microliter van gemiddelde concentratie en voeg 150 microliter cellen toe aan putten van een 96-well ronde bodemplaat voor transductievoorwaarde. Voeg vervolgens 100 nanomolar TLR9-agonist toe aan elke put en plaats de platen 16 tot 18 uur in de couveuse van de celcultuur.Voor retrovirale transductie van de peritoneale B-cellen ontdooien calciumfosfaat transfectie retrovirale deeltjesvoorraden op ijs en onmiddellijk toe te voegen aan de controle en de chemokine receptor retrovirale supernatants aan elke put van de juiste plaat en multipliciteit van infectie van 20 tot een in aanwezigheid van 8 microgram per milliliter polybrene en verse beta-mercapthantoeol bij 55 micromolar definitieve concentratie. Wanneer alle virussen zijn toegevoegd, spinfect de cellen door centrifugatie en plaats de platen in de cel cultuur incubator voor drie uur. Oogst aan het einde van de incubatie de cellen voor replating in vers B-celmedium en een nachtelijke incubatie.Na magnetische uitputting van andere peritoneale celtypen hebben levende singletcellen in de post-depletiefractie een groter percentage CD19+B-cellen in vergelijking met F4/80+macrofagen en een gebrek aan CD5hi CD19-T-cellen, en ze bevatten een verhoogde frequentie van CD19+CD5-medium B-1a-cellen in vergelijking met de voordepletiefractie. En toename van de frequentie van succesvol getransduceerde GFP+B-2, B-1, B-1a en B-1b-celsubsets is direct gecorreleerd aan de toename van de virusmultiiteit van infectie. En de transductie-efficiëntie kan verder worden verhoogd met behulp van 96 goed ronde bodem platen in vergelijking met het gebruik van 24-well of 6-well platen.CXCR4-GFP retrovirus transductie kan leiden tot een succesvolle B-1 cel CXCR4 overexpressie en toename van in vitro migratie naar CXCL12 zonder een significante impact op de levensvatbaarheid van B-cellen. Bovendien, adoptief overgedragen CD45.1 +donorcellen ondersteund hun CXCR4 overexpressie na hun herstel van het beenmerg en milt van CD45.2 ontvanger muizen 17 weken na de cel overdracht. Opmerkteken, een positief verband tussen de CXCR4-expressie en de lokalisatie van de donorcel met het beenmerg, maar niet de milt, is vastgesteld.Met een positieve associatie waargenomen tussen donorcelnummers in het beenmerg en de plasmahoeveelheid anti-MDA-low density lipoprotein IgM. Veel extra technieken kunnen worden gebruikt om vragen te beantwoorden, zoals, wat is de impact van gerichte genlevering op de ontwikkeling van ziekten of welke donor afgeleide geheime factoren van invloed gastheer fysiologie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Recombinante retrovirale Productie en Infectie van B-cellen

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generatie en etikettering van Muriene Bone Marrow-afgeleide dendritische cellen met Qdot Nanokristallen voor Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Isolatie, zuivering en etikettering van de Muis Bone Marrow Neutrophils voor functionele studies en adoptieve overdracht Experimenten

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Bone Marrow-afgeleide macrofagen Productie

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Het beoordelen van de ontwikkeling van de Muriene plasmacytoïde dendritische cellen in Peyer&#39;s Patches Met behulp adoptieve overdracht van hematopoëtische voorlopers

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolatie en intraveneuze injectie van muizen beenmerg afgeleide Monocyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoog</sup&gt; T cellen in immunodeficiënte muizen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Murine Hind Limb Long Bone Dissection en Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retrovirale Transductie van beenmerg stamcellen voor het genereren van T-cel Receptor Retrogenic Muizen

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Dijbeen Window Chamber Model voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Tracking in het Muizen Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...