Name: retroviral overexpression of cxcr4 on murine b-1a cells and adoptive transfer for targeted b-1a cell migration to the bone marrow and igm production
Uploaded: 2020-05-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production at JoVE.c

Dette arbeidet ble støttet av 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Prosjekt 3 av P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) og R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye ble støttet av American Heart Association Pre-doktorstipend 16PRE30300002 og 5T32AI007496-20. Vi takker Joanne Lannigan, Mike Solga og Claude Chew fra University of Virginia Flow Cytometry Core for deres utmerkede tekniske hjelp.

Alle dyreprotokoller ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved University of Virginia.
1. Magnetisk separasjon og berikelse av peritoneale B-1-celler
<ol><li>Euthanize en 12-14 uker gammel, mann, CD45.1+ApoE-/- mus ved hjelp av CO2.</li>
	<li>Lag et overfladisk kutt i magen ved hjelp av rett kirurgisk saks og skrell tilbake huden ved hjelp av buet saks for å eksponere bukveggen. Skyll bukhulen med 10 ml 37 °C RPMI-1640 medium med en 10 ml sprøyte o...

<ol>
	<li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+Cell+Heterogeneity+and+the+Regulation+of+Natural+and+Antigen-Induced+IgM+Production.">B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production.</a> Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).</li><li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1a+cell+diversity:+nontemplated+addition+in+B-1a+cell+Ig+is+determined+by+progenitor+population+and+developmental+location.">B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location.</a> Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).</li><li>Prohaska, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Sequencing+of+Peritoneal+and+Splenic+B+Cell+Repertoires+Highlights+Unique+Properties+of+B-1+Cell+Antibodies.">Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies.</a> Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).</li><li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis.">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+define+murine+B+cell+lineage+immunoglobulin+heavy+chain+(IgH)+repertoires.">Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires.</a> Elife. 4, 09083 (2015).</li><li>Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+cells+in+the+bone+marrow+are+a+significant+source+of+natural+IgM.">B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM.</a> European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).</li><li>Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+secretion+by+B1+cells:+Differential+intensity+and+IRF4-dependence+of+spontaneous+IgM+secretion+by+peritoneal+and+splenic+B1+cells.">Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells.</a> European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).</li><li>Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+migration+of+peritoneal+B-1+cells+is+associated+with+upregulation+of+CXCR4+and+increased+migratory+sensitivity+to+CXCL12.">LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12.</a> Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasma+cell+alloantigen+1+defines+layered+development+of+B-1a+B-cell+subsets+with+distinct+innate-like+functions.">Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).</li><li>Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+and+differentiation+of+natural+antibody-producing+cells+in+mouse+spleen.">Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).</li><li>Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+cell+immunoglobulin+directed+against+oxidation-specific+epitopes.">B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+of+murine+B+lymphocyte+blasts+as+a+method+for+examining+gene+regulation+in+primary+B+cells.">Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells.</a> Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).</li><li>Lin, K. I., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+genes+into+primary+murine+splenic+B+cells+using+retrovirus+vectors.">Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).</li><li>Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Ex+Vivo+Gene+Transfer+to+Primary+Murine+B+Cells+Using+Plasmid+or+Viral+Vectors.">High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).</li><li>DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+expression+of+the+interleukin-7+receptor+in+lymphoid+progenitors.">PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors.</a> Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).</li><li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Decline+in+Natural+IgM+Function:+Diversification+and+Selection+of+the+B-1a+Cell+Pool+with+Age.">Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age.</a> The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).</li><li>Laurie, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+and+efficient+expression+in+mouse+and+human+B+cells+by+a+novel+hybrid+immunoglobulin+promoter+in+a+lentiviral+vector.">Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).</li><li>Warncke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vitro+transduction+of+naive+murine+B+cells+with+lentiviral+vectors.">Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).</li><li>Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IL-5+for+mature+B-1+cells+in+homeostatic+proliferation,+cell+survival,+and+Ig+production.">The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production.</a> Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).</li><li>Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+5+in+the+link+between+the+innate+and+acquired+immune+response.">Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response.</a> Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).</li><li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double+life+of+a+B-1+cell:+self-reactivity+selects+for+protective+effector+functions.">The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).</li></ol>

Metoden som tilbys her muliggjør stabil og relativt effektiv primær B-1a celle genlevering, in vivo adoptivoverføring, og identifisering og lokalisering av injiserte celler. Celler kunne oppdages 17 uker etter celleoverføring og beholdt økt CXCR4-uttrykk. Retrovirus-mediert levering ga 30-40% transduksjonseffektivitet av primære murine B-1a celler med minimal innvirkning på celle levedyktighet i våre hender (Figur 4e). Dette er i tråd med resultater fra en tidligere studie av Moghim...

Nyere studier har vist betydelig immuncelle, og spesielt B celle, fenotypisk og funksjonell heterogenitet avhengig av celle lokalisering1,2,3,4,5. B-1a celler er en slik populasjon med heterogen kapasitet til å produsere beskyttende IgM antistoffer; benmarg B-1a celler utskiller IgM konstitutivt og bidra betydelig til plasma IgM titers6,mens peritoneal B-1a celler har lavt nivå IgM sekresjon på homeostase og i stedet kan aktiveres gjennom medfødt toll-lignende reseptor (TLR) eller cytokin-mediert signalering til raskt proliferate, migrere og skille ut IgM7,8,9,10. B-1a celle IgM antistoffer gjenkjenne oksidasjon-spesifikke epitoper (OSE) som er tilstede på patogener, apoptotiske celler, og oksidert LDL, og IgM binding til OSE kan forhindre inflammatorisk nedstrøms signalering i sykdommer som aterosklerose11. Derfor kan strategier for å øke IgM-produksjonen via økende peritoneal B-1a cellemigrasjon til steder som benmargen være terapeutisk nyttig. Det er imidlertid viktig at slike strategier målrettes og celletypespesifikke, da off-target effekter kan påvirke immunforsvaret eller helsen negativt.
Her beskriver vi en metode for målrettet og langsiktig overuttrykk av CXCR4 i primære murine B-1a celler og påfølgende adoptivoverføring for å visualisere cellemigrasjon og funksjonell IgM antistoffproduksjon (Figur 1). Genetisk manipulering av primære B-celler er begrenset av lav transfeksjoneffektivitet sammenlignet med transfeksjon av transformerte cellelinjer. Men som forvandlede cellelinjer kan betydelig avvike fra primære celler12,13, bruk av primære celler er sannsynlig å gi resultater som tettere justere til normal fysiologi. Flere teknikker har blitt beskrevet for genoverføring i primære murine B-celler, inkludert retroviral transduksjon, adenoviral transduction, fettspirasjon, eller elektroporasjonsbasert transfeksjon, som har varierende nivåer av effektivitet, transience, og innvirkning på cellehelse13,14,15. Følgende metode benyttet retroviral transduksjon da det ga tilstrekkelig genoverføringseffektivitet på > 30% mens det minimalt påvirket celle levedyktigheten. CXCR4-uttrykkende retrovirus ble generert ved hjelp av det tidligere beskrevne retrovirale konstruksjonen murine stamcellevirus-intern ribosomalt oppføring sted-grønn fluorescerende protein (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, der musen CXCR4 genet ble sub-klonet4. MigR1 (control(Ctl)-GFP) og CXCR4-GFP retrovirale partikler ble generert ved hjelp av kalsiumfosfattransfeksjon som beskrevet i tidligere publiserte protokoller4,,14.
Vellykket transdusert B-1a celler ble deretter intravenøst overført til lymfocytter-mangelfull Rag1-/- mus. Både donor- og mottakermus inneholdt i tillegg knockout av apolipoprotein E (ApoE)-genet, noe som resulterer i økt OSE-akkumulering og aterosklerose, og gir dermed en modell for in vivo B-1-celleaktivering og IgM-produksjon. Videre var donor- og mottakermus forskjellig i CD45 allotype; donor B-1-celler kom fra CD45.1+ ApoE-/- mus og ble overført til Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- mottakere. Dette tillot differensiering av donor CD45.1 fra mottaker CD45.2 B-celler etter overføring uten å måtte i tillegg beise for B-cellemarkører under flowcytometrianalyse. Resultatene som er gitt her viser at målrettet CXCR4 overuttrykk på B-1a celler forbinder med økt evne til B-1a celler til å migrere til benmargen, som forbinder med økt plasma anti-OSE IgM. Vi gir i tillegg en metode for berikelse av peritoneale B-1-celler gjennom negativt utvalg og demonstrerer kravet om B-1-celleaktivering for effektiv transduksjon. Denne metoden kan tilpasses andre retrovirale konstruksjoner for å studere effekten av proteinoveruttrykk på B-1a cellemigrasjon, fenotype eller funksjon. Videre kan bruk av CD45.1 versus CD45.2 allotype skillet teoretisk tillate overføring til andre immunforsynte murinmodeller som inneholder endogene B-celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 micron filter caps</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-biotin microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD16/CD32, or Fc block</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MFCR00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0452-83</td>
			<td>Clone: RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 APCef780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0193-82</td>
			<td>Clone: eBio1D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0232-81</td>
			<td>Clone: B3B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23 PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0232-82</td>
			<td>Clone: B3B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0033-85</td>
			<td>Clone: eBio500A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 ApoE-/- mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bred in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560580</td>
			<td>Clone: A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562895</td>
			<td>Clone: 104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bred in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0051-83</td>
			<td>Clone: 53-7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctl-GFP retrovirus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9991-82</td>
			<td>Clone: 2B11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-GFP retrovirus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MF48015</td>
			<td>Clone: BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo Software v. 9.9.6</td>
			<td>Treestar Inc.</td>
			<td>License required</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr-1 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-82</td>
			<td>Clone: RB6-8C5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562565</td>
			<td>Clone: R6-60.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>029405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Yellow</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1 biotin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553163</td>
			<td>Clone: PK136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ODN 1668</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-1668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>Clone: Ter119</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral overexpression of cxcr4 on murine b-1a cells and adoptive transfer for targeted b-1a cell migration to the bone marrow and igm production

Ettersom cellefunksjonen påvirkes av nisjespesifikke faktorer i det cellulære mikromiljøet, kan metoder for å dissekere cellelokalisering og migrasjon gi ytterligere innsikt i cellefunksjonen. B-1a celler er en unik B celle undergruppe hos mus som produserer beskyttende naturlige IgM antistoffer mot oksidasjonsspesifikke epitoper som oppstår under helse og sykdom. B-1a celle IgM produksjon varierer avhengig av B-1a celle plassering, og derfor blir det nyttig fra et terapeutisk synspunkt for å målrette B-1a lokalisering til nisjer som støtter høy antistoffproduksjon. Her beskriver vi en metode for å målrette B-1a cellemigrasjon til benmargen ved retroviral-mediert overuttrykk av C-X-C motiv chemokinreseptor 4 (CXCR4). Geninduksjon i primære murine B-celler kan være utfordrende og gir vanligvis lav transfeksjonseffektivitet på 10-20% avhengig av teknikk. Her viser vi at retroviral transduksjon av primære murine B-1a celler resulterer i 30-40% transduksjon effektivitet. Denne metoden benytter adoptivcelleoverføring av transduserte B-1a-celler til B-cellemangeldende mottakermus, slik at donor B-1a cellemigrasjon og lokalisering kan visualiseres. Denne protokollen kan endres for andre retrovirale konstruksjoner og kan brukes i ulike funksjonelle analyser etter adoptivoverføring, inkludert analyse av donorcelle eller vertscellefenotype og funksjon, eller analyse av løselige faktorer utskilt etter B-1a celleoverføring. Bruken av distinkte donor- og mottakermus differensiert av CD45.1 og CD45.2 allotype og tilstedeværelsen av en GFP-reporter i retroviral plasmid kan også muliggjøre deteksjon av donorceller i andre, immunforsynte musemodeller som inneholder endogene B-cellepopulasjoner.

En oversikt over protokollen er gitt i figur 1. Figur 2 viser berikelse av peritoneale B-1a-celler etter magnetisk uttømming av andre peritoneale celletyper. Levende singletceller i post-uttømmingsfraksjonen har en større andel av CD19 + B-celler sammenlignet med F4/80+ makrofager, mangler CD5hi CD19- T-celler, og inneholder en økt frekvens av CD19+ CD5mid B-1a celler sammenlignet med pre-uttømmingfraks...

Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production at JoVE.c

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

Her beskriver vi en metode for retroviral overuttrykk og adoptivoverføring av murine B-1a celler for å undersøke in vivo B-1a cellemigrasjon og lokalisering. Denne protokollen kan utvides for ulike nedstrøms funksjonelle analyser, inkludert kvantifisering av donor B-1a celle lokalisering eller analyse av donor celle-avledede utskillede faktorer etter adoptivoverføring.

Retroviral overuttrykk av CXCR4 på Murine B-1a celler og adoptivoverføring for målrettet B-1a Cell Migration til benmargen og IgM-produksjonen

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...

Denne protokollen kan vurdere hvordan målrettet genlevering påvirker B-1a celle lokalisering og funksjon og kan være et nyttig bevis på konsept tilnærming for å undersøke genterapeutiske potensialer in vivo. Denne metoden gir en stabil og relativt effektiv genlevering til primære B-1a-celler og tillater identifisering av donorcellefenotype og funksjon etter adoptivoverføring. Denne metoden kan brukes til å undersøke ulike donor- og vertscelleprosesser in vivo, inkludert celleoverlevelse, spredning og funksjon, og kan brukes på andre adoptivoverføringssystemer.Peritoneal væskehøsting kan være vanskelig. Sørg for å løsne cellene grundig for å maksimere utvinningen og for å unngå å punktere tarmene som kan forurense din peritoneale cellepopulasjon. For peritoneal B-1 celle samling, bruk rett kirurgisk saks for å lage en overfladisk kutt i magen av en 12 til 14 uker gammel, mann, CD45.1 + apolipoprotein E knockout mus, og bruk buet saks for å skrelle tilbake huden for å avsløre peritoneal veggen.Bruk en 10 milliliter sprøyte utstyrt med en 25 gauge nål, skyll bukhinnen med 10 milliliter på 37 grader Celsius RPMI-1640 medium. Og ta tak i bunnen av halen for å la musen bli grundig rystet fra side til side i 15 til 20 sekunder. Etter risting, bruk sprøyten til å aspirere væsken fra nedre høyre side av bukhinnen like over hoftenivået, nær tarmene, og vær forsiktig for å unngå å forstyrre epidydimale fettdepoter og underliggende organer.Etter å ha samlet seks til syv milliliter lavage, dispenserer væsken inn i et 50 milliliter konisk rør på is. Bruk tang for å gripe den peritoneale veggen over membranen for å tillate vertikal heving av dyret slik at eventuell gjenværende væske forblir på bunnen av bukhulen. Bruk kirurgisk saks for å lage et lite kutt i bukhinneveggen over leveren uten å kutte leveren selv.Og bruk en glasspipet og pære for å samle eventuell gjenværende bukhinnevæske. Når all væsken er samlet inn, aliquot peritoneal utvasking celler fra alle musene og legge opp til en ganger 10 til åttende celler per rør konsentrasjon i 50 milliliter rør på is. Og sediment cellene ved sentrifugering.Resuspend hver pellet i en milliliter anti-CD16/CD32 antistoff fortynnet med en en til 50 ratio i analysebuffer for en 10 minutters inkubasjon ved fire grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, tilsett et likt volum av biotinylert antistoff master blanding til hvert rør for en 20 minutters inkubasjon ved fire grader Celsius etterfulgt av en vask i fem milliliter av analysebuffer per rør. Resuspend pellets med riktig volum av anti-biotin mikroperler og passende inkubasjon varighet i henhold til cellekonsentrasjon og produsentens anbefaling etterfulgt av en fem milliliter analyse buffer vask per rør.Gjenoppussetter hver pellet i 500 mikroliter med analysebuffer og prime riktig antall magnetiske valgkolonner med tre milliliter analysebuffer per kolonne. Overfør cellene til primede kolonner som samler eluent som inneholder berikede B-1-celler i et konisk 15 milliliter konisk rør på is. Vask deretter hver magnetiske markeringskolonne med ekstra analysebuffer til det samlede samlede volumet er 10 milliliter og gjenbruker den postrensede cellefraksjonen på en gang 10 til de sjette cellene per milliliter konsentrasjon i B-cellekulturmedium.For å stimulere de peritoneale B-1-cellene settes til side minst en ganger 10 til de syvende cellene for en ikke-transdusert kontroll og deler de resterende cellene i to like volumer for transduksjon. Fortynn cellene til 1,5 ganger 10 til de femte cellene per 150 mikroliter med middels konsentrasjon og tilsett 150 mikroliter celler til brønner av en 96-brønn rundbunnsplate for transduksjonstilstand. Tilsett deretter 100 nanomolar TLR9-agonist til hver brønn og legg platene i cellekulturinkubatoren i 16 til 18 timer.For retroviral transduksjon av peritoneal B-cellene tine kalsiumfosfat transfection retrovirale partikkellagre på is og umiddelbart legge til kontroll og kjemokin reseptor retrovirale supernatanter til hver brønn av riktig plate og mangfold av infeksjon på 20 til en i nærvær av 8 mikrogram per milliliter polyber og frisk beta-mercaptoethanol ved 55 mikromos endelige konsentrasjon. Når alle virusene er lagt til, spinfect cellene ved sentrifugering og plassere platene i cellekulturinkubatoren i tre timer. På slutten av inkubasjonen høster cellene for replating i frisk B-cellemedium og en overnattingsinkubasjon.Etter magnetisk uttømming av andre peritoneale celletyper, har levende singletceller i brøk etter uttømming en større andel av CD19 + B-celler sammenlignet med F4 / 80 + makrofager, og mangel på CD5hi CD19-T-celler, og de inneholder en økt frekvens av CD19 + CD5 medium B-1a celler sammenlignet med pre-depletion brøk. Og økning i hyppigheten av vellykket transdusert GFP + B-2, B-1, B-1a, og B-1b celle undergrupper er direkte korrelert til økningen i virus mangfold av infeksjon. Og transduksjonseffektiviteten kan økes ytterligere ved hjelp av 96 godt runde bunnplater sammenlignet med bruk av 24-brønns eller 6-brønnsplater.CXCR4-GFP retrovirustransduksjon kan indusere en vellykket B-1 celle CXCR4 overuttrykk og økning i in vitro migrasjon mot CXCL12 uten en betydelig innvirkning på B celle levedyktighet. I tillegg overførte adoptivt CD45.1+donorceller sin CXCR4-overuttrykk etter at de ble frisk etter at de ble frisk etter benmargen og miltene til CD45.2-mottakermus 17 uker etter celleoverføring. Merk at en positiv sammenheng mellom CXCR4-uttrykket og donorcelle lokalisering til benmargen, men ikke milten, er bestemt.Med en positiv sammenheng observert mellom donorcelletall i benmargen og plasmamengden av anti-MDA-lav tetthet lipoprotein IgM. Mange ekstra teknikker kan benyttes til å svare på spørsmål som, hva er virkningen av målrettet genlevering på sykdomsutvikling eller hvilken donor som utleder utskilles faktorer påvirker vertfysiologi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Isolering, rensing og merking av benmarg fra mus Nøytrofiler for funksjonelle studier og adoptivforeldre Transfer Eksperimenter

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Bone Marrow-avledet Macrophage Produksjon

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Vurdere utvikling av Murint Plasmacytoid dendrittiske celler i Peyer sin Patches Bruke Adoptive Overføring av Hematopoietic stamfedre

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolasjon og intravenøs injeksjon av murine Bone Marrow Avledet Monocytter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induksjon av murine tarmbetennelse etter adoptiv overføring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høy</sup&gt; T-celler i immundefekte mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Murine Hind Limb Long Bone Dissection og benmarg Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral Transduksjon av stamceller i benmarg for å generere T-celle reseptor Retrogenic Mus

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Femur Vindu Chamber modell for<em&gt; I Vivo</em&gt; Cell sporing i Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...