Name: characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging
Uploaded: 2020-03-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging at JoVE.com

سلالة العضلات Q40-mRFP التي تقدمها CGC، والتي يتم تمويلها من قبل مكتب المعاهد القومية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). الخلايا العصبية-Q40-CFP كان هدية لطيفة من مختبر موريموتو. نحن نعترف DFG (KI-1988/5-1 إلى JK، زمالة دكتوراه NeuroCure من قبل مجموعة NeuroCure للتميز إلى MLP)، EMBO (زمالة قصيرة الأجل إلى MLP) وشركة علماء الأحياء (منح السفر إلى CG و MLP) للتمويل. كما نعترف بمرفق التصوير المجهري الخفيف المتقدم في مركز ماكس ديلبروك للطب الجزيئي، برلين، لتوفير الإعداد لتصوير بنيات YFP.

1. تزامن C. elegans
<ol><li>مزامنة C. elegans إما عن طريق معالجة محلول هيبوكلوريت القلوية أو عن طريق وضع البيض بسيطة لمدة 4 ساعة في 20 درجة مئوية8.</li>
	<li>تنمو والحفاظ على الديدان الخيطية في 20 درجة مئوية على المتوسطة نمو النيماتودا (NGM) لوحات المصنفة مع OP50 E. القولونية وفقا للإجرا?...

<ol>
	<li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease.">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li><li>Kikis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+struggle+by+Caenorhabditis+elegans+to+maintain+proteostasis+during+aging+and+disease.">The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease.</a> Biology Direct. 11, 58 (2016).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+-+techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).</li><li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+measurements+and+biological+imaging.">Fluorescence lifetime measurements and biological imaging.</a> Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li><li>Kaminski Schierle, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET+sensor+for+non-invasive+imaging+of+amyloid+formation+in+vivo.">A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo.</a> ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).</li><li>Sandhof, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+INS-IGF1+signaling+protects+against+non-cell+autonomous+vesicle+rupture+caused+by+SNCA+spreading.">Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading.</a> Autophagy. , 1-22 (2019).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).</li><li>Becker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Lifetime+Imaging+by+Time-Correlated+Single-Photon+Counting.">Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting.</a> Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).</li><li>Warren, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+global+fitting+of+large+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+datasets.">Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets.</a> PloS one. 8 (8), e70687 (2013).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+of+proteostasis+represents+an+early+molecular+event+in+Caenorhabditis+elegans+aging.">Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Specific+Intrinsic+Fluorescence+of+Protein+Amyloids+Used+to+Study+their+Kinetics+of+Aggregation.">Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation.</a> Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).</li><li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Reveals+the+Aggregation+Processes+of+&#945;-Synuclein+and+Polyglutamine+in+Aging+Caenorhabditis+elegans.">Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of &#945;-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).</li><li>Kelbauskas, L., Dietel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Aggregated+Photosensitizers+by+Tumor+Cells:+Subcellular+Time-resolved+Fluorescence+Spectroscopy+on+Derivatives+of+Pyropheophorbide-a+Ethers+and+Chlorin+e6+under+Femtosecond+One-+and+Two-photon+Excitation.">Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).</li><li>Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+and+FCS+detection+in+laser-scanning+microscopes:+Increased+efficiency+by+GaAsP+hybrid+detectors.">FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors.</a> Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).</li><li>Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+fluorescence+microscopy.">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).</li></ol>

ويصف البروتوكول المعروض هنا تقنية تعتمد على المجهر لتحديد الأنواع المجمعة في نظام نموذج C. elegans. FLIM يمكن أن تميز بدقة وجود كل من الأنواع المجمعة والقابلة للذوبان تنصهر على الفلوروفور عن طريق قياس تسوس العمر الفلوري. عندما يبدأ بروتين الانصهار لتجميع متوسط العمر المسجل سوف يتحول من أعل...

يحدث تجميع البروتين في كل من الشيخوخة والمرض. من الصعب اتباع المسارات التي تؤدي إلى تكوين وترسب الأميلويدات الكبيرة أو التضمينات غير المتبلور وحركية لها هي بالمثل صعبة للكشف. البروتينات يمكن أن تسيء بسبب الطفرات الجوهرية داخل تسلسل الترميز الخاصة بهم، كما هو الحال في الأمراض الوراثية. البروتينات أيضا يخطئ لأن شبكة البروتوستاس (PN) التي تبقيها قابلة للذوبان ومطوية بشكل صحيح هو ضعف، كما يحدث أثناء الشيخوخة. تتضمن PN المرافقالجزيئية وآلات التحلل وهي مسؤولة عن النشأة الحيوية وللطي والاتجار وتدهور البروتينات1.
C. ظهرت elegans كنموذج لدراسة الشيخوخة والمرض بسبب عمرها القصير، والطبيعة التسببية، وسهولة التلاعب الجيني. وقد تم إنشاء العديد من سلالات C. elegans المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات المسببة للأمراض البشرية في الأنسجة الضعيفة. الأهم من ذلك، العديد من السلالات التي تحتوي على البروتينات المعرضة للتجميع تلخيص السمة المميزة للاضطرابات اميلويد، وتشكيل إدراجات كبيرة. بفضل الجسم C. elegans 'شفافة، يمكن تصور هذه المجاميع في الجسم2الحي، غير الغازية وغير هدام2 . توليد أي بروتين من الفائدة (POI) في الانصهار مع الفلوروفور يسمح للتحقيق في مواقعها، والاتجار، وشبكة التفاعل، ومصير عام.
نحن نقدم بروتوكولا لرصد تجميع البروتينات المسببة للأمراض في المعيشة والشيخوخة C. elegans عن طريق الفلورسينس التصوير مدى الحياة المجهر (FLIM). FLIM هو تقنية قوية تقوم على عمر الفلوروفور ، بدلا من أطياف الانبعاثات. يتم تعريف العمر (تاو، و) على أنه متوسط الوقت المطلوب من قبل فوتون للاضمحلال من حالته اتحمس مرة أخرى إلى حالته الأرضية. يتم حساب عمر جزيء معين باستخدام تقنية المجال الزمني لعد الفوتون الواحد المرتبط بالوقت (TCSPC). في TCSPC-FLIM ، يتم الحصول على وظيفة تسوس الفلورسنت عن طريق إثارة الفلوروفور مع نبضات ليزر قصيرة عالية التردد وقياس أوقات وصول الفوتون المنبعثة إلى كاشف فيما يتعلق بالنبضات. عند مسح عينة، يتم إنشاء صفيف بيانات ثلاثي الأبعاد لكل بكسل: يتضمن الصفيف معلومات حول توزيع الفوتونات في إحداثياتها المكانية x y ومنحنى الاضمحلال الزمني. وبالتالي تصبح عينة معينة خريطة لأعمار الكشف عن المعلومات عن بنية البروتين، ملزمة، والبيئة3،4. كل بروتين الفلورسنت تمتلك حياة جوهرية ومحددة بدقة، وعادة من بضع نانو ثانية (ns)، تعتمد على خصائصه physiochemical. الأهم من ذلك ، فإن عمر الفلوروفور مستقل عن تركيزه ، وكثافة الفلورسنت ، ومنهجية التصوير. ومع ذلك ، داخل النظام البيولوجي ، يمكن أن تتأثر بالعوامل البيئية مثل درجة الحموضة ، ودرجة الحرارة ، وتركيزات الأيون ، وتشبع الأكسجين ، وشركاء التفاعل. العمر حساس أيضا ً للتغيرات الهيكلية الداخلية والتوجه. دمج الفلوروفور إلى POI يؤدي إلى تغيير في حياته وبالتالي معلومات عن سلوك البروتين المنصهر. عندما يتم إحاطة الفلوروفور أو تغليفها في بيئة مقيدة بإحكام ، مثل أوراق بيتا المضادة للمتوازية لبنية اميلويد ، فإنها تفقد الطاقة بشكل غير إشعاعي ، وهي عملية تعرف باسم إخماد5. يروي من الفلوروفور النتائج في تقصير حياتها واضحة. عندما تكون قابلة للذوبان، فإن عمر البروتين سيبقى أقرب إلى قيمته الأصلية الأعلى. في المقابل، عندما يبدأ البروتين في التجميع، فإن عمره سينتقل حتماإلى قيمة أقل6،7. لذلك ، يصبح من الممكن مراقبة الميل التجميعي لأي بروتين تشكيل اميلويد في أعمار مختلفة في C. elegansالحية.
هنا نصف بروتوكول لتحليل تجميع بروتين الانصهار تتألف من مختلف البوليغلوتامين (CAG، Q) تمتد (Q40، Q44، وQ85). نحن نوضح كيف يمكن تطبيق هذه التقنية بالتساوي على الفلورفور، مثل بروتين الفلورسنت السماوي (CFP)، والبروتين الفلوري الأصفر (YFP) وبروتين الفلورسنت الأحمر الأحادي (mRFP)؛ وفي جميع أنسجة C. elegans، بما في ذلك الخلايا العصبية والعضلات والأمعاء. وعلاوة على ذلك، في سياق البروتوستاس، FLIM هو أداة مفيدة جدا لمراقبة التغيرات عند استنفاد المرافقالجزيئية. هدم واحدة من المرافقالجزيئية الرئيسية، والبروتين صدمة الحرارة 1(hsp-1)،عن طريق تدخل الجيش الملكي النيبالي تنتج misfolding المبكر من البروتينات. ثم يتم قياس الزيادة في الحمل التجميعي نتيجة للشيخوخة أو المرض أو المرافقين الناقصين كانخفاض في عمر الفلورسينس.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ahringer Library hsp-1 siRNA</td>
			<td>Source BioScience UK Limited</td>
			<td>F26D10.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.3</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H DCS-120 SPC-150</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H SPC830-SPC Image</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ44-YFP</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OG412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ85-YFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans mQ40-RFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans nQ40-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>2316.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoQuant PicoHarp300</td>
			<td>PicoQuant GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K305.1</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Agarose</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510-Meta NLO</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging

ترتبط الفيبريات الأميلويد مع عدد من الأمراض العصبية مثل هنتنغتون, باركنسون, أو مرض الزهايمر. هذه الفيبريات اميلويد يمكن عزل البروتينات الذاتية ميتاستابل وكذلك مكونات شبكة البروتوستاس (PN) وبالتالي تفاقم البروتين misfolding في الخلية. هناك عدد محدود من الأدوات المتاحة لتقييم عملية تجميع البروتينات الأميلويد داخل الحيوان. نحن نقدم بروتوكولا للميكروسكوبية مدى الحياة الفلورية (FLIM) التي تسمح رصد وكذلك التحديد الكمي للفيبريلية اميلويد في خلايا محددة، مثل الخلايا العصبية، بطريقة غير الغازية ومع تطور الشيخوخة وعند اضطراب PN. FLIM مستقلة عن مستويات التعبير من الفلوروفور وتمكن من تحليل عملية التجميع دون أي مزيد من تلطيخ أو التبييض. يتم إخماد الفلورفور عندما تكون في محيط قريب من الهياكل الأميلويد، مما يؤدي إلى انخفاض عمر الفلورسينس. يرتبط الترويم بشكل مباشر بتجميع بروتين الأميلويد. FLIM هو تقنية متعددة الاستخدامات التي يمكن تطبيقها لمقارنة عملية الفيبريلة من البروتينات الأميلويد مختلفة، والمحفزات البيئية، أو الخلفيات الوراثية في الجسم الحي بطريقة غير الغازية.

يوضح البروتوكول كيفية مراقبة تكوين الأنواع المجمعة بدقة في C. elegansالحية ، سواء أثناء شيخوختها الطبيعية أو عند تعرضها للإجهاد. اخترنا أربع سلالات مختلفة من الديدان الخيطية المعدلة وراثيا التعبير عن بروتينات البولي غلوتامين إما 40Q، 44Q، أو يكرر 85Q. يتم تصنيع هذه البروتي?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging at JoVE.com

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

الفلورسينس مدى الحياة وشاشات التصوير، والقياس الكمي ويميز الميول التجميع من البروتينات في المعيشة، والشيخوخة، وشدد نماذج مرض C. elegans.

توصيف هياكل أميلويد في الشيخوخة C. Elegans باستخدام التصوير مدى الحياة فلورسينس

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

الطريقة تسمح لنا أن نميز بوضوح التكامل بنيات بروتين اميلويد من النظراء القابلة للذوبان والمتراكمة حتى. يتم تنفيذ هذه التقنية في الجسم الحي بطريقة غير باضعة مع القليل أو لا آثار جانبية سامة. كما أنه يعتمد على خصائص الفلورسنت من الفلوروفور نفسه، فهي قوية للغاية وقابلة للتكرار مع مرور الوقت.وقد استخدمت FLIM في مجال تشخيص السرطان. ومع ذلك، فإننا نستخدمها لدراسة الآليات الأساسية لتجميع البروتين والتي هي في الواقع ذات الصلة للأمراض العصبية. ويمكن استخدام المنهجية في مجال تجميع البروتينات.طالما يتم وضع علامة على البروتين المرتبط بالمرض بمسبار فلوري ، يمكن تتبعه ومراقبته بمرور الوقت. ويمكن دراسة المركبات والاستراتيجيات التي تعزز أو تمنع التجميع بنجاح. أي نظام بيولوجي يسمح بأن يكون مرئياً عن طريق المجهر الضوئي هو مناسب ل FLIM إما في الجسم الحي أو السابقين في الجسم الحي ، على سبيل المثال في زراعة الخلية ، في عينات مثبّتة أو مثبّتة وفي أي وسيلة ضرورية.تأكد من اختبار خصائص الفلوروفور المحدد داخل النياتودا قبل الحصول على بيانات تجريبية واختبار أن الإعداد يعمل بكامل طاقته قبل الحصول على القياسات. لبدء، وتنمو والحفاظ على الديدان الخيطية في 20 درجة مئوية على لوحات NGM. سن الديدان الخيطية حتى اليوم الرابع من الحياة كبالغين صغار واليوم الثامن من الحياة كبالغين كبار السن.في يوم التصوير، ابدأ بإعداد شرائح التصوير. مكان agarose ومزدوجة الماء المقطر بتركيز 3٪ الوزن من حيث الحجم. نقله إلى ميكروويف لتذوب ثم ندعه يبرد قليلا.قطع غيض من ماصة ملليلتر واحد واتخاذ ما يقرب من 200 ميكرولترات من agarose ذاب. الماصات agarose على شريحة زجاجية نظيفة ووضع على الفور ثانية واحدة على رأس تجنب تشكيل أي فقاعات. اترك الشرائح لتجف وأزل الشريحة الزجاجية العلوية برفق.والنتيجة هي شريحة زجاجية مع سطح agarose حتى حيث سيتم وضع الديدان الخيطية. مرة واحدة في إعداد التصوير جاهز للاستخدام، والعمل تحت مجهر ستيريو، ووضع قطرة 10 ميكرولتر من مجمع مخدر على وسادة agarose ونقل بلطف خمسة إلى 10 الديدان الخيطية في ذلك. استخدم طرف رمش لفصل الديدان الخيطية.الاحتفاظ بها قريبة من بعضها البعض ولكن لا تلمس للسماح لتسهيل توطين الديدان الخيطية أثناء الحصول على صورة. تراكب بعناية النيماتودا مع غطاء. في غضون ساعة واحدة بعد تركيب، واتخاذ القياسات.تأكد من أن الديدان الخيطية غير متحركة تماماً. افتح برنامج اقتناء FLIM. حدد موقع زر علامة التبويب واضغط على مخرجات تمكين.ضع الشريحة مع C.elegans المركبة على المسرح واستخدام عدسة تكبير 10X في وضع الإرسال ، قم بتعريب موضع النيماتودا على الشريحة. قم بإزالة الشريحة، والتبديل بين الهدف إلى عدسة تكبير 63X، وتطبيق وسيط الغمر المطلوب. ضع الشريحة على المسرح وتوطين الديدان الخيطية.ابدأ في مسح العينة. حدد منطقة ذات أهمية وركز على مستوى الإسقاط الأقصى. على واجهة برنامج FLIM، معاينة عدد الفوتونات التي تم الكشف عنها.يجب أن تكون قيمة ADC بين واحد مرات 10 إلى الرابع و واحد مرات 10 إلى الخامس. إذا لزم الأمر، قم بتحويل التركيز على مستوى مختلف أو زيادة قوة الليزر لجمع المزيد من الفوتونات. تأكد من تجنب تراكم الفوتون ولكن جمع كمية كافية من الفوتونات لخلق تناسب حياة جيدة والقياس.في شريط القوائم، حدد علامة التبويب لتعيين معلمات الامتلاك. حدد مزامنة المسح الضوئي في للسماح للكشف عن الفوتون واحد. تعيين الامتلاك إلى مقدار محدد من الوقت أو عدد ثابت من الفوتونات.اضغط على البدء في الحصول على. فتح البرنامج واستيراد ملفات البيانات FLIM عن طريق ملف، تحميل البيانات FLIM. تحميل جميع العينات من شرط واحد حتى لو تم الحصول عليها في جلسات مختلفة ومن تكرارات بيولوجية مختلفة.إذا لزم الأمر، مقطع إلى إشارة nematode لكثير من FLIM صورة عبر تجزئة، مدير التجزئة. اسحب أداة الاقتصاص حول المنطقة التي تهمك حتى يتم تمييزها. بعد الانتهاء، اضغط موافق. حدد منطقة صغيرة حيث تظهر الصورة المستندة إلى الكثافة لـ C.elegans.يظهر منحنى الاضمحلال في تلك المنطقة في نافذة الاضمحلال الكبيرة على الجانب الأيمن من الواجهة. لاستقراء العمر، في علامة التبويب البيانات، تعيين قيمة دنيا متكاملة عشوائية بين 40 إلى 300 لاستبعاد أي بكسل خافت جداً لإنتاج ملائمة جيدة. حدد الحد الأدنى للوقت و الحد الأقصى للوقت للحد من إشارة FLIM إلى هذه القيم.لا تقم بتغيير عدد الفوتونات المسبقة من واحد. إدخال معدل التكرار في ميغاهرتز من الليزر المستخدمة أثناء الاستحواذ. إدخال قيمة الحد الأقصى لبوابة لاستبعاد كافة وحدات البكسل المشبعة.في علامة التبويب العمر، حدد ملائمة عمومية ليتم استخدامها. لا تقم بتغيير أي معلمة أخرى باستثناء عدد التحديد الأسي إذا كان من المعروف أن اضمحلال الفلورسينسي المختار متعدد الأسية ويعرض أكثر من عمر واحد. قم بتحميل IRF عبر قائمة IRF.لتقدير التحول IRF، حدد IRF، تقدير التحول IRF. تظهر مجموعة من القيم تلقائياً في علامة التبويب IRF. بمجرد تأسيس هذا، لا تقم بتغيير أي معلمات أخرى من علامة التبويب هذه.بمجرد تعيين كافة المعلمات، اضغط على مجموعة بيانات ملائمة. يجب أن تتداخل الملاءمة الناتجة المميزة في خط أزرق مع كافة الأحداث. يتم الحصول على تناسب جيد عندما يتم محاذاة كافة الأحداث على طول تناسب.انقر فوق علامة التبويب المعلمات الموجودة في القوائم اليمنى العليا من واجهة البرنامج وحدد إحصائية، المتوسط المرجح، وتحقق من أن قيمة مربع تشي أقرب ما يمكن إلى واحد. وبالتالي فإن قيمة العمر للصورة المختارة يتم الكشف عنها باعتبارها تاو واحد. تصدير أي معلومات ذات أهمية من خلال ملف، وتصدير الصور كثافة، تناسب نتيجة الجدول، والصور، المدرجات.يتم عرض الخرائط التمثيلية لـ C.elegans التي تعبر عن Q40 المرابع العضلية في اليوم الرابع أو اليوم الثامن من الحياة هنا. كان امتداد Q أطول من IQ85 أكثر عرضة للتجميع وعرض تحول مدى الحياة fluorescence في الرسم البياني بالفعل في اليوم الرابع من الحياة. في الواقع، في اليوم الرابع، لوحظ تشكيل بؤر ل IQ85 بينما لا يزال غائبا في IQ44.عند الشيخوخة، ومع ذلك، IQ44 عرضت أيضا تشكيل بؤر وبالتالي عمر الفلورانس مخفض. وأخيراً، لم يتم الكشف عن تكوين البؤر ولم ينخفض عمر الفلورانس في سلالة NQ40CFP. لهذه السلالة، كانت هناك فقط تغييرات خفية غير هامة لمدى حياة الفلورانس المتوسط عند الشيخوخة.بمجرد تأسيس نموذج النيماتودا، فإن كمية الفوتون التي يتم جمعها هي الأهم للحصول على تناسب حياة جيدة. ويمكن أن يكون الأسلوب الملتصقة أكثر مع تقنيات مختلفة مثل فورستر الرنين نقل الطاقة، فريت، انتعاش الفلوريسين بعد photobleaching، FRAP، أو القياس. كل هذه التعديلات توفر معلومات إضافية عن خصائص الدراسات البروتينية وشكلها المجمع.وضمن مجال تجميع البروتينات وداء البروتين، سمحت هذه التقنية بالتحقيق في أي انزعاج مفروض على النظام، وتوزيع أنواع بروتينية مختلفة، والاتجار بها، وبشكل عام الاختلاف وأهمية كسور البروتين القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان داخل الكائن الحي. azide الصوديوم مخدر سامة وينبغي التعامل معها مع قفازات ونظارات واقية وتخفيفها تحت غطاء الدخان. ولأن هذه التقنية تعتمد على المجهر، فمن المهم اتباع جميع التحذيرات المتعلقة بالعمل باستخدام الليزر.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

تصوير الأنسجة اميلويد ملطخة بالانارة أوليجوثيوفينيس مترافق بالفائقة الطيفية [كنفوكل] مجهرية والأسفار تصوير مدى الحياة

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

توصيف الهيكلية من السكريات جدار الخلية المنان في النباتات باستخدام خطي

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

تنامي البلورات البروتينية مع أبعاد متميزة باستخدام الآلي تبلور مقرونا في الموقع الحيوي تشتت الضوء

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

استخدام الأبعاد شبه يشوه المنظفات [اغروس] هلام التفريد اثنين لتأكيد عدم تجانس حجم الألياف اميلويد أو اميلويد مثل

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

توصيف واحد حويصلات خارج الخلية في الدم البشري مع تحليل تتبع نانوحبيبات المستندة إلى الأسفار السريع

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

في فيفو الكالسيوم التصوير في c. الهيئة عضلات الجدار الجسم

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

كيانات السومو الملزمة (SUBEs) كاداات لإثراء وعزل وتحديد وتوصيف بروتين السومو في سرطان الكبد

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...