Name: characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging
Uploaded: 2020-03-27T15:00:00
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由国家卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助的CGC提供的肌肉-Q40-mRFP菌株。神经元Q40-CFP是森本实验室的一种礼物。我们承认DFG（KI-1988/5-1到JK，神经Cure博士奖学金由神经Cure卓越集群到MLP），EMBO（短期奖学金MLP）和生物学家公司（旅行赠款CG和MLP）为资助。我们还感谢柏林马克斯·德尔布吕克分子医学中心的高级光显微镜成像设施，该设施为图像 YFP 结构提供了设置。

1. C. 埃勒甘的同步
<ol><li>通过碱性次氯酸盐溶液处理或通过简单的卵子在20°C8下铺4小时，同步C.elegans。</li>
	<li>根据标准程序9，在用OP50大肠杆菌种子的线虫生长介质（NGM）板上生长并保持线虫在20°C。将线虫老化到所需的发育阶段或一天。 注意：在这个协议中，年轻人在第4天被成像，旧线虫在生命的第8天被成像。</li>
</ol><p class="jove_ti...

<ol>
	<li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease.">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li><li>Kikis, E. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Reveals+the+Aggregation+Processes+of+&#945;-Synuclein+and+Polyglutamine+in+Aging+Caenorhabditis+elegans.">Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of &#945;-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).</li><li>Kelbauskas, L., Dietel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Aggregated+Photosensitizers+by+Tumor+Cells:+Subcellular+Time-resolved+Fluorescence+Spectroscopy+on+Derivatives+of+Pyropheophorbide-a+Ethers+and+Chlorin+e6+under+Femtosecond+One-+and+Two-photon+Excitation.">Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).</li><li>Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+and+FCS+detection+in+laser-scanning+microscopes:+Increased+efficiency+by+GaAsP+hybrid+detectors.">FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors.</a> Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).</li><li>Suhling, K., French, M. 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此处介绍的协议描述了一种基于显微镜的技术，用于识别C. elegans模型系统中的聚合物种。FLIM可以通过测量荧光寿命衰变，准确描述融合到荧光磷的聚合和可溶性物种的存在。当融合蛋白开始聚合其记录的平均寿命将从更高值转移到较低的值16。然后，聚合的倾向可以通过寿命的下降来推断：寿命越低，系统中聚合蛋白物种的存在就越高。因此，有可能跟随PN的老化、疾病?...

蛋白质聚集发生在衰老和疾病。导致大型淀粉样蛋白或非晶体内含物形成和沉积的路径难以遵循，它们的动力学同样难以解开。蛋白质可能由于编码序列中的内在突变而错折叠，如遗传疾病。蛋白质也折叠不当，因为保持蛋白质解病网络（PN）保持其可溶性和正确折叠是受损的，就像老化期间一样。PN包括分子护护和降解机，负责蛋白质的生物成因、折叠、贩运和降解1。
由于寿命短、等源性以及易于遗传操作，Elegans已成为研究衰老和疾病的模型。几种在脆弱组织中表达人类致病蛋白质的C.elegans转基因菌株已经产生。重要的是，许多含有容易聚集的蛋白质的菌株重述淀粉样蛋白紊乱的特征，即大内含物的形成。多亏了C.elegans的透明身体，这些骨料可以在体内、非侵入性和非破坏性2中可视化。与氟磷融合产生任何感兴趣的蛋白质 （POI） 可以调查其位置、贩运、交互网络和一般命运。
我们通过荧光寿命成像显微镜（FLIM）来监测生命和衰老C.elegans中致病蛋白的聚集情况。FLIM 是一种基于荧光素寿命的强大技术，而不是其发射光谱。生存期（tau，*）定义为光子从兴奋状态衰减到其接地状态所需的平均时间。给定分子的寿命使用时间相关单光子计数 （TCSPC） 的时域技术计算。在TCSPC-FLIM中，荧光衰减功能是通过用短、高频激光脉冲刺激荧光光，并测量发射的光子到达时间到探测器的脉冲。扫描样本时，会为每个像素创建一个三维数据数组：数组包括有关光子在其x、y空间坐标及其时间衰减曲线中的分布的信息。因此，给定的样本成为揭示蛋白质结构、结合和环境信息,的终身图。每个荧光蛋白都有内在和精确定义的寿命，通常只有几纳秒（ns），取决于其物理化学性质。重要的是，荧光磷的寿命与其浓度、荧光强度和成像方法无关。然而，在生物系统中，它受到环境因素的影响，如pH、温度、电子浓度、氧饱和度及其相互作用伙伴。使用寿命对内部结构变化和方向也十分敏感。将荧光磷与POI融合会导致其寿命发生变化，从而提供有关融合蛋白行为的信息。当荧光波被包围或封装在紧密结合的环境中，如淀粉样蛋白结构的反平行β片时，它非辐射性地失去能量，这个过程称为淬火5。荧光道的淬火导致其明显寿命缩短。当可溶性时，蛋白质的寿命将更接近其原始、更高的价值。相反，当蛋白质开始聚集时，其寿命将不可避免地转移到较低的值66，7。7因此，在活的C.elegans的不同年龄监测任何淀粉样蛋白的聚集倾向成为可能。
在这里，我们描述了一种协议，用于分析融合蛋白的聚合，该蛋白包含不同的多谷氨酰胺（CAG，Q）拉伸（Q40、Q44和Q85）。我们说明了该技术如何同样应用于不同的荧光蛋白，如青色荧光蛋白（CFP）、黄色荧光蛋白（YFP）和单体红荧光蛋白（mRFP）;和在C.elegans的所有组织中，包括神经元、肌肉和肠道。此外，在蛋白酶的上下文中，FLIM是观察分子护工消耗时变化的非常有用的工具。通过RNA干扰击倒关键分子伴之一，热休克蛋白1（hsp-1）会产生蛋白质过早的误折叠。由于老化、疾病或陪护器不足而增加的聚合载荷，然后作为荧光寿命的缩短来衡量。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ahringer Library hsp-1 siRNA</td>
			<td>Source BioScience UK Limited</td>
			<td>F26D10.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.3</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H DCS-120 SPC-150</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H SPC830-SPC Image</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ44-YFP</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OG412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ85-YFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans mQ40-RFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans nQ40-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>2316.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoQuant PicoHarp300</td>
			<td>PicoQuant GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K305.1</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Agarose</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510-Meta NLO</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging

淀粉样纤维与一些神经退行性疾病有关，如亨廷顿舞蹈症、帕金森氏症或阿尔茨海默氏症。这些淀粉样蛋白纤维能隔离内源性转移稳定蛋白以及蛋白酶网络（PN）的成分，从而加剧细胞中的蛋白质错折叠。可用于评估动物体内淀粉样蛋白聚集过程的工具数量有限。我们提出了荧光寿命显微镜（FLIM）的协议，允许监测和定量特定细胞（如神经元）中的淀粉样蛋白纤维化，以非侵入性的方式，随着老化的进展和扰动PN。FLIM 独立于荧光道的表达水平，能够分析聚合过程，而无需任何进一步的染色或漂白。当荧光波在淀粉样结构附近时，荧光波会发出淬火，从而导致荧光寿命的缩短。淬火与淀粉样蛋白的聚合直接相关。FLIM 是一种多功能技术，可应用于以非侵入性方式比较不同淀粉样蛋白、环境刺激或体内遗传背景的纤维化过程。

该协议展示了如何准确监测在生物的C.elegan人中聚合物种的形成，无论是在自然老化期间还是在承受压力时。我们选择了四种不同的转基因线虫菌株，用于表达40Q、44Q或85Q重复的多谷氨酰胺蛋白。这些蛋白质在不同的组织中合成，并融合到不同的荧光波中。C. elegans菌株要么在体壁肌肉 （mQ40-RFP） 中表示 Q40-mRFP，在神经系统（nQ40-CFP）中表达 Q40-CFP，要么在肠?...

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Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

荧光寿命成像监测器，定量和区分蛋白质在生活、衰老和压力的C.elegans疾病模型中的聚集趋势。

使用荧光寿命成像在老化C.Elegans中淀粉样蛋白结构的表征

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

该方法使我们能够清楚地区分集成淀粉样蛋白结构与可溶性甚至累积的对应物。该技术以非侵入性的方式在体内进行，几乎没有毒性副作用。因为它取决于荧光素本身的荧光特性，因此随着时间的推移，它是高度健壮和可重复的。FLIM已用于癌症诊断领域。然而，我们利用它来研究蛋白质聚集的基本机制，这些机制确实与神经退行性疾病有关。该方法可用于蛋白质聚集领域。只要与疾病相关的蛋白质被标记在荧光探针上，就可以跟踪和监测它。可以成功研究促进或防止聚合的化合物和策略。任何允许通过光显微镜可视化的生物系统都适合在体内或外体内进行 FLIM，例如在细胞培养、固定或渗透样品以及任何必要的介质中。在获取实验数据之前，请确保在线虫中测试所选荧光团的特性，并在获取测量结果之前测试该设置是否完全正常运行。首先，在NGM板块上生长并保持20摄氏度的线虫。将线虫年龄但直到第四天，作为年轻人，将第八天作为老年人。在成像当天，从准备成像幻灯片开始。将加糖和双蒸馏水按体积的浓度为3%的重量放置。将其转移到微波炉中融化，然后稍微冷却。切开一毫升移液器尖端，并服用大约200微升融化的阿加罗斯。将气糖放在干净的玻璃滑梯上，并立即将第二个放在顶部，避免形成任何气泡。让滑梯保持干燥，轻轻取下顶部玻璃滑梯。其结果是一个玻璃幻灯片与均匀的红玫瑰表面，线虫将放置。一旦成像设置准备就绪，在立体显微镜下工作，将10微升的麻醉化合物滴到阿加罗斯垫上，轻轻将5至10个线虫转移到其中。使用睫毛尖端分离线虫。将它们靠近，但不得接触，以便于在图像采集过程中更容易定位线虫。小心地用盖玻片覆盖线虫。安装后一小时内，进行测量。确保线虫完全不动。打开 FLIM 采集软件。找到卡舌按钮，然后按启用输出。将幻灯片与安装的 C.elegans 放在舞台上，并在传输模式下使用 10 倍放大镜，定位幻灯片上线虫的位置。取下幻灯片，将目标切换到 63 倍放大镜头，然后应用所需的浸入介质。将幻灯片放在舞台上并本地化线虫。开始扫描样品。选择感兴趣的区域并专注于其最大投影平面。在 FLIM 软件的界面上，预览检测到的光子数量。ADC 值应介于 1 倍 10 到 4 之间，1 倍 10 到 5 之间。如有必要，将焦点转移到不同的平面上或增加激光功率以收集更多的光子。确保避免光子堆积，但收集足够数量的光子，以创造良好的寿命拟合和测量。在菜单栏中，选择选项卡以设置采集参数。选择扫描同步以允许单光子检测。将采集设置为固定时间量或固定数量的光子。按开始开始采集。打开软件，通过文件导入FLIM数据文件，加载FLIM数据。加载所有样品从一个条件，即使在不同的会话和不同的生物重复获得。如有必要，通过分段、分段管理器对许多 FLIM 图片进行分段信号线虫。将裁剪工具拖动到感兴趣区域周围，直到突出显示。完成后，按"确定"。选择显示 C.elegans 强度的图像的小区域。该区域衰减曲线出现在界面右侧的大衰减窗口中。要推断生存期，在数据选项卡上设置 40 到 300 之间的任意集成最小值，以排除任何太暗的像素，无法产生良好的拟合。选择最短时间和最大时间数，以将 FLIM 信号限制为这些值。不要更改一个的预设计数光子。输入采集过程中用的激光的兆赫的重复率。输入栅极最大值以排除所有饱和像素。在生存期选项卡上，选择要使用的全局拟合。如果已知所选荧光衰减是多指数且显示超过单个生存期，则除指数选择数外，不要更改任何其他参数。通过 IRF 菜单上传 IRF。要估计 IRF 移位，请选择 IRF，估计 IRF 移位。一组值会自动显示在 IRF 选项卡上。建立此选项后，不要更改此选项卡的任何其他参数。设置所有参数后，按拟合数据集。在蓝线中突出显示的结果拟合应与所有事件重叠。当所有事件都沿拟合对齐时，将获得良好的拟合。单击软件界面右上菜单中的参数选项卡，选择统计、加权均值，并检查 chi 平方值是否尽可能接近一个。因此，所选图像的生命周期值将揭示为 tau 一。通过文件、导出强度图像、拟合结果表、图像、直方图导出任何感兴趣的信息。在生命的第四天或第八天，C.elegans 表示肌肉 Q40 RFP 的代表地图显示在这里。IQ85 的较长 Q 延伸更易聚合，并且在直方图中表现出荧光寿命变化，这已经在生命的第 4 天。事实上，在第四天，在IQ44中观察到IQ85的后分形成。然而，在老化时，IQ44也表现出烟叶形成，从而缩短了荧光寿命。最后，在NQ40CFP菌株中，未检测到烟叶形成，荧光寿命也降低。对于这种菌株，衰老时平均荧光寿命只有细微的非显著变化。一旦建立了线虫模型，收集的光子数量对于获得良好的寿命拟合至关重要。该方法可进一步与不同的技术相结合，如福斯特共振能量转移、FRET、光漂白后荧光恢复、FRAP 或测量。所有这些适应提供了有关蛋白质研究及其聚合形式特性的额外信息。在蛋白质聚集和蛋白质平衡领域，该技术允许调查对系统施加的任何扰动、不同蛋白质物种的分布以及贩运，以及一般来说，生物体内可溶性蛋白和不溶性蛋白质分数的差异和意义。麻醉钠酸中毒，应用手套和护目镜处理，并在烟罩下稀释。由于该技术是基于显微镜的，因此遵循与激光工作相关的所有警告非常重要。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

用高光谱共聚焦显微镜和荧光寿命成像对发光共轭吩染色的淀粉样组织的成像

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

科研

生物化学

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

植物甘露聚糖细胞壁多糖的结构表征

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

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一种简单的高通量化学筛选方法在秀丽线虫中的应用

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

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采用自动结晶耦合原位动态光散射的不同尺寸生长蛋白晶体

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

二维半变性洗涤剂琼脂糖凝胶电泳法确定淀粉样或淀粉样纤维的粒度异质性

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

利用商用仪器和自由开源亮度分析软件对蛋白质的聚齐聚进行无标定的体外定量化

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

基于荧光的人体血液单细胞外囊快速表征

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

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在 Vivo 钙成像中，在 C. elegans身体壁肌肉

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

淀粉样蛋白纤维蛋白的相互作用和脑线粒体的膜渗透

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO 结合实体 （SUBEs） 作为肝癌中 SUMO 蛋白酶的浓缩、分离、识别和表征的工具

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...