Name: characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging
Uploaded: 2020-03-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging at JoVE.com

Den muskel-Q40-mRFP stamme fra CGC, som er finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programmer (P40 OD010440). Den neuronal-Q40-CFP var en slags gave af Morimoto Lab. Vi anerkender DFG (KI-1988/5-1 til JK, NeuroCure PhD stipendium af NeuroCure Cluster of Excellence til MLP), EMBO (Kortsigtet stipendium til MLP) og Company of Biologs (rejse tilskud til CG og MLP) for finansiering. Vi anerkender også Advanced Light Microscopy imaging facilitet på Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin, for at give opsætningen til billedet YFP konstruktioner.

1. Synkronisering af C. elegans
<ol><li>Synkroniser C. elegans enten via behandling af alkalisk hypochloritopløsning eller via simpel æglægning i 4 timer ved 20 °C8.</li>
	<li>Vokse og vedligeholde nematoder ved 20 °C på nematode vækstmedium (NGM) plader seedet med OP50 E. coli i henhold til standardprocedurer9. Æld sletterne indtil det ønskede udviklingsstadie eller den ønskede dag. BEMÆRK: I denne protokol, unge voksne er afbilde...

<ol>
	<li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease.">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li><li>Kikis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+struggle+by+Caenorhabditis+elegans+to+maintain+proteostasis+during+aging+and+disease.">The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease.</a> Biology Direct. 11, 58 (2016).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+-+techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).</li><li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+measurements+and+biological+imaging.">Fluorescence lifetime measurements and biological imaging.</a> Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li><li>Kaminski Schierle, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET+sensor+for+non-invasive+imaging+of+amyloid+formation+in+vivo.">A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo.</a> ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).</li><li>Sandhof, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+INS-IGF1+signaling+protects+against+non-cell+autonomous+vesicle+rupture+caused+by+SNCA+spreading.">Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading.</a> Autophagy. , 1-22 (2019).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).</li><li>Becker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Lifetime+Imaging+by+Time-Correlated+Single-Photon+Counting.">Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting.</a> Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).</li><li>Warren, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+global+fitting+of+large+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+datasets.">Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets.</a> PloS one. 8 (8), e70687 (2013).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+of+proteostasis+represents+an+early+molecular+event+in+Caenorhabditis+elegans+aging.">Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Specific+Intrinsic+Fluorescence+of+Protein+Amyloids+Used+to+Study+their+Kinetics+of+Aggregation.">Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation.</a> Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).</li><li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Reveals+the+Aggregation+Processes+of+&#945;-Synuclein+and+Polyglutamine+in+Aging+Caenorhabditis+elegans.">Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of &#945;-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).</li><li>Kelbauskas, L., Dietel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Aggregated+Photosensitizers+by+Tumor+Cells:+Subcellular+Time-resolved+Fluorescence+Spectroscopy+on+Derivatives+of+Pyropheophorbide-a+Ethers+and+Chlorin+e6+under+Femtosecond+One-+and+Two-photon+Excitation.">Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).</li><li>Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+and+FCS+detection+in+laser-scanning+microscopes:+Increased+efficiency+by+GaAsP+hybrid+detectors.">FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors.</a> Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).</li><li>Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+fluorescence+microscopy.">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).</li></ol>

Den protokol, der præsenteres her, beskriver en mikroskopibaseret teknik til at identificere aggregerede arter i C. elegans modelsystem. FLIM kan præcist karakterisere tilstedeværelsen af både aggregerede og opløselige arter smeltet til en fluorophore via måling af deres fluorescens levetid henfald. Når et fusionsprotein begynder at samle sin registrerede gennemsnitlige levetid, vil det gå fra en højere til en lavere værdi16. Tilbøjeligheden til aggregering kan derefter udledes...

Protein aggregering forekommer både i aldring og sygdom. De veje, der fører til dannelse og aflejring af store amyloider eller amorfe indeslutninger er vanskelige at følge, og deres kinetik er ligeledes udfordrende at optrævle. Proteiner kan foldes forkert på grund af iboende mutationer inden for deres kodningsekvenser, som det er tilfældet med genetiske sygdomme. Proteiner også misfold fordi proteostasis netværk (PN), der holder dem opløselige og korrekt foldet er svækket, som det sker under aldring. PN omfatter molekylære chaperoner og nedbrydningsmaskiner og er ansvarlig for biogenese, foldning, handel og nedbrydning af proteiner1.
C. elegans har vist sig som en model til at studere aldring og sygdom på grund af sin korte levetid, isogene karakter, og nem genetisk manipulation. Flere C. elegans transgene stammer, der udtrykker humane sygdomsfremkaldende proteiner i sårbare væv er blevet skabt. Vigtigere er det, mange af de stammer, der indeholder aggregering-tilbøjelige proteiner opsummere kendetegnende for amyloid lidelser, dannelsen af store indeslutninger. Takket være C. elegans 'gennemsigtige krop, kan disse aggregater visualiseres in vivo, noninvasively og nondestructively2. Generering af protein af interesse (POI) i fusion med en fluorophore gør det muligt at undersøge dens placeringer, menneskehandel, interaktion netværk, og generelle skæbne.
Vi præsenterer en protokol til at overvåge aggregering af sygdomsfremkaldende proteiner i levende og aldrende C. elegans via fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM). FLIM er en kraftfuld teknik baseret på levetiden for en fluorophore, snarere end dens emissionsspektre. Levetiden (tau, τ) er defineret som den gennemsnitlige tid, der kræves af en foton til henfald fra sin ophidset tilstand tilbage til sin jorden tilstand. Et givet molekyles levetid beregnes med tidsdomæneteknikken for tidskorreleret enkelt fotontælling (TCSPC). I TCSPC-FLIM opnås fluorescerende henfaldsfunktion ved at spændende fluorophore med korte, højfrekvente laserimpulser og måle den udsendte fotons ankomsttider til en detektor med hensyn til impulserne. Når du scanner et eksempel, oprettes der en tredimensionel datamatrix for hver pixel: Arrayet indeholder oplysninger om fotonernes fordeling i deres x,y rumlige koordinater og deres tidsmæssige henfaldskurve. En given prøve bliver derfor et kort over levetider, der afslører oplysninger om proteinets struktur, binding og miljø3,4. Hvert fluorescerende protein har en iboende og præcist defineret levetid, normalt af et par nanosekunder (ns), afhængig af dens fysiokemiske egenskaber. Det er vigtigt, at en fluorophores levetid er uafhængig af dens koncentration, fluorescerende intensitet og billedbehandlingsmetoden. Men inden for et biologisk system, det kan påvirkes af miljømæssige faktorer såsom pH, temperatur, ion koncentrationer, iltmætning, og dens interaktion partnere. Levetider er også følsomme over for interne strukturelle ændringer og orientering. Sammensmeltning af en fluorophore til et POI resulterer i en ændring i dens levetid og dermed oplysninger om opførsel af det smeltede protein. Når en fluorophore er omgivet eller indkapslet i et tæt bundet miljø, såsom antiparallel beta ark af en amyloid struktur, det mister energi ikke-radiativt, en proces kendt som dæmpning5. Dæmpning af fluorophore resulterer i en forkortelse af dens tilsyneladende levetid. Når opløselige, et protein levetid vil forblive tættere på sin oprindelige, højere værdi. I modsætning hertil, når et protein begynder at samle, vil dets levetid uundgåeligt skifte til en lavere værdi6,7. Derfor bliver det muligt at overvåge sammenlægningtilbøjeligheden af amyloiddannende protein i forskellige aldre i levende C. elegans.
Her beskriver vi en protokol til analyse af sammenlægningen af et fusionsprotein bestående af forskellige polyglutaminstrækninger (CAG, Q) (Q40, Q44 og Q85). Vi illustrerer, hvordan teknikken kan anvendes på samme måde på forskellige fluorophorer, såsom cyanfluorescerende protein (CFP), gult fluorescerende protein (YFP) og monomerisk rødt fluorescerende protein (mRFP); og i alle væv af C. elegans, herunder neuroner, muskler, og tarmen. Desuden, i forbindelse med proteostase, FLIM er et meget nyttigt redskab til at observere ændringer ved udtømning af molekylære chaperoner. At vælte en af de vigtigste molekylære chaperoner, varmechokprotein 1 (hsp-1) via RNA-interferens producerer for tidlig misfoldning af proteiner. Stigningen i aggregering belastning som følge af aldring, sygdom, eller mangelfuld chaperones, måles derefter som et fald i fluorescens levetid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ahringer Library hsp-1 siRNA</td>
			<td>Source BioScience UK Limited</td>
			<td>F26D10.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.3</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H DCS-120 SPC-150</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H SPC830-SPC Image</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ44-YFP</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OG412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ85-YFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans mQ40-RFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans nQ40-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>2316.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoQuant PicoHarp300</td>
			<td>PicoQuant GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K305.1</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Agarose</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510-Meta NLO</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging

Amyloid fibriller er forbundet med en række neurodegenerative sygdomme som Huntingtons, Parkinsons eller Alzheimers sygdom. Disse amyloid fibriller kan sequester endogene metastabile proteiner samt komponenter i proteostasis netværk (PN) og dermed forværre protein misfolding i cellen. Der er et begrænset antal værktøjer til rådighed til at vurdere aggregering af amyloid proteiner i et dyr. Vi præsenterer en protokol for fluorescens levetid mikroskopi (FLIM), der tillader overvågning samt kvantificering af amyloid fibrilization i specifikke celler, såsom neuroner, i en noninvasive måde og med progression af aldring og ved forstyrrelser af pn'en. FLIM er uafhængig af fluorophores udtryksniveauer og muliggør en analyse af aggregeringsprocessen uden yderligere farvning eller blegning. Fluorophorer slukkes, når de er i nærheden af amyloid strukturer, hvilket resulterer i et fald i fluorescens levetid. Dæmpningen korrelerer direkte med sammenlægningen af amyloidproteinet. FLIM er en alsidig teknik, der kan anvendes til at sammenligne fibrilization processen med forskellige amyloid proteiner, miljømæssige stimuli, eller genetiske baggrunde in vivo i en ikke-invasiv måde.

Protokollen viser, hvordan man præcist overvåge dannelsen af aggregerede arter i levende C. elegans, både i løbet af sin naturlige aldring, og når de udsættes for stress. Vi udvalgte fire forskellige stammer af transgene nematoder, der udtrykker polyglutaminproteiner af enten 40Q, 44Q eller 85Q-gentagelser. Disse proteiner er syntetiseret i forskellige væv og blev smeltet til forskellige fluorophorer. C. elegans stammer enten udtrykt Q40-mRFP i kroppen væg muskle...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging at JoVE.com

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Fluorescens levetid imaging overvåger, kvantificerer og skelner aggregering tendenser af proteiner i levende, aldring, og understregede C. elegans sygdom modeller.

Karakterisering af Amyloid strukturer i Aging C. Elegans Brug Fluorescens Lifetime Imaging

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Metoden giver os mulighed for klart at skelne integrerede amyloid proteinstrukturer fra de opløselige og endda akkumulerede modstykker. Teknikken udføres in vivo på en noninvasive måde med ringe eller ingen toksiske bivirkninger. Da det afhænger af fluorescerende egenskaber af fluorophore selv, det er meget robust og reproducerbare over tid.FLIM er blevet udnyttet inden for kræftdiagnose. Men vi anvender det til at undersøge de grundlæggende mekanismer for proteinsammenlægning, som faktisk er relevante for neurodegenerative sygdomme. Metoden kan anvendes inden for proteinsammenlægning.Så længe sygdommen associeret protein er mærket med en fluorescerende sonde, det kan spores og overvåges over tid. Forbindelser og strategier, der enten fremmer eller forhindrer sammenlægning kan med succes undersøges. Ethvert biologisk system, der gør det muligt at visualiseres ved lysmikroskopi, er egnet til FLIM, enten in vivo eller ex vivo, for eksempel i cellekultur, i fikserede eller permeabiliserede prøver og i ethvert medium, der er nødvendigt.Sørg for at teste egenskaberne af din valgte fluorophore i nematoden, før du får eksperimentelle data, og for at teste, at opsætningen er fuldt funktionel, før du anskaffer målinger. Til at begynde, vokse og vedligeholde nematoder ved 20 grader Celsius på NGM plader. Alder nematoder indtil dag fire af livet som de unge voksne og dag otte af livet som de gamle voksne.På billeddagen skal du starte med at forberede billeddiasediasene. Agarose og dobbelt destilleret vand skal veje med en koncentration på 3 % volumen. Overfør det til en mikrobølgeovn til at smelte og lad det køle lidt.Skær spidsen af en milliliter pipette spids og tage omkring 200 mikroliter af den smeltede agarose. Pipette agarose på et rent glas dias og straks placere en anden på toppen undgå dannelsen af eventuelle bobler. Lad objektglassene tørre og forsigtigt fjerne den øverste glasrutsjebane.Resultatet er et glasskred med en jævn agaroseoverflade, hvor nematoderne placeres. Når billeddannelse setup er klar til brug, arbejder under et stereomikroskop, placere en 10 mikroliter dråbe bedøvelsesmiddel sammensatte på en agarose pad og forsigtigt overføre fem til 10 nematoder ind i det. Brug en øjenvippespids til at adskille nematoderne.Hold dem tæt sammen, men ikke rørende at give mulighed for lettere lokalisering af nematoder under billedet erhvervelse. Overlejr forsigtigt nematoderne med en dæksling. Inden for en time efter montering, tage målinger.Sørg for, at nematoderne er helt immobile. Åbn FLIM-anskaffelsessoftwaren. Find tabulatorknappen, og tryk på aktivér output.Placer diaset med de monterede C.elegans på scenen og ved hjælp af en 10X forstørrelse linse i transmissionstilstand, lokalisere placeringen af nematoder på diaset. Fjern diaset, skift målet til et 63X-forstørrelsesobjektiv, og anvend det nødvendige nedsænkningsmedie. Placer diaset på scenen og lokalisere nematoder.Begynd at scanne eksemplet. Vælg et område af interesse, og fokuser på dets maksimale projektionsplan. Få vist et eksempel på antallet af registrerede fotoner på FLIM-softwarens grænseflade.ADC-værdien skal være mellem en gange 10 til den fjerde og en gange 10 til den femte. Hvis det er nødvendigt, skal du flytte fokus på et andet plan eller øge lasereffekten for at indsamle flere fotoner. Sørg for, at du undgår photon pileup, men indsamle en tilstrækkelig mængde fotoner til at skabe en god levetid pasform og måling.Vælg fanen på menulinjen for at angive anskaffelsesparametrene. Vælg scanningssynkronisering for at tillade registrering af enkeltfoto. Indstil anskaffelsen til et bestemt tidsrum eller et fast antal fotoner.Tryk på start for at starte anskaffelsen. Åbn softwaren, og importer FLIM-datafiler via fil, indlæs FLIM-data. Alle prøverne indlæses fra én tilstand, selv om de er fremstillet i forskellige sessioner og fra forskellige biologiske gentagelser.Hvis det er nødvendigt, segment til at signalere nematode for mange FLIM billede via segmentering, segmentering manager. Træk beskæringsværktøjet rundt i det område, der er af interesse, indtil det er fremhævet. Tryk på OK, når den er fuldført. Vælg et lille område, hvor det intensitetsbaserede billede af en C.elegans vises.Henfaldskurven for denne region vises i det store henfaldsvindue i højre side af grænsefladen. Hvis du vil ekstrapolere levetiden, skal du under fanen data angive en vilkårlig integreret minimumværdi mellem 40 og 300 for at udelukke pixel, der er for nedtonede til at give en god pasform. Vælg et tidsnumen og et tidsnummer for at begrænse FLIM-signalet til disse værdier.Du må ikke ændre den forudindstillede optællingsfoto af en. Indtast gentagelse sats i megahertz af laseren udnyttes under erhvervelsen. Indtast en gate max værdi for at udelukke alle mættede pixel.Vælg en global tilpasning, der skal bruges, under fanen levetid. Du må ikke ændre andre parametre undtagen antallet af eksponentiel udvælgelse, hvis det vides, at det valgte fluorescenshenfald er multiekponentielt og udviser mere end en enkelt levetid. Overfør IRF via IRF-menuen.Hvis du vil estimere IRF-skiftet, skal du vælge IRF, estimat IRF shift. Der vises automatisk et sæt værdier under fanen IRF. Når dette er oprettet, skal du ikke ændre andre parametre for denne fane.Når alle parametre er indstillet, skal du trykke på tilpas datasæt. Den resulterende pasform, der er fremhævet i en blå linje, bør overlappe med alle hændelserne. En god pasform opnås, når alle hændelser er justeret langs pasformen.Klik på fanen parametre i øverste højre menuer i softwarens grænseflade og vælg statistik, vægtet middelværdi, og kontroller, at chi-kvadratværdien er så tæt som muligt på en. Levetidsværdien af det valgte billede afsløres således som tau one. Eksporter alle oplysninger af interesse gennem fil, eksport intensitet billeder, fit resultattabel, billeder, histogrammer.Repræsentative kort over C.elegans udtrykker muskuløs Q40 RFP på dag fire eller dag otte af livet er vist her. Den længere Q strækning af IQ85 var mere tilbøjelige til sammenlægning og udstillet en fluorescens levetid skift i histogram allerede på dag fire i livet. Faktisk, på dag fire, foci formation blev observeret for IQ85 mens stadig fraværende i IQ44.Ved aldring, dog IQ44 udstillet foci dannelse og dermed en reduceret fluorescens levetid. Endelig blev foci-formationen ikke påvist, og der var heller ikke nedsat fluorescenslevetid i NQ40CFP-stammen. For denne stamme, var der kun subtile ikke-væsentlige ændringer i den gennemsnitlige fluorescens levetid ved aldring.Når nematode modellen er etableret, mængden af foton indsamlet er altafgørende for at opnå en god levetid pasform. Metoden kan yderligere konjunktion med forskellige teknikker såsom Forster resonans energioverførsel, FRET, fluorescens opsving efter photobleaching, FRAP, eller måling. Alle disse tilpasninger giver ekstra oplysninger om proteinundersøgelsernes egenskaber og dens aggregerede form.Inden for proteinaggregering og proteinhomøostase har teknikken gjort det muligt at undersøge eventuelle udsving i systemet, fordelingen af forskellige proteinarter og handelen og generelt forskellen og betydningen af opløselige og uopløselige proteinfraktioner i den levende organisme. Bedøvelsesnatrium azide er giftigt og skal håndteres med handsker og beskyttelsesbriller og fortyndes under en røghætte. Da teknikken er mikroskopibaseret, er det vigtigt at følge alle advarsler i forbindelse med arbejde med lasere.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid væv farves med selvlysende konjugeret Oligothiophenes af Hyperspectral Konfokal mikroskopi og fluorescens levetid Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Strukturel karakterisering af Mannan cellevæg polysaccharider i anlaeg, der anvender PACE

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En simpel metode til High Throughput kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Voksende Protein krystaller med forskellige dimensioner ved hjælp af automatiseret krystallisering kombineret med In Situ dynamisk lysspredning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Brugen af to-dimensionelle semi-denaturering vaskemiddel Agarosen gelelektroforese at bekræfte størrelse heterogenitet af Amyloid eller Amyloid-lignende fibre

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantificering af Protein Homo-oligomerisering ved hjælp af kommercielle instrumentering og gratis, Open Source lysstyrke analyse Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Hurtig fluorescens-baserede karakterisering af enkelt ekstracellulære vesikler i humant blod med nanopartikler-tracking analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo calcium Imaging i C. elegans krop væg muskler

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med og membran Permeabilisering af hjernen mitochondrier af amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende enheder (SUBEs) som værktøjer til berigelse, isolation, identifikation og karakterisering af SUMO Proteome i leverkræft

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...