Name: characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging
Uploaded: 2020-03-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging at JoVE.com

De spier-Q40-mRFP stam die door de CGC, die wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Het neuronale Q40-GVB was een soort geschenk van het Morimoto Lab. Wij erkennen de DFG (KI-1988/5-1 aan JK, NeuroCure PhD fellowship door de NeuroCure Cluster of Excellence aan MLP), EMBO (Korte termijn fellowship to MLP) en het Bedrijf van Biologen (reissubsidies aan CG en MLP) voor financiering. We erkennen ook de Advanced Light Microscopy imaging faciliteit in het Max Delbrück Centre for Molecular Medicine, Berlijn, voor het verstrekken van de setup om de YFP constructies beeld.

1. Synchronisatie van C. elegans
<ol><li>Synchroniseer C. elegans via alkalische hypochlorietoplossingsbehandeling of via eenvoudige eieren die 4 uur bij 20 °C8 leggen.</li>
	<li>Groeien en onderhouden van aaltjes op nematoden groeimedium (NGM) platen die zijn ingezaaid met OP50 E. coli volgens standaardprocedures9. Verouder de nematoden tot de gewenste ontwikkelingsfase of dag. OPMERKING: In dit protocol worden jongvolwassenen afgebeeld op ...

<ol>
	<li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease.">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li><li>Kikis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+struggle+by+Caenorhabditis+elegans+to+maintain+proteostasis+during+aging+and+disease.">The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease.</a> Biology Direct. 11, 58 (2016).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+-+techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).</li><li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+measurements+and+biological+imaging.">Fluorescence lifetime measurements and biological imaging.</a> Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li><li>Kaminski Schierle, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET+sensor+for+non-invasive+imaging+of+amyloid+formation+in+vivo.">A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo.</a> ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).</li><li>Sandhof, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+INS-IGF1+signaling+protects+against+non-cell+autonomous+vesicle+rupture+caused+by+SNCA+spreading.">Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading.</a> Autophagy. , 1-22 (2019).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).</li><li>Becker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Lifetime+Imaging+by+Time-Correlated+Single-Photon+Counting.">Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting.</a> Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).</li><li>Warren, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+global+fitting+of+large+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+datasets.">Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets.</a> PloS one. 8 (8), e70687 (2013).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+of+proteostasis+represents+an+early+molecular+event+in+Caenorhabditis+elegans+aging.">Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Specific+Intrinsic+Fluorescence+of+Protein+Amyloids+Used+to+Study+their+Kinetics+of+Aggregation.">Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation.</a> Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).</li><li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Reveals+the+Aggregation+Processes+of+&#945;-Synuclein+and+Polyglutamine+in+Aging+Caenorhabditis+elegans.">Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of &#945;-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).</li><li>Kelbauskas, L., Dietel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Aggregated+Photosensitizers+by+Tumor+Cells:+Subcellular+Time-resolved+Fluorescence+Spectroscopy+on+Derivatives+of+Pyropheophorbide-a+Ethers+and+Chlorin+e6+under+Femtosecond+One-+and+Two-photon+Excitation.">Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).</li><li>Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+and+FCS+detection+in+laser-scanning+microscopes:+Increased+efficiency+by+GaAsP+hybrid+detectors.">FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors.</a> Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).</li><li>Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+fluorescence+microscopy.">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).</li></ol>

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een op microscopie gebaseerde techniek om geaggregeerde soorten in het C. elegans-modelsysteem te identificeren. FLIM kan de aanwezigheid van zowel geaggregeerde als oplosbare soorten die tot fluorophore zijn gefuseerd nauwkeurig karakteriseren door meting van hun fluorescentielevensduurverval. Wanneer een fusie-eiwit begint te aggregeren zal de geregistreerde gemiddelde levensduur verschuiven van een hogere naar een lagere waarde16. De neiging ...

Eiwitaggregatie komt zowel bij veroudering als bij ziekte voor. De paden die leiden tot de vorming en afzetting van grote amyloïden of amorfe insluitsels zijn moeilijk te volgen en hun kinetiek zijn eveneens uitdagend om te ontrafelen. Eiwitten kunnen verkeerd worden gevouwen als gevolg van intrinsieke mutaties binnen hun coderingssequenties, zoals in het geval van genetische ziekten. Eiwitten ook verkeerd vouwen omdat de proteostase netwerk (PN) dat houdt ze oplosbaar en goed gevouwen is aangetast, zoals gebeurt tijdens het ouder worden. De PN omvat moleculaire chaperonne en afbraakmachines en is verantwoordelijk voor de biogenese, vouwen, handel en afbraak van eiwitten1.
C. elegans is ontstaan als een model om veroudering en ziekte te bestuderen als gevolg van de korte levensduur, isogene aard, en het gemak van genetische manipulatie. Verschillende C. elegans transgene stammen die menselijke ziekte-veroorzakende eiwitten uitdrukken in kwetsbare weefsels zijn gemaakt. Belangrijk is dat veel van de stammen die aggregatiegevoelige eiwitten bevatten, het kenmerk van amyloïdeaandoeningen, de vorming van grote insluitsels, samenvatten. Dankzij het transparante lichaam van C. elegans kunnen deze aggregaten in vivo, niet-invasief en niet-destructief worden gevisualiseerd2. Het genereren van eiwit van belang (POI) in fusie met een fluorophore maakt het mogelijk om de locaties, mensenhandel, interactie netwerk, en het algemene lot te onderzoeken.
We presenteren een protocol om de aggregatie van ziekteveroorzakende eiwitten in levende en verouderende C. elegans via fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) te monitoren. FLIM is een krachtige techniek gebaseerd op de levensduur van een fluorophore, in plaats van de emissiespectra. De levensduur (tau, τ) wordt gedefinieerd als de gemiddelde tijd die een foton nodig heeft om te vergaan van zijn opgewonden toestand terug naar zijn grondstaat. De levensduur van een bepaald molecuul wordt berekend met de tijd-domein techniek van tijd-gecorreleerde enkele foton tellen (TCSPC). In TCSPC-FLIM wordt de fluorescerende vervalfunctie verkregen door de fluorophore op te winden met korte, hoogfrequente laserpulsen en de aankomsttijden van het uitgezonden foton te meten aan een detector met betrekking tot de pulsen. Bij het scannen van een voorbeeld wordt voor elke pixel een driedimensionale gegevensarray gemaakt: de array bevat informatie over de verdeling van de fotonen in hun x,y ruimtelijke coördinaten en hun temporele vervalcurve. Een bepaald monster wordt daarom een kaart van levens die informatie onthult over de structuur van het eiwit, binding en omgeving3,4. Elk fluorescerend eiwit heeft een intrinsieke en nauwkeurig gedefinieerde levensduur, meestal van een paar nanoseconden (ns), afhankelijk van de fysiochemische eigenschappen. Belangrijk is dat de levensduur van een fluorophore onafhankelijk is van zijn concentratie, fluorescerende intensiteit en van de beeldvormingsmethode. Binnen een biologisch systeem kan het echter worden beïnvloed door omgevingsfactoren zoals pH, temperatuur, ionenconcentraties, zuurstofverzadiging en zijn interactiepartners. Levens zijn ook gevoelig voor interne structurele veranderingen en oriëntatie. Het smelten van een fluorophore aan een POI resulteert in een verandering in zijn levensduur en dus informatie over het gedrag van het gesmolten eiwit. Wanneer een fluorophore is omgeven of ingekapseld in een strak gebonden omgeving, zoals de antiparallelle bètabladen van een amyloïde structuur, verliest het energie niet-radiatief, een proces dat bekend staat als het blussen5. Het blussen van de fluoropforen resulteert in een verkorting van de schijnbare levensduur. Wanneer oplosbaar, zal de levensduur van een eiwit dichter bij zijn oorspronkelijke, hogere waarde blijven. Wanneer een eiwit zich daarentegen begint op te saggregeren, zal de levensduur ervan onvermijdelijk verschuiven naar een lagere waarde6,7. Daarom wordt het mogelijk om de aggregatieneiging van amyloïde-vormende eiwitten op verschillende leeftijden in levende C. eleganste controleren.
Hier beschrijven we een protocol om de aggregatie te analyseren van een fusie-eiwit bestaande uit verschillende polyglutamine (CAG, Q) (Q40, Q44 en Q85). We illustreren hoe de techniek ook kan worden toegepast op verschillende fluorophoren, zoals cyaan fluorescerend eiwit (GVB), geel fluorescerend eiwit (YFP) en monomeric rood fluorescerend eiwit (mRFP); en in alle weefsels van C. elegans,met inbegrip van de neuronen, spieren, en de darm. Bovendien is FLIM in de context van proteostase een zeer nuttig instrument om veranderingen bij uitputting van moleculaire chaperononen waar te nemen. Het neerhalen van een van de belangrijkste moleculaire chaperononen, hitteshock eiwit 1 (hsp-1), via RNA interferentie produceert voortijdige misfolding van eiwitten. De toename van de aggregatiebelasting als gevolg van veroudering, ziekte of gebrekkige chaperonen, wordt vervolgens gemeten als een afname van de levensduur van de fluorescentie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ahringer Library hsp-1 siRNA</td>
			<td>Source BioScience UK Limited</td>
			<td>F26D10.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.3</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H DCS-120 SPC-150</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H SPC830-SPC Image</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ44-YFP</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OG412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ85-YFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans mQ40-RFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans nQ40-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>2316.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoQuant PicoHarp300</td>
			<td>PicoQuant GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K305.1</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Agarose</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510-Meta NLO</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging

Amyloïde fibrils worden geassocieerd met een aantal neurodegeneratieve ziekten zoals de ZvH, Parkinson of de ziekte van Alzheimer. Deze amyloïde fibrils kunnen endogene metastabiele eiwitten en componenten van het proteostasenetwerk (PN) afzonderen en daardoor eiwitmisvouwen in de cel verergeren. Er zijn een beperkt aantal instrumenten beschikbaar om het aggregatieproces van amyloïde eiwitten binnen een dier te beoordelen. We presenteren een protocol voor fluorescentie levensduur microscopie (FLIM) dat monitoring en kwantificering van de amyloïde fibrilisatie in specifieke cellen, zoals neuronen, op een niet-invasieve manier en met de progressie van veroudering en bij verstoring van de PN. FLIM is onafhankelijk van de expressieniveaus van de fluoropforen en maakt een analyse van het aggregatieproces mogelijk zonder verdere vlekken of bleken. Fluorophoren worden gedoofd wanneer ze zich in de nabijheid van amyloïde structuren bevinden, wat resulteert in een afname van de fluorescentielevensduur. Het blussen correleert direct met de aggregatie van het amyloïde eiwit. FLIM is een veelzijdige techniek die kan worden toegepast om het fibrilisatieproces van verschillende amyloïde eiwitten, omgevingsstimuli of genetische achtergronden in vivo op een niet-invasieve manier te vergelijken.

Het protocol laat zien hoe nauwkeurig de vorming van geaggregeerde soorten in levende C. eleganste controleren , zowel tijdens de natuurlijke veroudering en wanneer onderworpen aan stress. We selecteerden vier verschillende stammen van transgene aaltjes die polyglutamine-eiwitten uitdrukken van 40Q, 44Q of 85Q herhalingen. Deze eiwitten worden gesynthetiseerd in verschillende weefsels en werden gesmolten tot verschillende fluorophoren. De C. elegans stammen ofwel uitgedr...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging at JoVE.com

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Fluorescentie levenslange beeldvorming monitoren, kwantificeert en onderscheidt de aggregatie tendensen van eiwitten in het leven, veroudering, en benadrukt C. elegans ziekte modellen.

Karakterisering van Amyloïde Structuren in Aging C. Elegans met behulp van Fluorescentie Lifetime Imaging

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

De methode stelt ons in staat om geïntegreerde amyloïde eiwitstructuren duidelijk te onderscheiden van de oplosbare en zelfs geaccumuleerde tegenhangers. De techniek wordt in vivo uitgevoerd op een niet-invasieve manier met weinig of geen toxische bijwerkingen. Omdat het afhangt van de fluorescerende eigenschappen van de fluorofofof zelf, is het zeer robuust en reproduceerbaar na verloop van tijd.FLIM is gebruikt op het gebied van kankerdiagnose. We gebruiken het echter om de basismechanismen van eiwitaggregatie te bestuderen die inderdaad relevant zijn voor neurodegeneratieve ziekten. De methodologie kan worden gebruikt op het gebied van eiwitaggregatie.Zolang de ziekte geassocieerde eiwit is gelabeld met een fluorescerende sonde, het kan worden gevolgd en gecontroleerd na verloop van tijd. Verbindingen en strategieën die aggregatie bevorderen of voorkomen, kunnen met succes worden bestudeerd. Elk biologisch systeem dat het mogelijk maakt om te worden gevisualiseerd door lichtmicroscopie is geschikt voor FLIM, hetzij in vivo of ex vivo, bijvoorbeeld in celkweek, in gefixeerde of door middelgrote monsters en in alle benodigde middelen.Zorg ervoor dat u de eigenschappen van uw geselecteerde fluorofolaat in de aaltjes test voordat u experimentele gegevens verkrijgt en test of de installatie volledig functioneel is voordat u metingen verwerft. Om te beginnen, groeien en onderhouden van aaltjes op 20 graden Celsius op NGM platen. Leeftijd de aaltjes tot dag vier van het leven als de jonge volwassenen en dag acht van het leven als de oude volwassenen.Op de dag van de beeldvorming, beginnen met het voorbereiden van de beeldvorming dia's. Plaats agarose en dubbel gedestilleerd water bij een volumeconcentratie van 3%. Breng het in een magnetron te smelten en laat het dan iets afkoelen.Snijd de punt van een een milliliter pipet tip en neem ongeveer 200 microliter van de gesmolten agarose. Pipette de agarose op een schone glazen glijbaan en onmiddellijk plaats een tweede op de top het vermijden van de vorming van eventuele bubbels. Laat de glijbanen drogen en verwijder voorzichtig de bovenste glazen schuif.Het resultaat is een glazen schuif met een gelijkmatig egaal oppervlak waar de aaltjes worden geplaatst. Zodra de imaging setup is klaar voor gebruik, werken onder een stereo microscoop, plaats een 10 microliter druppel van verdovingsstof op een agarose pad en voorzichtig overdracht vijf tot 10 aaltjes in. Gebruik een wimperpunt om de aaltjes te scheiden.Houd ze dicht bij elkaar, maar niet aanraken om gemakkelijker lokalisatie van de aaltjes tijdens het verwerven van afbeeldingen mogelijk te maken. Leg de aaltjes voorzichtig over met een coverslip. Neem binnen een uur na montage metingen.Zorg ervoor dat de aaltjes volledig onbeweeglijk zijn. Open de FLIM acquisitie software. Zoek de tabknop en druk op uitvoer.Plaats de dia met de gemonteerde C.elegans op het podium en gebruik een 10X vergrotingslens in transmissiemodus, lokaliseer de positie van de aaltjes op de dia. Verwijder de dia, schakel de doelstelling om naar een 63X vergrotingslens en breng het vereiste onderdompelingsmedium aan. Plaats de dia op het podium en lokaliseer de aaltjes.Begin met het scannen van het monster. Selecteer een interessegebied en focus op het maximale projectievlak. Bekijk op de interface van de FLIM-software het aantal gedetecteerde fotonen.De ADC-waarde moet tussen één keer 10 tot de vierde en één keer 10 tot de vijfde liggen. Verleg indien nodig de focus op een ander vlak of verhoog de laserkracht om meer fotonen te verzamelen. Zorg ervoor dat u foton stapelen te voorkomen, maar het verzamelen van een voldoende hoeveelheid fotonen om een goede levensduur fit en meting te creëren.Selecteer op de menubalk het tabblad om de acquisitieparameters in te stellen. Selecteer scansynchronisatie om detectie van één foton mogelijk te maken. Stel de overname in op een vaste tijd of een vast aantal fotonen.Druk beginnen met acquisitie. Open de software en importeer FLIM-gegevensbestanden via bestand, laad FLIM-gegevens. Laad alle monsters van één voorwaarde, zelfs als het in verschillende sessies en uit verschillende biologische herhalingen wordt verkregen.Indien nodig, segmenteren om nematode signaal voor veel FLIM beeld via segmentatie, segmentatie manager. Sleep het bijsnijdgereedschap rond het interessegebied totdat het is gemarkeerd. Druk op OK, druk op OK. Selecteer een klein gebied waar de op intensiteit gebaseerde afbeelding van een C.elegans wordt weergegeven.De vervalcurve van dat gebied verschijnt in het grote vervalvenster aan de rechterkant van de interface. Om de levensduur te extrapoleren, stelt u op het tabblad gegevens een willekeurige geïntegreerde minimumwaarde in tussen 40 tot 300 om pixels uit te sluiten die te zwak zijn om een goede pasvorm te produceren. Selecteer een tijdsminimum en een maximum aantal tijd om het FLIM-signaal tot deze waarden te beperken.Wijzig het vooraf ingestelde aantal foton van één niet. Voer de herhalingssnelheid in megahertz van de laser gebruikt tijdens de overname. Voer een maximale poortwaarde in om alle verzadigde pixels uit te sluiten.Selecteer op het tabblad Levensduur een globale fitting die moet worden gebruikt. Wijzig geen andere parameter, behalve het aantal exponentiële selectie als bekend is dat het gekozen fluorescentieverval multi-exponentieel is en meer dan één levensduur vertoont. Upload de IRF via het IRF-menu.Als u de IRF-shift wilt schatten, selecteert u IRF, schat u de IRF-verschuiving. Er wordt automatisch een set waarden weergegeven op het tabblad IRF. Zodra dit is vastgesteld, mag u geen andere parameters van dit tabblad wijzigen.Zodra alle parameters zijn ingesteld, drukt u op fit dataset. De resulterende pasvorm die in een blauwe lijn wordt gemarkeerd, moet overlappen met alle gebeurtenissen. Een goede pasvorm wordt verkregen wanneer alle gebeurtenissen langs de pasvorm worden uitgelijnd.Klik op het tabblad parameters in de rechterbovenhoek van de interface van de software en selecteer statistiek, gewogen gemiddelde en controleer of de vierkante waarde van de chi zo dicht mogelijk bij een waarde is. De levensduurwaarde van de geselecteerde afbeelding wordt dus onthuld als tau one. Exporteer alle informatie van belang via bestand, export intensiteit beelden, fit resultaat tabel, afbeeldingen, histogrammen.Representatieve kaarten van C.elegans die gespierde Q40 RFP uitdrukken op dag vier of dag acht van het leven worden hier getoond. De langere Q-rek van de IQ85 was meer vatbaar voor aggregatie en vertoonde een fluorescentie levenslange verschuiving in het histogram al op dag vier van het leven. In feite, op dag vier, foci vorming werd waargenomen voor IQ85, terwijl nog steeds afwezig in IQ44.Bij veroudering vertoonde IQ44 echter ook focivorming en dus een verminderde fluorescentieleven. Ten slotte werd focivorming niet gedetecteerd, noch was een verminderde fluorescentieleven in de NQ40CFP-stam. Voor deze stam, waren er slechts subtiele niet-significante veranderingen in de gemiddelde fluorescentie leven bij veroudering.Zodra het nematodemodel is vastgesteld, is de hoeveelheid ingezameld foton van het grootste belang om een goede levenslange pasvorm te verkrijgen. De methode kan verder worden samengevoegd met verschillende technieken, zoals Forster resonantie energieoverdracht, FRET, fluorescentieherstel na fotobleaching, FRAP of meting. Al deze aanpassingen geven extra informatie over de eigenschappen van de eiwitstudies en de geaggregeerde vorm.Op het gebied van eiwitaggregatie en eiwithomeostase, de techniek toegestaan om elke verstoring opgelegd aan het systeem, de distributie van verschillende eiwitsoorten, en de handel en in het algemeen het verschil en de betekenis van oplosbare en onoplosbare eiwitfracties binnen het levende organisme te onderzoeken. De verdovings natrium azide is giftig en moet worden behandeld met handschoenen en bril en verdund onder een rookkap. Omdat de techniek op microscopie is gebaseerd, is het belangrijk om alle waarschuwingen met betrekking tot het werken met lasers te volgen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging amyloïde weefsels gekleurd met verlichte geconjugeerd Oligothiophenes door hyperspectrale Confocal Microscopie en fluorescentie levensduur Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Structurele karakterisering van Mannan celwand polysacchariden in installaties die gebruikmaken van tempo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Groeiende eiwit kristallen met verschillende afmetingen, met behulp van geautomatiseerde kristallisatie in combinatie met In Situ Dynamische lichtverstrooiing

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Gebruik van twee dimensionale semi-denatureren wasmiddel Agarose gelelektroforese te bevestigen grootte heterogeniteit van amyloïde of Amyloid-achtige vezels

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Snelle fluorescentie gebaseerde karakterisering van één extracellulaire blaasjes in menselijk bloed met Nanoparticle-tracking analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende entiteiten (SUBEs) als hulpmiddelen voor de verrijking, isolatie, identificatie en karakterisering van de SUMO proteome in leverkanker

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...