Name: characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging
Uploaded: 2020-03-27T15:00:00
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Der Muskel-Q40-mRFP-Stamm des CGC, der vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Das neuronale-Q40-CFP war ein freundliches Geschenk des Morimoto Lab. Wir würdigen die DFG (KI-1988/5-1 bis JK, NeuroCure PhD Fellowship des NeuroCure Cluster of Excellence to MLP), EMBO (Kurzzeitstipendium an MLP) und das Unternehmen der Biologen (Reisestipendien an CG und MLP) für die Förderung. Wir würdigen auch die Advanced Light Microscopy Imaging Facility am Max Delbrück Centre for Molecular Medicine, Berlin, für die Bereitstellung der Einrichtung, um die YFP-Konstrukte abzubilden.

1. Synchronisation von C. elegans
<ol><li>Synchronisieren Sie C. elegans entweder über alkalische Hypochloritlösung oder über einfache Eiablage für 4 h bei 20 °C8.</li>
	<li>Nematoden bei 20 °C anbauen und pflegen auf Nematoden-Wachstumsmediumplatten (NGM), die mit OP50 E. coli nach Standardverfahrengesätsind 9 . Altern Sie die Nematoden bis zum gewünschten Entwicklungsstadium oder Tag. HINWEIS: In diesem Protokoll werden junge Erwach...

<ol>
	<li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease.">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li><li>Kikis, E. 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W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+fluorescence+microscopy.">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).</li></ol>

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine mikroskopiebasierte Technik zur Identifizierung aggregierter Arten im C. elegans-Modellsystem. FLIM kann das Vorhandensein sowohl aggregierter als auch löslicher Arten, die zu einem Fluorophor verschmolzen sind, durch Messung ihrer Fluoreszenz-Lebensdauer-Zerfalle genau charakterisieren. Wenn ein Fusionsprotein beginnt, seine aufgezeichnete durchschnittliche Lebensdauer zu aggregieren, verschiebt sich es von einem höheren auf einen niedrigeren Wert<sup class="xre...

Proteinaggregation tritt sowohl im Alter als auch bei Krankheiten auf. Die Wege, die zur Bildung und Ablagerung von großen Amyloiden oder amorphen Einschlüssen führen, sind schwer zu folgen und ihre Kinetik ist ähnlich schwierig zu entwirren. Proteine können sich aufgrund intrinsischer Mutationen in ihren Codierungssequenzen falsch falten, wie im Falle genetischer Krankheiten. Proteine verrenken sich auch, weil das Proteostase-Netzwerk (PN), das sie löslich und richtig gefaltet hält, beeinträchtigt wird, wie es während des Alterns geschieht. Das PN umfasst molekulare Chaperones und Abbaumaschinen und ist verantwortlich für die Biogenese, Faltung, den Handel und den Abbau von Proteinen1.
C. elegans hat sich als Modell zur Untersuchung von Alterung und Krankheit aufgrund seiner kurzen Lebensdauer, isogenen Natur und Leichtigkeit der genetischen Manipulation herauskristallisiert. Mehrere transgene C. elegans-Stämme, die menschliche krankheitserregende Proteine in empfindlichen Geweben ausdrücken, wurden geschaffen. Wichtig ist, dass viele der Stämme, die aggregationsanfällige Proteine enthalten, das Kennzeichen von Amyloid-Störungen, der Bildung großer Einschlüsse, rekapitulieren. Dank des transparenten Körpers von C. elegans können diese Aggregate in vivo, nicht-invasiv und zerstörungsfrei visualisiert werden2. Die Erzeugung von Proteinen von Interesse (POI) in der Fusion mit einem Fluorophor ermöglicht es, seine Standorte, den Menschenhandel, das Interaktionsnetzwerk und das allgemeine Schicksal zu untersuchen.
Wir präsentieren ein Protokoll zur Überwachung der Aggregation von krankheitserregenden Proteinen im lebenden und alternden C. elegans mittels Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM). FLIM ist eine leistungsstarke Technik, die auf der Lebensdauer eines Fluorophors und nicht auf seinen Emissionsspektren basiert. Die Lebensdauer (tau, b) ist definiert als die durchschnittliche Zeit, die ein Photon benötigt, um von seinem angeregten Zustand zurück in seinen Bodenzustand zu zerfallen. Die Lebensdauer eines bestimmten Moleküls wird mit der Zeit-Domänen-Technik der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC) berechnet. In TCSPC-FLIM wird die fluoreszierende Zerfallsfunktion durch Das Aufregen des Fluorophors mit kurzen, hochfrequenten Laserpulsen und die Messung der Ankunftszeiten des emittierten Photons an einen Detektor in Bezug auf die Impulse erreicht. Beim Scannen eines Samples wird für jedes Pixel ein dreidimensionales Datenarray erstellt: Das Array x,y enthält Informationen über die Verteilung der Photonen in ihren xy-Raumkoordinaten und ihre zeitliche Zerfallskurve. Eine bestimmte Probe wird daher zu einer Karte der Lebensdauer, die Informationen über die Struktur, Bindung und Umgebung des Proteins3,4enthält. Jedes fluoreszierende Protein besitzt eine intrinsische und genau definierte Lebensdauer, in der Regel von wenigen Nanosekunden (ns), abhängig von seinen physiochemischen Eigenschaften. Wichtig ist, dass die Lebensdauer eines Fluorophors unabhängig von seiner Konzentration, fluoreszierenden Intensität und der bildgebenden Methodik ist. Innerhalb eines biologischen Systems kann es jedoch durch Umweltfaktoren wie pH, Temperatur, Ionenkonzentrationen, Sauerstoffsättigung und seine Interaktionspartner beeinflusst werden. Lebenszeiten reagieren auch empfindlich auf interne strukturelle Veränderungen und Orientierung. Die Verschmelzung eines Fluorophors mit einem POI führt zu einer Änderung seiner Lebensdauer und folglich zu Informationen über das Verhalten des geschmolzenen Proteins. Wenn ein Fluorophor in einer eng gebundenen Umgebung umgeben oder gekapselt ist, wie z. B. die antiparallelen Beta-Platten einer Amyloidstruktur, verliert es Energie nicht-strahlungend, ein Prozess, der als Abschrecken5bekannt ist. Das Abschrecken des Fluorophors führt zu einer Verkürzung seiner scheinbaren Lebensdauer. Wenn es löslich ist, bleibt die Lebensdauer eines Proteins näher an seinem ursprünglichen, höheren Wert. Im Gegensatz dazu, wenn ein Protein beginnt zu aggregieren, wird seine Lebensdauer unweigerlich auf einen niedrigeren Wert6,7verschieben. Daher wird es möglich, die Aggregationsneigung jedes Amyloid-bildenden Proteins in verschiedenen Altersstufen in lebenden C. eleganszu überwachen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse der Aggregation eines Fusionsproteins, das verschiedene Polyglutamin (CAG, Q) Dehnungen (Q40, Q44 und Q85) umfasst. Wir veranschaulichen, wie die Technik gleichermaßen auf verschiedene Fluorophore angewendet werden kann, wie Z. B. Cyan-Fluoreszenzprotein (CFP), gelbes fluoreszierendes Protein (YFP) und monomeres rotes Fluoreszenzprotein (mRFP); und in allen Geweben von C. elegans, einschließlich der Neuronen, Muskeln, und der Darm. Darüber hinaus ist FLIM im Zusammenhang mit der Proteostase ein sehr nützliches Werkzeug, um Veränderungen bei der Erschöpfung molekularer Chaperonen zu beobachten. Das Abklopfen eines der wichtigsten molekularen Chaperone, das Hitzeschockprotein 1 (hsp-1), über RNA-Interferenz erzeugt eine vorzeitige Fehlfaltung von Proteinen. Die Erhöhung der Aggregationslast als Folge von Alterung, Krankheit oder mangelhaften Chaperonen wird dann als Abnahme der Fluoreszenzlebensdauer gemessen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ahringer Library hsp-1 siRNA</td>
			<td>Source BioScience UK Limited</td>
			<td>F26D10.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.3</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H DCS-120 SPC-150</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H SPC830-SPC Image</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ44-YFP</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OG412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ85-YFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans mQ40-RFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans nQ40-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>2316.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoQuant PicoHarp300</td>
			<td>PicoQuant GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K305.1</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Agarose</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510-Meta NLO</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging

Amyloidfibrillen sind mit einer Reihe von neurodegenerativen Erkrankungen wie Huntington, Parkinson oder Alzheimer verbunden. Diese Amyloidfibrillen können endogene metastabile Proteine sowie Komponenten des Proteostase-Netzwerks (PN) sequestrieren und dadurch die Proteinfehlfaltung in der Zelle verschlimmern. Es gibt eine begrenzte Anzahl von Werkzeugen zur Verfügung, um den Aggregationsprozess von Amyloidproteinen innerhalb eines Tieres zu bewerten. Wir präsentieren ein Protokoll für die Fluoreszenz-Lebensdauermikroskopie (FLIM), das die Überwachung und Quantifizierung der Amyloidfibrille in bestimmten Zellen, wie Neuronen, auf nichtinvasive Weise und mit dem Fortschreiten des Alterns und bei PN. FLIM ist unabhängig von den Expressionsniveaus des Fluorophors und ermöglicht eine Analyse des Aggregationsprozesses ohne weitere Färbung oder Bleichen. Fluorophore werden abgeschreckt, wenn sie sich in unmittelbarer Nähe von Amyloidstrukturen befinden, was zu einer Abnahme der Fluoreszenzlebensdauer führt. Die Abschreckung korreliert direkt mit der Aggregation des Amyloidproteins. FLIM ist eine vielseitige Technik, die angewendet werden kann, um den Fibrillenprozess verschiedener Amyloidproteine, Umweltreize oder genetische Hintergründe in vivo auf nicht-invasive Weise zu vergleichen.

Das Protokoll zeigt, wie die Bildung von aggregierten Arten in lebenden C. elegansgenau überwacht werden kann, sowohl während seiner natürlichen Alterung als auch bei Stress. Wir wählten vier verschiedene Stämme von transgenen Nematoden aus, die Polyglutaminproteine von 40Q, 44Q oder 85Q Wiederholungen exdrücken. Diese Proteine werden in verschiedenen Geweben synthetisiert und zu verschiedenen Fluorophoren verschmolzen. Die C. elegans-Stämme exprimieren entweder Q...

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Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Fluoreszenzlebensdauer Bildgebung überwacht, quantifiziert und unterscheidet die Aggregationstendenzen von Proteinen in lebenden, Alterung, und gestressten C. elegans Krankheitsmodelle.

Charakterisierung von Amyloidstrukturen im Altern C. Elegans mit Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Die Methode ermöglicht es uns, integrierte Amyloid-Proteinstrukturen klar von den löslichen und sogar akkumulierten Gegenstücken zu unterscheiden. Die Technik wird in vivo in einer nichtinvasiven Weise mit wenig oder gar keinen toxischen Nebenwirkungen durchgeführt. Da es von den fluoreszierenden Eigenschaften des Fluorophors selbst abhängt, ist es sehr robust und im Laufe der Zeit reproduzierbar.FLIM wurde im Bereich der Krebsdiagnose eingesetzt. Wir verwenden es jedoch, um die grundlegenden Mechanismen der Proteinaggregation zu untersuchen, die in der Tat für neurodegenerative Erkrankungen relevant sind. Die Methodik kann im Bereich der Proteinaggregation eingesetzt werden.Solange das mit der Krankheit verbundene Protein mit einer fluoreszierenden Sonde markiert ist, kann es im Laufe der Zeit verfolgt und überwacht werden. Verbindungen und Strategien, die eine Aggregation fördern oder verhindern, können erfolgreich untersucht werden. Jedes biologische System, das eine Visualisierung durch Lichtmikroskopie ermöglicht, eignet sich für FLIM entweder in vivo oder ex vivo, z.B. in der Zellkultur, in fixierten oder permeabilisierten Proben und in jedem erforderlichen Medium.Achten Sie darauf, die Eigenschaften Ihres ausgewählten Fluorophors innerhalb der Nematode zu testen, bevor Sie experimentelle Daten erhalten, und testen Sie, ob das Setup voll funktionsfähig ist, bevor Sie Messungen erfassen. Beginnen, wachsen und halten Nematoden bei 20 Grad Celsius auf NGM-Platten. Altern Sie die Nematoden bis zum vierten Tag des Lebens als die jungen Erwachsenen und Tag acht des Lebens als die alten Erwachsenen.Beginnen Sie am Tag der Bildgebung mit der Vorbereitung der Bilddias. Agabarose und doppelt destilliertes Wasser mit einer Konzentration von 3% Volumen aufstellen. Übertragen Sie es in eine Mikrowelle, um zu schmelzen und lassen Sie es dann leicht abkühlen.Schneiden Sie die Spitze einer ein Milliliter Pipette Spitze und nehmen Sie etwa 200 Mikroliter der geschmolzenen Agarose. Pipette die Agarose auf eine saubere Glasrutsche und sofort eine zweite auf die Oberseite, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Lassen Sie die Dias trocknen und entfernen Sie vorsichtig die obere Glasrutsche.Das Ergebnis ist ein Glasschlitten mit einer gleichmäßigen Agarose-Oberfläche, auf der die Nematoden positioniert werden. Sobald das bildgebende Setup einsatzbereit ist und unter einem Stereomikroskop arbeitet, legen Sie einen 10-Mikroliter-Tropfen Anästhetika auf ein Agarose-Pad und übertragen Sie vorsichtig fünf bis zehn Nematoden hinein. Verwenden Sie eine Wimpernspitze, um die Nematoden zu trennen.Halten Sie sie dicht beieinander, aber nicht berührend, um eine einfachere Lokalisierung der Nematoden während der Bildaufnahme zu ermöglichen. Überlagern Sie die Nematoden vorsichtig mit einem Deckelschlupf. Nehmen Sie innerhalb einer Stunde nach der Montage Messungen vor.Stellen Sie sicher, dass die Nematoden völlig unbeweglich sind. Öffnen Sie die FLIM-Erfassungssoftware. Suchen Sie die Tab-Taste und drücken Sie die Aktivierungsausgänge.Platzieren Sie das Dia mit den montierten C.elegans auf der Bühne und verwenden Sie eine 10-fache Vergrößerungslinse im Übertragungsmodus, lokalisieren Sie die Position der Nematoden auf dem Dia. Entfernen Sie den Schlitten, schalten Sie das Objektiv auf eine 63X Vergrößerungslinse um, und wenden Sie das erforderliche Tauchmedium an. Platzieren Sie die Folie auf der Bühne und lokalisieren Sie die Nematoden.Starten Sie das Scannen des Beispiels. Wählen Sie eine Region aus, die von Interesse ist, und konzentrieren Sie sich auf die maximale Projektionsebene. Zeigen Sie auf der Schnittstelle der FLIM-Software eine Vorschau der Anzahl der erkannten Photonen an.Der ADC-Wert sollte zwischen einem Mal 10 bis dem vierten und ein mal 10 bis fünf liegen. Verschieben Sie bei Bedarf den Fokus auf eine andere Ebene oder erhöhen Sie die Laserleistung, um mehr Photonen zu sammeln. Stellen Sie sicher, dass Sie Photonenhaufen vermeiden, aber eine ausreichende Menge an Photonen sammeln, um eine gute Lebensdauer Passform und Messung zu schaffen.Wählen Sie in der Menüleiste die Registerkarte aus, um die Erfassungsparameter festzulegen. Wählen Sie Scan-Synchronisierung ein, um eine einzelne Photonenerkennung zu ermöglichen. Legen Sie die Erfassung auf eine feste Zeit oder eine feste Anzahl von Photonen fest.Drücken Sie den Start der Erfassung. Öffnen Sie die Software und importieren Sie FLIM-Datendateien per Datei, laden Sie FLIM-Daten. Laden Sie alle Proben aus einer Bedingung, auch wenn sie in verschiedenen Sitzungen und aus verschiedenen biologischen Wiederholungen erhalten werden.Ggf. Segment, um Nematoden für viele FLIM-Bilder über Segmentierung zu signalisieren, Segmentierungsmanager. Ziehen Sie das Zuschneidewerkzeug um den Interessenbereich, bis es hervorgehoben wird. Sobald Sie fertig sind, drücken Sie OK. Wählen Sie einen kleinen Bereich aus, in dem das intensitätsbasierte Bild eines C.elegans angezeigt wird.Die Zerfallskurve dieses Bereichs wird im großen Zerfallsfenster auf der rechten Seite der Schnittstelle angezeigt. Um die Lebensdauer zu extrapolieren, legen Sie auf der Registerkarte Daten einen beliebigen integrierten Mindestwert zwischen 40 und 300 fest, um Pixel auszuschließen, die zu wenig sind, um eine gute Passform zu erzeugen. Wählen Sie ein Zeitminimum und eine maximale Zeitzahl aus, um das FLIM-Signal auf diese Werte zu beschränken.Ändern Sie nicht die voreingestellten Zahlen Photon von einem. Geben Sie die Wiederholungsrate in Megahertz des Lasers ein, der während der Erfassung verwendet wird. Geben Sie einen Gate-Max-Wert ein, um alle gesättigten Pixel auszuschließen.Wählen Sie auf der Registerkarte Lebensdauer ein globales Fitting aus, das verwendet werden soll. Ändern Sie keinen anderen Parameter außer der Anzahl der exponentiellen Selektion, wenn bekannt ist, dass der gewählte Fluoreszenzzerfall multiexponentiell ist und mehr als eine Lebensdauer aufweist. Laden Sie den IRF über das IRF-Menü hoch.Um die IRF-Verschiebung zu schätzen, wählen Sie IRF, iRF-Verschiebung. Ein Satz von Werten wird automatisch auf der Registerkarte IRF angezeigt. Sobald dies eingerichtet ist, ändern Sie keine anderen Parameter dieser Registerkarte.Sobald alle Parameter festgelegt sind, drücken Sie den Anpassungsdatensatz. Die resultierende Anpassung, die in einer blauen Linie hervorgehoben wird, sollte sich mit allen Ereignissen überlappen. Eine gute Passform wird erhalten, wenn alle Ereignisse entlang der Passform ausgerichtet sind.Klicken Sie auf die Registerkarte Parameter in den oberen rechten Menüs der Software-Schnittstelle, und wählen Sie die Statistik, den gewichteten Mittelwert, und überprüfen Sie, ob der Chi-Quadratwert so nah wie möglich an einem ist. Der Lebensdauerwert des ausgewählten Bildes wird somit als Tau 1 offenbart. Exportieren Sie alle Informationen von Interesse durch Datei, ExportIntensität Bilder, passen Ergebnistabelle, Bilder, Histogramme.Repräsentative Karten von C.elegans, die muskulöse Q40 RFP am vierten oder achten Tag des Lebens ausdrücken, werden hier gezeigt. Die längere Q-Strecke des IQ85 war anfälliger für Aggregation und zeigte bereits am vierten Tag des Lebens eine Fluoreszenz-Lebensdauerverschiebung im Histogramm. Tatsächlich wurde am vierten Tag die Foci-Bildung für IQ85 beobachtet, während es in IQ44 noch fehlte.Nach dem Altern zeigte IQ44 aber auch eine Foci-Bildung und damit eine reduzierte Fluoreszenzlebensdauer. Schließlich wurde die Foci-Bildung weder nachgewiesen noch die Fluoreszenzlebensdauer im NQ40CFP-Stamm verringert. Für diese Sorte gab es nur subtile nicht signifikante Veränderungen der mittleren Fluoreszenzlebensdauer nach alterung.Sobald das Nematodenmodell etabliert ist, ist die Menge des gesammelten Photons von größter Bedeutung, um eine gute Lebenslange Passform zu erhalten. Das Verfahren kann weiter mit verschiedenen Techniken wie Forster-Resonanzenergieübertragung, FRET, Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichmittel, FRAP oder Messung verbunden werden. Alle diese Anpassungen liefern zusätzliche Informationen über die Eigenschaften der Proteinstudien und ihre aggregierte Form.Im Bereich der Proteinaggregation und Proteinhomöostase erlaubte die Technik die Untersuchung jeglicher Störungen, die dem System auferlegt wurden, die Verteilung verschiedener Proteinarten und den Handel und im Allgemeinen die Unterschiede und Bedeutung von löslichen und unlöslichen Proteinfraktionen innerhalb des lebenden Organismus. Das Anästhetikum Natriumazid ist giftig und sollte mit Handschuhen und Schutzbrille niert und unter einer Dunstabzugshaube verdünnt werden. Da die Technik auf Mikroskopie basiert, ist es wichtig, alle Warnungen im Zusammenhang mit der Arbeit mit Lasern zu befolgen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging-Amyloid Gewebe gebeizt mit lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes von hyperspektralen konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Forschung

Biochemie

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Strukturelle Charakterisierung von Mannan Zellwand Polysaccharide in Anlagen, in denen Tempo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Wachsende Proteinkristallen mit unterschiedlichen Abmessungen mit automatisierten Kristallisation gepaart mit In Situ dynamische Lichtstreuung

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Verwendung von zwei dimensionale Semi-denaturierenden Waschmittel Agarose Gelelektrophorese Größe Heterogenität von Amyloid oder Amyloid-wie Fasern zu bestätigen

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Rasche Fluoreszenz basierende Charakterisierung der einzelnen extrazelluläre Vesikel im menschlichen Blut mit Nanopartikel-Tracking Analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities (SUBEs) als Werkzeuge zur Anreicherung, Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung des SUMO-Proteoms bei Leberkrebs

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...