Name: characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging
Uploaded: 2020-03-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging at JoVE.com

המתח שרירים-Q40-mRFP שסופקו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). הQ40-CFP היה מתנה מהסוג של מעבדת מורימוטו. אנו מכירים DFG (KI-1988/5-1 לייק, מלגת נוירוקיור PhD על ידי אשכול נוירוקיור של מצוינות to MLP), EMBO (האחווה לטווח קצר MLP) והחברה של ביולוגים (מענקים נסיעה ל-CG ו MLP) עבור מימון. אנו מכירים גם את מתקן הדימות המתקדם של מיקרוסקופ האור במרכז מקס דלבריק לרפואה מולקולרית, ברלין, על מנת לספק את הכיוונון לדימוי המבנים של YFP.

1. סנכרון הג
<ol><li>סינכרון C. אלגיה או באמצעות הטיפול היפוכלוריט פתרון אלקליין או דרך הנחת ביצה פשוטה עבור 4 h ב 20 ° צ'8.</li>
	<li>לגדול ולתחזק נמטודות ב 20 ° c על הצמיחה נמטודות בינונית (ngm) צלחות שנזרע עם OP50 E. coli על פי הליכים סטנדרטיים9. גיל הנמדות עד לשלב או לי?...

<ol>
	<li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease.">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li><li>Kikis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+struggle+by+Caenorhabditis+elegans+to+maintain+proteostasis+during+aging+and+disease.">The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease.</a> Biology Direct. 11, 58 (2016).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+-+techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).</li><li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+measurements+and+biological+imaging.">Fluorescence lifetime measurements and biological imaging.</a> Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li><li>Kaminski Schierle, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET+sensor+for+non-invasive+imaging+of+amyloid+formation+in+vivo.">A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo.</a> ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).</li><li>Sandhof, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+INS-IGF1+signaling+protects+against+non-cell+autonomous+vesicle+rupture+caused+by+SNCA+spreading.">Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading.</a> Autophagy. , 1-22 (2019).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).</li><li>Becker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Lifetime+Imaging+by+Time-Correlated+Single-Photon+Counting.">Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting.</a> Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).</li><li>Warren, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+global+fitting+of+large+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+datasets.">Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets.</a> PloS one. 8 (8), e70687 (2013).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+of+proteostasis+represents+an+early+molecular+event+in+Caenorhabditis+elegans+aging.">Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Specific+Intrinsic+Fluorescence+of+Protein+Amyloids+Used+to+Study+their+Kinetics+of+Aggregation.">Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation.</a> Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).</li><li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Reveals+the+Aggregation+Processes+of+&#945;-Synuclein+and+Polyglutamine+in+Aging+Caenorhabditis+elegans.">Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of &#945;-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).</li><li>Kelbauskas, L., Dietel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Aggregated+Photosensitizers+by+Tumor+Cells:+Subcellular+Time-resolved+Fluorescence+Spectroscopy+on+Derivatives+of+Pyropheophorbide-a+Ethers+and+Chlorin+e6+under+Femtosecond+One-+and+Two-photon+Excitation.">Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).</li><li>Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+and+FCS+detection+in+laser-scanning+microscopes:+Increased+efficiency+by+GaAsP+hybrid+detectors.">FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors.</a> Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).</li><li>Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+fluorescence+microscopy.">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).</li></ol>

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר טכניקה מבוססת-מיקרוסקופית לזיהוי מינים צבורים במערכת המודל של C. אלגיה . FLIM יכולה לאפיין במדויק את הנוכחות של מינים צבורים ומסיסים התמזגו לפלואורופור באמצעות מדידה של תקופת החיים הפלואורסצנטית שלהם. כאשר חלבון היתוך מתחיל לצבור חיים ממוצע מוקלט שלה יעבור מגב...

צבירת חלבונים מתרחשת הן בהזדקנות והן במחלה. המסלולים להוביל היווצרות והתצהיר של amyloids גדול או אמורפיות קשה לעקוב אחר הקינטיקה שלהם הם דומים מאתגרת לפענח. חלבונים יכול להטעות בשל מוטציות פנימיות בתוך רצפי הקידוד שלהם, כמו במקרה של מחלות גנטיות. חלבונים גם misfold כי הרשת פרוטאוסטזיס (PN) שמשאיר אותם מסיסים ומקופל כראוי הוא לקוי, כפי שקורה במהלך ההזדקנות. ה-PN כולל מלווים מולקולריים וmachineries השפלה והוא אחראי על ביוגנזה, קיפול, סחר והשפלה של חלבונים1.
ג. אלגיה התפתחה כמודל לחקר הזדקנות ומחלות בשל תוחלת החיים הקצרה שלה, הטבע האיזוגני וקלות התפעול הגנטי. מספר זנים של C. אלגיה המבטאים את החלבונים הגורמים למחלות אנושיות ברקמות פגיעות נוצרו. חשוב מכך, רבים מבין הזנים המכילים חלבונים הנוטים לצבור לכידה של סימן ההיכר של הפרעות עמילואיד, היווצרות של הכללות גדולות. הודות לגוף השקוף של ה-"אלאלגיה" , ניתן לדמיין את האגרגטים האלה בvivo, באופן בלתי פולשני ובלתי מורגש2. יצירת חלבון כלשהו של עניין (פוי) ב פיוז ' ן עם fluorophore מאפשר לחקור את מיקומם, סחר, אינטראקציה ברשת, והגורל הכללי.
אנו מציגים פרוטוקול לנטר את צבירת החלבונים הגורמים למחלות בחיים ובהזדקנות באמצעות מיקרוסקופהדמיה מתקופת החיים הפלואורסצנטית (flim). FLIM היא טכניקה רבת עוצמה המבוססת על החיים של fluorophore ולא ספקטרום הפליטה שלה. החיים (טאו, τ) מוגדר כזמן הממוצע הנדרש על ידי פוטון להירקב מהמצב הנרגש שלו בחזרה למדינה הקרקע שלה. תקופת החיים של מולקולה נתונה מחושבת עם טכניקת הזמן-תחום של מתאם הפוטון בודד הזמן (TCSPC). ב TCSPC-FLIM, הפונקציה ריקבון פלורסנט מושגת על ידי מרגש fluorophore עם קצר, בתדר גבוה פולסים לייזר ומדידת זמני הגעתו של פוטון הנפלט גלאי ביחס לפולסים. בעת סריקת דוגמה, נוצר מערך נתונים תלת-מימדי עבור כל פיקסל: המערך כולל מידע על התפלגות הפוטונים בקואורדינטות x, y מרחבית ועקומת הדעיכה שלהם. דוגמה נתונה הופכת למפת תקופות חיים החושפת מידע על מבנה החלבון, הכריכה והסביבה3,4. כל חלבון פלורסנט בעל חיים מהותיים ומוגדרים בדיוק, בדרך כלל של כמה ננושניות (ns), התלויים במאפיינים הפיזיוכימיים שלו. וחשוב מכך, תקופת החיים של פלואורואופלפור אינה תלויה בריכוז שלה, בעוצמת הפלורסנט ובמתודולוגיה של הדמיה. עם זאת, בתוך מערכת ביולוגית, זה יכול להיות מושפע גורמים סביבתיים כגון pH, טמפרטורה, ריכוזי יונים, רווית חמצן, ואת השותפים אינטראקציה שלה. משך החיים רגיש גם לשינויים ולאוריינטציה פנימיים של המבנה. החדרת פלואורואופלפור ל-פוי גורמת לשינוי בתקופת חייו וכתוצאה מכך מידע על התנהגות החלבון התמזגו. כאשר fluorophore מוקף או כפוף בסביבה מאוגד היטב, כגון גיליונות בטא אנטי מקבילי של מבנה עמילואיד, הוא מאבד את האנרגיה בלתי-קרינה, תהליך המכונה מקוצ'ינג5. קוצ'ינג של fluorophore תוצאות קיצור של החיים לכאורה שלה. כאשר מסיסים, חיי החלבון יישארו קרובים יותר לערך המקורי, הגבוה יותר. לעומת זאת, כאשר חלבון מתחיל לצבור, החיים שלו באופן בלתי נמנע משתנה לערך נמוך יותר6,7. לכן, ניתן לנטר את הנטייה של הצבירה של כל חלבון היוצר עמילואיד בגילאים שונים בחיים C. אלגיה.
כאן אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הצבירה של חלבון היתוך המורכב polyglutamine שונים (הקאג, Q) מותח (Q40, Q44, ו Q85). אנו ממחישים כיצד ניתן ליישם את הטכניקה באופן שווה לצבעים שונים, כגון חלבון פלורסנט כחול (CFP), חלבון פלורסנט צהוב (YFP) ו חלבון פלורסנט monomeric (mRFP); ובכל הרקמות של הג, כולל הנוירונים, השרירים והמעיים. יתר על כן, בהקשר של פרוטאוסטזיס, FLIM הוא כלי שימושי מאוד להתבונן שינויים על דלדול של מלווים מולקולריים. הורסים את אחד מהמלווים המולקולריים המרכזיים, חלבון הלם חום 1 (hsp-1), באמצעות הפרעות RNA מפיקה חוסר מוקדמות של חלבונים. הגידול בעומס מצבור כתוצאה של הזדקנות, מחלות או מלווים לקויה, נמדד אז כירידה בחיים הפלואורסצנטית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ahringer Library hsp-1 siRNA</td>
			<td>Source BioScience UK Limited</td>
			<td>F26D10.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.3</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H DCS-120 SPC-150</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H SPC830-SPC Image</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ44-YFP</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OG412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ85-YFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans mQ40-RFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans nQ40-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>2316.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoQuant PicoHarp300</td>
			<td>PicoQuant GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K305.1</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Agarose</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510-Meta NLO</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging

סיבים עמילואיד קשורים מספר מחלות ניווניות כגון הנטינגטון, פרקינסון, או אלצהיימר. העמילואיד הללו יכול להתאים חלבונים אנדוגניים, כמו גם רכיבים של רשת פרוטאוסטזיס (PN) ובכך להחריף את החלבון misfolding בתא. יש מספר מוגבל של כלים הזמינים כדי להעריך את תהליך הצבירה של חלבונים עמילואיד בתוך בעל חיים. אנו מציגים פרוטוקול עבור מיקרוסקופ לכל החיים של הזריחה (FLIM) המאפשר ניטור כמו גם כימות של העמילואיד בתאים ספציפיים, כגון נוירונים, בצורה לא פולשנית ועם ההתקדמות של הזדקנות על הפרטורציה של PN. FLIM אינה תלויה ברמות הביטוי של הפלואורוופפור ומאפשרת ניתוח של תהליך הצבירה ללא כתמים או הלבנה נוספים. Fluorophores הם מורהים כאשר הם בקרבת מבנים עמילואיד, אשר גורמת לירידה של תקופת החיים הפלואורסצנטית. הקוצ'ינג מתואם ישירות לצבירת חלבון ה-עמילואיד. FLIM היא טכניקה רב-תכליתית שניתן להחיל כדי להשוות את תהליך fibrilization של חלבונים עמילואיד שונים, גירויים סביבתיים, או רקע גנטי vivo באופן לא פולשני.

הפרוטוקול מראה כיצד לפקח באופן מדויק על היווצרות מינים צבורים בתוך החיים,הן במהלך ההזדקנות הטבעית וכאשר הם חשופים ללחץ. בחרנו ארבעה זנים שונים של נמטודות המבטא חלבונים polyglutamine של או 40q, 44q, או 85 q חוזר על עצמו. חלבונים אלה מסונתז ברקמות שונות התמזגו fluorophores שונים. ה -C. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging at JoVE.com

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

הדמיה של מסכי החיים של הקרינה הפלואורסצנטית, כימות ומבדיל את נטיות הצבירה של חלבונים בחיים, הזדקנות, והדגיש מודלים של מחלות C.

אפיון מבני עמילואיד בהזדקנות C. אלגיה באמצעות הדמיה של תקופת החיים הפלואורסצנטית

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

השיטה מאפשרת לנו להבחין בבירור בין מבני חלבון עמילואיד משולבים לבין המקבילים המסיסים ואף המצטברים. הטכניקה מבוצעת ב vivo באופן פולשני עם מעט או ללא תופעות לוואי רעילות. כפי שהוא תלוי במאפיינים הפלואורסצנטיים של הפלואורופור עצמו, הוא חזק מאוד והתרבות לאורך זמן.FLIM נוצל בתחום אבחון סרטן. עם זאת, אנו מעסיקים אותו כדי ללמוד את המנגנונים הבסיסיים של צבירת חלבונים אשר אכן רלוונטיים למחלות ניווניות. המתודולוגיה יכולה לשמש בתחום צבירת החלבון.כל עוד החלבון הקשור למחלה מתויג עם בדיקה פלואורסצנטית, ניתן לעקוב אחריו ולנטר אותו לאורך זמן. ניתן ללמוד בהצלחה תרכובות ואסטרטגיות המקדמות או מונעות צבירה. כל מערכת ביולוגית המאפשרת להיות חזותית על ידי מיקרוסקופיה אור מתאים FLIM או vivo או ex vivo, למשל בתרבות התא, בדגימות מקובעות או מחלחלות ובכל מדיום הכרחי.הקפד לבדוק את המאפיינים של הפלואורופור שבחרת בתוך nematode לפני קבלת נתונים ניסיוניים כדי לבדוק כי ההתקנה מתפקדת באופן מלא לפני רכישת מדידות. כדי להתחיל, לגדול ולתחזק nematodes ב 20 מעלות צלזיוס על לוחות NGM. גיל nematodes עד היום הרביעי של החיים כמו הצעירים ואת היום השמיני של החיים כמו המבוגרים.ביום ההדמיה, התחל בהכנת שקופיות ההדמיה. מניחים אגרוז ומים מזוקקים כפולים בריכוז של 3% משקל לפי נפח. מעבירים אותו למיקרוגל כדי להמיס ולאחר מכן נותנים לו להתקרר מעט.חותכים את הקצה של קצה פיפיטר אחד מיליליטר ולקחת בערך 200 microliters של אגרוז נמס. פיפטה התעוררה על מגלשת זכוכית נקייה ומיד מניחה שנייה על גבי הימנעות היווצרות של בועות כלשהן. השאר את השקופיות להתייבש בעדינות להסיר את החלק העליון זכוכית.התוצאה היא מגלשת זכוכית עם משטח אפילו agarose שבו nematodes יהיה ממוקם. לאחר הגדרת ההדמיה מוכנה לשימוש, עובד תחת מיקרוסקופ סטריאו, מניחים טיפה 10 microliter של תרכובת הרדמה על כרית אגרוז בעדינות להעביר חמישה עד 10 nematodes לתוכו. השתמש בקצה עפעף כדי להפריד את nematodes.שמור אותם קרוב זה לזה אך לא נוגע כדי לאפשר לוקליזציה קלה יותר של nematodes במהלך רכישת תמונה. בזהירות כיסוי nematodes עם כיסוי. תוך שעה לאחר ההרכבה, יש ליי לקחת מדידות.ודא nematodes הם חסרי תנועה לחלוטין. פתח את תוכנת הרכישה של FLIM. אתר את לחצן הכרטיסיה ולחץ על הפוך פלט לזמין.מקם את השקופית עם C.elegans רכוב על הבמה באמצעות עדשת הגדלה 10X במצב שידור, לוקליזציה את המיקום של nematodes על השקופית. הסר את השקופית, העבר את המטרה לעדשת הגדלה של פי 63 והחל את מדיום הטבילה הנדרש. מקם את השקופית על הבמה והפוך את הנומטודות לאוקליזציה.תתחיל לסרוק את הדגימה. בחר אזור מעניין והתמקד במישור ההקרנה המרבי שלו. בממשק של תוכנת FLIM, הצג בתצוגה מקדימה את מספר הפוטונים שזוהו.ערך ה- ADC צריך להיות בין 10 ל- 10 לערך הרביעי וערך אחד 10 עד החמישי. במידת הצורך, הסט את המיקוד במישור אחר או הגדל את כוח הלייזר כדי לאסוף יותר פוטונים. הקפד להימנע ערימת פוטון אבל לאסוף כמות מספקת של פוטונים כדי ליצור התאמה חיים טובה ומדידה.שורת התפריטים, בחר בכרטיסיה כדי להגדיר את פרמטרי הרכישה. בחר סינכרון סריקה כדי לאפשר זיהוי פוטון יחיד. הגדר את הרכישה לכמות קבועה של זמן או למספר קבוע של פוטונים.לחץ להתחיל ברכישה. לפתוח את התוכנה ולייבא קבצי נתונים FLIM באמצעות קובץ, לטעון נתוני FLIM. טען את כל הדגימות מתנאי אחד גם אם הושג בפגישות שונות וחוזר ביולוגי שונה.במידת הצורך, פלח כדי לאותת nematode עבור תמונת FLIM רבים באמצעות פילוח, מנהל פילוח. גררו את כלי החיתוך מסביב לאזור העניין עד שיסומן. לאחר השלמת הפעולה, לחץ על אישור. בחרו אזור קטן שבו מופיעה תמונה מבוססת עוצמה של C.elegans.עקומת הריקבון של אזור זה מופיעה בחלון הריקבון הגדול בצד ימין של הממשק. כדי לשער את אורך החיים, בכרטיסיה נתונים, הגדר ערך מינימלי משולב שרירותי בין 40 ל- 300 כדי לא לכלול פיקסלים עמומים מכדי להפיק התאמה טובה. בחר מספר זמן מינימלי ומקסימום זמן כדי להגביל את אות FLIM לערכים אלה.אל תשנה את הקבעה המוגדרת מראש סופר פוטון של אחד. הזן את שיעור החזרה במגה-הרץ של הלייזר המשמש במהלך הרכישה. הזן ערך מרבי של שער כדי לא לכלול את כל הפיקסלים הרוויים.בכרטיסיה אורך חיים, בחר התאמה כלליה לשימוש. אל תשנה פרמטר אחר מלבד מספר הבחירה המעריכית אם ידוע כי ריקבון הפלואורסצנטיות שנבחר הוא רב-מעריכי ומציג יותר מחיים שלמים. העלה את ה- IRF באמצעות תפריט IRF.כדי להעריך את הסטת ה- IRF, בחר IRF, היסוף העברת IRF. קבוצת ערכים מופיעה באופן אוטומטי בכרטיסיה IRF. לאחר שכך נוצר, אל תשנה פרמטרים אחרים של כרטיסיה זו.לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על התאם ערכת נתונים. מתאים וכתוצאה מכך מסומן בקו כחול צריך לחפוף עם כל האירועים. התאמה טובה מתקבלת כאשר כל האירועים מיושרים לאורך מתאים.לחץ על כרטיסיית הפרמטרים הממוקמת בתוך התפריטים השמאליים העליונים של ממשק התוכנה ובחר ממוצע סטטיסטי משוקלל ובדוק שהערך הריבועי של הצ'י קרוב ככל האפשר לערך. ערך החיים של התמונה שנבחרה מתגלה כך כערך טאו אחד. יצא כל מידע מעניין באמצעות קובץ, לייצא תמונות בעוצמה, להתאים את טבלת התוצאות, תמונות, היסטוגרמות.מפות מייצגות של C.elegans המביעים שרירי Q40 RFP ביום הרביעי או יום שמונה של החיים מוצגים כאן. מתיחת Q הארוכה יותר של ה- IQ85 הייתה נוטה יותר לצבירה והפגינו שינוי חיים פלואורסצנטי בהיסטוגרמה כבר ביום הרביעי לחיים. למעשה, ביום הרביעי, היווצרות foci נצפתה עבור IQ85 בעוד עדיין נעדר IQ44.עם ההזדקנות, עם זאת, IQ44 הפגין גם היווצרות מוקדי ובכך חיים פלואורסצנטיים מופחתים. לבסוף, היווצרות foci לא זוהה ולא ירד אורך החיים פלואורסצנטי בזן NQ40CFP. עבור זן זה, היו רק שינויים עדינים ולא משמעותיים לכל החיים הפלואורסצנטיים הממוצעים עם ההזדקנות.לאחר המודל nematode הוקמה, כמות הפוטון שנאסף הוא בעל חשיבות עליונה כדי להשיג התאמה טובה לכל החיים. השיטה יכולה להיות סיוב עוד יותר עם טכניקות שונות כגון העברת אנרגיה תהודה פורסטר, FRET, התאוששות פלואורסצנטיות לאחר photobleaching, FRAP, או מדידה. כל ההתאמות הללו מספקות מידע נוסף על תכונות מחקרי החלבון וצורתו המצטברת.בתחום צבירת החלבון והונוסטזיס החלבון, הטכניקה אפשרה לחקור כל הפרעה המוטלת על המערכת, התפלגות מיני חלבון שונים, ואת הסחר ובהחלט את ההבדל והמשמעות של שברי חלבון מסיסים ובלתי מסיסים בתוך האורגניזם החי. נתרן אזיד הרדמה הוא רעיל ויש לטפל בו עם כפפות ומ המשקפיים ומדולל מתחת למכסה המנוע של האדים. מכיוון שהטכניקה מבוססת מיקרוסקופיה, חשוב לעקוב אחר כל האזהרות הקשורות לעבודה עם לייזרים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

הדמיה עמילואיד ברקמות מוכתם Oligothiophenes מצומדת זורח על ידי היפרספקטרליות קונאפוקלית מיקרוסקופ והדמיה שלמים קרינה פלואורסצנטית

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

אפיון מבניים של מנן פוליסכרידים דופן התא בצמחים באמצעות קצב

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

גידול גבישים חלבון עם ממדים ברורים באמצעות כלים אוטומטיים התגבשות בשילוב עם בחיי עיר פיזור אור דינאמי

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

השימוש בג'ל מימדי Agarose דטרגנט למחצה denaturing שני לאשר גודל הטרוגניות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

אפיון מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית מהירה של יחיד חוץ-תאית שלפוחית בדם אנושי עם ניתוח מעקב ננו-חלקיק

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

מחייב סומו ישויות (SUBEs) ככלים עבור העשרה, בידוד, זיהוי, ואפיון של פרוטאום סומו בסרטן הכבד

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...