Name: characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging
Uploaded: 2020-03-27T15:00:00
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सीजीसी द्वारा प्रदान की जाने वाली मांसपेशी-Q40-mRFP तनाव, जिसे एनआईएच कार्यालय ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम (P40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। न्यूरोनल-क्यू40-सीएफपी मोरिमोटो लैब का एक तरह का तोहफा था । हम डीएफजी (जेके को केआई-1988/5-1, न्यूरोक्योर पीएचडी फेलोशिप को एक्सीलेंस क्लस्टर ऑफ एक्सीलेंस द्वारा एमएलपी, एम्बो (एमएलपी को शॉर्ट टर्म फेलोशिप) और फंडिंग के लिए बायोलॉजिस्ट्स (सीजी और एमएलपी को यात्रा अनुदान) की कंपनी स्वीकार करते हैं । हम वाईएफपी निर्माण की छवि को सेटअप प्रदान करने के लिए मैक्स डेलब्रुक सेंटर फॉर मॉलिक्यूलर मेडिसिन, बर्लिन में उन्नत लाइट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सुविधा को भी स्वीकार करते हैं।

1. सी एलिगेंस का सिंक्रोनाइजेशन
<ol><li>सिंक्रोनाइज सी एलिगेंस या तो क्षारीय हाइपोक्लोराइट समाधान उपचार के माध्यम से या 20 डिग्री सेल्सियस8पर 4 घंटे के लिए सरल अंडे बिछाने के माध्यम से।</li>
	<li>म?...

<ol>
	<li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease.">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li><li>Kikis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+struggle+by+Caenorhabditis+elegans+to+maintain+proteostasis+during+aging+and+disease.">The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease.</a> Biology Direct. 11, 58 (2016).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+-+techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).</li><li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+measurements+and+biological+imaging.">Fluorescence lifetime measurements and biological imaging.</a> Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li><li>Kaminski Schierle, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET+sensor+for+non-invasive+imaging+of+amyloid+formation+in+vivo.">A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo.</a> ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).</li><li>Sandhof, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+INS-IGF1+signaling+protects+against+non-cell+autonomous+vesicle+rupture+caused+by+SNCA+spreading.">Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading.</a> Autophagy. , 1-22 (2019).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).</li><li>Becker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Lifetime+Imaging+by+Time-Correlated+Single-Photon+Counting.">Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting.</a> Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).</li><li>Warren, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+global+fitting+of+large+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+datasets.">Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets.</a> PloS one. 8 (8), e70687 (2013).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+of+proteostasis+represents+an+early+molecular+event+in+Caenorhabditis+elegans+aging.">Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Specific+Intrinsic+Fluorescence+of+Protein+Amyloids+Used+to+Study+their+Kinetics+of+Aggregation.">Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation.</a> Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).</li><li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Reveals+the+Aggregation+Processes+of+&#945;-Synuclein+and+Polyglutamine+in+Aging+Caenorhabditis+elegans.">Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of &#945;-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).</li><li>Kelbauskas, L., Dietel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Aggregated+Photosensitizers+by+Tumor+Cells:+Subcellular+Time-resolved+Fluorescence+Spectroscopy+on+Derivatives+of+Pyropheophorbide-a+Ethers+and+Chlorin+e6+under+Femtosecond+One-+and+Two-photon+Excitation.">Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).</li><li>Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+and+FCS+detection+in+laser-scanning+microscopes:+Increased+efficiency+by+GaAsP+hybrid+detectors.">FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors.</a> Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).</li><li>Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+fluorescence+microscopy.">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).</li></ol>

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सी एलिगेंस मॉडल सिस्टम में एकत्रित प्रजातियों की पहचान करने के लिए माइक्रोस्कोपी आधारित तकनीक का वर्णन करता है । FLIM सही दोनों एकत्रित और घुलनशील प्रजातियों की उपस्थिति की ...

प्रोटीन एकत्रीकरण उम्र बढ़ने और बीमारी दोनों में होता है। बड़े एमिलॉयड या असंगत समावेशन के गठन और जमाव का कारण बनने वाले रास्ते का पालन करना मुश्किल है और उनके गतिज इसी तरह को सुलझाना चुनौतीपूर्ण हैं। प्रोटीन आनुवंशिक रोगों के मामले में, उनके कोडिंग दृश्यों के भीतर आंतरिक उत्परिवर्तन के कारण गलत गुना कर सकते हैं। प्रोटीन भी गलत गुना क्योंकि प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क (पीएन) जो उन्हें घुलनशील और ठीक से जोड़ता रहता है, बिगड़ा हुआ है, जैसा कि उम्र बढ़ने के दौरान होता है। पीएन में आणविक चपरासी और क्षरण मशीनें शामिल हैं और बायोजेनेसिस, तह, तस्करी और प्रोटीन1के क्षरण के लिए जिम्मेदार है।
सी एलिगेंस अपनी छोटी उम्र, आइसोजेनिक प्रकृति और आनुवंशिक हेरफेर में आसानी के कारण उम्र बढ़ने और बीमारी का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में उभरा है । कई सी एलिगेंस ट्रांसजेनिक उपभेदों कि कमजोर ऊतकों में मानव रोग के कारण प्रोटीन व्यक्त बनाया गया है । महत्वपूर्ण बात यह है कि एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन वाले कई उपभेद एमिलॉयड विकारों की पहचान, बड़े समावेशन के गठन को फिर से दोहराते हैं। सी एलिगेंस के पारदर्शी शरीर के लिए धन्यवाद, इन समुचुओं को वीवो, गैर-आक्रामक और गैर-विनाशकारी रूप से2में कल्पना की जा सकती है। फ्लोरोफोर के साथ संलयन में ब्याज (पीओआई) का कोई प्रोटीन उत्पन्न करना इसके स्थानों, तस्करी, इंटरैक्शन नेटवर्क और सामान्य भाग्य की जांच करने की अनुमति देता है।
हम फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) के माध्यम से रहने वाले और उम्र बढ़ने सी एलिगनएस में रोग पैदा करने वाले प्रोटीन के एकत्रीकरण की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। FLIM एक शक्तिशाली तकनीक है जो अपने उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के बजाय फ्लोरोफोर के जीवनकाल पर आधारित है। जीवन भर (ताऊ, α) औसत एक फोटॉन के लिए आवश्यक समय के रूप में परिभाषित किया गया है अपने उत्तेजित राज्य से अपनी जमीन राज्य को वापस क्षय । दिए गए अणु के जीवनकाल की गणना समय-सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती (टीसीएसपीसी) की समय-डोमेन तकनीक के साथ की जाती है। टीसीएसपीसी-एफआईआईएल में, फ्लोरोसेंट क्षय समारोह को फ्लोरोफोर को कम, उच्च आवृत्ति लेजर दालों के साथ रोमांचक करके प्राप्त किया जाता है और दालों के संबंध में एक डिटेक्टर के लिए उत्सर्जित फोटॉन के आगमन के समय को मापने के लिए प्राप्त किया जाता है। एक नमूने को स्कैन करते समय, प्रत्येक पिक्सेल के लिए एक त्रि-आयामी डेटा सरणी बनाई जाती है: सरणी में उनके एक्स, वाई स्थानिक निर्देशांक और उनके लौकिक क्षय वक्र में फोटॉनों के वितरण के बारे में जानकारी शामिल है। एक दिया नमूना इसलिए प्रोटीन की संरचना, बाध्यकारी, और पर्यावरण3,,4के बारे में जानकारी खुलासा जीवन काल का एक नक्शा बन जाता है । प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन में एक आंतरिक और ठीक परिभाषित जीवनकाल होता है, आमतौर पर कुछ नैनोसेकंड (एनएस) का होता है, जो इसके फिजियोकेमिकल गुणों पर निर्भर होता है। महत्वपूर्ण बात, फ्लोरोफोर का जीवनकाल इसकी एकाग्रता, फ्लोरोसेंट तीव्रता और इमेजिंग पद्धति से स्वतंत्र है। हालांकि, एक जैविक प्रणाली के भीतर, यह पीएच, तापमान, आयन सांद्रता, ऑक्सीजन संतृप्ति, और उसके बातचीत भागीदारों जैसे पर्यावरणीय कारकों से प्रभावित हो सकता है। जीवन काल भी आंतरिक संरचनात्मक परिवर्तन और अभिविन्यास के प्रति संवेदनशील हैं। पीओआई के लिए फ्लोरोफोर को फ्यूज करने के परिणामस्वरूप इसके जीवनकाल में बदलाव होता है और इसके परिणामस्वरूप फ्यूजकिए गए प्रोटीन के व्यवहार के बारे में जानकारी होती है। जब एक फ्लोरोफोर को कसकर बंधे वातावरण में घिरा या समझाया जाता है, जैसे कि एमिलॉयड संरचना की एंटीसमान बीटा शीट, यह ऊर्जा को गैर-रेडिएटिव रूप से खो देता है, एक प्रक्रिया जिसे शमन5के रूप में जाना जाता है। फ्लोरोफोर की शमन के परिणामस्वरूप इसके स्पष्ट जीवनकाल का एक छोटा होता है। जब घुलनशील, एक प्रोटीन के जीवनकाल अपने मूल, उच्च मूल्य के करीब रहना होगा । इसके विपरीत, जब एक प्रोटीन कुल शुरू होता है, तो उसका जीवनकाल अनिवार्य रूप से कम मूल्य6,,7में बदल जाएगा। इसलिए, जीवित सी एलिगेंसमें विभिन्न उम्र में किसी भी एमिलॉयड बनाने वाले प्रोटीन की एकत्रीकरण प्रवृत्ति की निगरानी करना संभव हो जाता है।
यहां हम एक संलयन प्रोटीन के एकत्रीकरण का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसमें विभिन्न पॉलीग्लूटामाइन (सीएजी, क्यू) फैला (Q40, Q44 और Q85) शामिल हैं। हम वर्णन करते हैं कि तकनीक को विभिन्न फ्लोरोफोरस पर समान रूप से कैसे लागू किया जा सकता है, जैसे सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी), येलो फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) और मोनोमेरिक रेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एमआरएफपी); और सी एलिगन्सके सभी ऊतकों में, न्यूरॉन्स, मांसपेशियों और आंत सहित। इसके अलावा, प्रोटेओस्टेसिस के संदर्भ में, FLIM आणविक चपरासी की कमी पर परिवर्तन ों का निरीक्षण करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है। आरएनए हस्तक्षेप के माध्यम से प्रमुख आणविक चपरासियों में से एक, हीट शॉक प्रोटीन 1(एचएसपी-1)को दस्तक देना प्रोटीन के समय से पहले गलत गुना पैदा करता है। उम्र बढ़ने, बीमारी, या कमी वाले चैपरोन के परिणामस्वरूप एकत्रीकरण भार में वृद्धि को फ्लोअरसेंस जीवनकाल में कमी के रूप में मापा जाता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ahringer Library hsp-1 siRNA</td>
			<td>Source BioScience UK Limited</td>
			<td>F26D10.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.3</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H DCS-120 SPC-150</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H SPC830-SPC Image</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ44-YFP</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OG412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ85-YFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans mQ40-RFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans nQ40-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>2316.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoQuant PicoHarp300</td>
			<td>PicoQuant GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K305.1</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Agarose</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510-Meta NLO</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging

एमिलॉयड फाइब्रिल्स हंटिंगटन, पार्किंसंस या अल्जाइमर रोग जैसे कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों से जुड़े होते हैं। ये एमिलॉयड फाइब्रिल्स एंडोजेनस मेटास्टेबल प्रोटीन के साथ-साथ प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क (पीएन) के घटकों को अलग कर सकते हैं और इस तरह कोशिका में प्रोटीन गलत तह को बढ़ा सकते हैं। एक जानवर के भीतर एमिलॉयड प्रोटीन की एकत्रीकरण प्रक्रिया का आकलन करने के लिए सीमित संख्या में उपकरण उपलब्ध हैं। हम फ्लोरेसेंस लाइफटाइम माइक्रोस्कोपी (FLIM) के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो विशिष्ट कोशिकाओं में एमिलॉयड फाइब्रिलाइजेशन की निगरानी के साथ-साथ न्यूरॉन्स जैसी विशिष्ट कोशिकाओं में एमिलॉयड फाइब्रिलाइजेशन की मात्रा की अनुमति देता है, एक गैर-आक्रामक तरीके से और उम्र बढ़ने की प्रगति के साथ और क्षोभ पर पीएन। FLIM फ्लोरोफोर के अभिव्यक्ति के स्तर से स्वतंत्र है और किसी भी आगे धुंधला या ब्लीचिंग के बिना एकत्रीकरण प्रक्रिया का विश्लेषण सक्षम बनाता है । फ्लोरोफोरस को तब बुझाया जाता है जब वे एमिलॉयड संरचनाओं के करीब होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरेसेंस जीवनकाल में कमी आती है। शमन सीधे एमिलॉयड प्रोटीन के एकत्रीकरण के साथ संबंधित है। FLIM एक बहुमुखी तकनीक है जिसे गैर-आक्रामक तरीके से वीवो में विभिन्न एमिलॉयड प्रोटीन, पर्यावरण उत्तेजनाओं या आनुवंशिक पृष्ठभूमि की फाइब्रिलाइजेशन प्रक्रिया की तुलना करने के लिए लागू किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे सही सी elegansमें एकत्रित प्रजातियों के गठन की निगरानी के लिए, दोनों अपनी प्राकृतिक उंर बढ़ने के दौरान और जब तनाव के अधीन । हमने ट्रांसजेनिक नेमाटोड के चार अ?...

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Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग पर नज़र रखता है, मात्रा और रहने में प्रोटीन की एकत्रीकरण प्रवृत्तियों को अलग करता है, उंर बढ़ने, और सी elegans रोग मॉडल पर बल दिया ।

फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग का उपयोग करके एजिंग सी एलिगेंस में एमीलॉयड संरचनाओं का लक्षण वर्णन

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

विधि हमें घुलनशील और यहां तक कि संचित समकक्षों से एकीकृत एमिलॉयड प्रोटीन संरचनाओं को स्पष्ट रूप से अलग करने की अनुमति देती है। तकनीक वीवो में कम या कोई विषाक्त दुष्प्रभाव के साथ एक गैर-भेदभावपूर्ण तरीके से किया जाता है। चूंकि यह फ्लोरोफोर के फ्लोरोसेंट गुणों पर निर्भर करता है, इसलिए यह समय के साथ अत्यधिक मजबूत और प्रजनन योग्य है।FLIM कैंसर निदान के क्षेत्र में उपयोग किया गया है। हालांकि, हम इसे प्रोटीन एकत्रीकरण के बुनियादी तंत्रों का अध्ययन करने के लिए नियोजित करते हैं जो वास्तव में न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लिए प्रासंगिक हैं। प्रोटीन एकत्रीकरण के क्षेत्र में कार्यप्रणाली का उपयोग किया जा सकता है।जब तक रोग से जुड़े प्रोटीन को फ्लोरोसेंट जांच के साथ टैग किया जाता है, तब तक इसे समय के साथ ट्रैक और मॉनिटर किया जा सकता है। यौगिकों और रणनीतियों है कि या तो बढ़ावा देने या एकत्रीकरण को रोकने के सफलतापूर्वक अध्ययन किया जा सकता है । कोई भी जैविक प्रणाली जो प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना करने की अनुमति देती है, वीवो या पूर्व वीवो में फ्लिम के लिए उपयुक्त है, उदाहरण के लिए सेल संस्कृति में, उतारना चाहते हैं या रिस रहा नमूनों में और किसी भी आवश्यक माध्यम में।प्रयोगात्मक डेटा प्राप्त करने से पहले सूत्रकृमि के भीतर अपने चयनित फ्लोरोफोर के गुणों का परीक्षण करना सुनिश्चित करें और यह परीक्षण करें कि माप प्राप्त करने से पहले सेटअप पूरी तरह से कार्यात्मक है। एनजीएम प्लेटों पर 20 डिग्री सेल्सियस पर नेमाटोड शुरू करने, बढ़ने और बनाए रखने के लिए। उम्र युवा वयस्कों और पुराने वयस्कों के रूप में जीवन के आठ दिन के रूप में जीवन के चार दिन तक सूत्रकृमि ।इमेजिंग के दिन, इमेजिंग स्लाइड तैयार करके शुरू करें। मात्रा से 3% वजन की एकाग्रता पर agarose और डबल आसुत पानी रखें। इसे पिघलने के लिए माइक्रोवेव में स्थानांतरित करें और फिर इसे थोड़ा ठंडा होने दें।एक मिलीलीटर पिपेट टिप की नोक काटें और पिघले हुए एगर उठे के लगभग 200 माइक्रोलीटर लें। एक साफ ग्लास स्लाइड पर agarosette और तुरंत किसी भी बुलबुले के गठन से बचने के शीर्ष पर एक दूसरे को जगह है । स्लाइड्स को सूखने के लिए छोड़ दें और धीरे-धीरे ऊपर की ग्लास स्लाइड को हटा दें।परिणाम एक ग्लास स्लाइड है जिसमें एक भी एगर उठी सतह है जहां सूत्रकृमि तैनात किए जाएंगे। एक बार इमेजिंग सेटअप का उपयोग करने के लिए तैयार है, एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत काम कर रहे हैं, एक agarose पैड पर संवेदनाहारी यौगिक की एक 10 माइक्रोलीटर ड्रॉप जगह है और धीरे से इसे में पांच से 10 सूत्रकृमि हस्तांतरण । नेमाटोड को अलग करने के लिए बरौनी टिप का इस्तेमाल करें।उन्हें एक साथ बंद रखें, लेकिन छवि अधिग्रहण के दौरान सूत्रकृमि के आसान स्थानीयकरण के लिए अनुमति देने के लिए नहीं छूते हैं। ध्यान से एक कवरस्लिप के साथ सूत्रकृमि ओवरले। बढ़ते के बाद एक घंटे के भीतर, माप लें।सुनिश्चित करें कि सूत्रकृमि पूरी तरह से स्थिर हैं। FLIM अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें। टैब बटन का पता लगाएं और आउटपुट सक्षम दबाएं।स्लाइड को मंच पर घुड़सवार C.elegans के साथ रखें और ट्रांसमिशन मोड में 10X आवर्धन लेंस का उपयोग करके, स्लाइड पर सूत्रकृमि की स्थिति को स्थानीयकृत करें। स्लाइड निकालें, एक 63X आवर्धन लेंस के लिए उद्देश्य स्विच, और आवश्यक विसर्जन माध्यम लागू होते हैं । स्लाइड को स्टेज पर रखें और नेमाटोड को लोकलाइज करें।सैंपल की स्कैनिंग शुरू करें। ब्याज के एक क्षेत्र का चयन करें और अपने अधिकतम प्रक्षेपण विमान पर ध्यान केंद्रित। FLIM सॉफ्टवेयर के इंटरफेस पर, पता चला फोटॉन की संख्या का पूर्वावलोकन करें।एडीसी की वैल्यू एक गुना 10 से चौथी और एक गुना 10 से पांचवीं के बीच होनी चाहिए। यदि आवश्यक हो, तो ध्यान को एक अलग विमान पर स्थानांतरित करें या अधिक फोटॉन इकट्ठा करने के लिए लेजर शक्ति बढ़ाएं। सुनिश्चित करें कि आप फोटॉन पाइअप से बचें लेकिन एक अच्छा जीवन भर फिट और माप बनाने के लिए पर्याप्त मात्रा में फोटॉन एकत्र करें।मेनू बार में, अधिग्रहण मापदंडों को निर्धारित करने के लिए टैब का चयन करें। सिंगल फोटॉन डिटेक्शन की अनुमति देने के लिए स्कैन सिंक का चयन करें। अधिग्रहण को एक निश्चित समय या एक निश्चित संख्या में फोटॉन सेट करें।प्रेस अधिग्रहण शुरू करने के लिए शुरू करते हैं । सॉफ्टवेयर खोलें और फाइल के माध्यम से FLIM डेटा फ़ाइलों का आयात करें, FLIM डेटा लोड करें। विभिन्न सत्रों में और विभिन्न जैविक दोहराता से प्राप्त होने पर भी सभी नमूनों को एक शर्त से लोड करें।यदि आवश्यक हो, तो सेगमेंटेशन, सेगमेंटेशन मैनेजर के माध्यम से कई आईएफलिम चित्र के लिए सूत्रकृमि को संकेत देने के लिए सेगमेंट करें। जब तक इसे हाइलाइट नहीं किया जाता है तब तक ब्याज के क्षेत्र के आसपास फसल उपकरण खींचें। एक बार पूरा हो जाने के बाद, ठीक दबा दें। एक छोटे से क्षेत्र का चयन करें जहां सी एलिगेंस की तीव्रता-आधारित छवि दिखाई देती है।उस क्षेत्र का क्षय वक्र इंटरफ़ेस के दाईं ओर बड़ी क्षय खिड़की में दिखाई देता है। जीवनकाल को एक्सट्रपलेशन करने के लिए, डेटा टैब पर, किसी भी पिक्सेल को बाहर करने के लिए 40 से 300 के बीच एक मनमाना एकीकृत न्यूनतम मूल्य निर्धारित करें जो एक अच्छा फिट उत्पादन करने के लिए बहुत मंद हैं। इन मूल्यों के लिए FLIM संकेत को सीमित करने के लिए एक समय न्यूनतम और एक समय अधिकतम संख्या का चयन करें।एक के पूर्व निर्धारित मायने रखता है फोटॉन मत बदलें। अधिग्रहण के दौरान उपयोग किए गए लेजर के मेगाहर्ट्ज में पुनरावृत्ति दर को इनपुट करें। सभी संतृप्त पिक्सल को बाहर करने के लिए एक गेट अधिकतम मूल्य इनपुट करें।लाइफटाइम टैब पर, उपयोग की जाने वाली वैश्विक फिटिंग का चयन करें। यदि यह ज्ञात हो कि चुना गया फ्लोरेसेंस क्षय बहु-घातीय है और एक ही जीवनकाल से अधिक प्रदर्शित करता है तो घातीय चयन की संख्या को छोड़कर किसी अन्य पैरामीटर को न बदलें। आईआरएफ मेनू के माध्यम से आईआरएफ अपलोड करें।आईआरएफ शिफ्ट का अनुमान लगाने के लिए आईआरएफ का चयन करें, आईआरएफ शिफ्ट का अनुमान लगाएं। मूल्यों का एक सेट स्वचालित रूप से आईआरएफ टैब पर दिखाई देता है। एक बार यह स्थापित हो जाने के बाद, इस टैब के किसी भी अन्य मापदंडों को न बदलें।एक बार सभी पैरामीटर सेट हो जाने के बाद, फिट डेटा सेट दबाएं। एक नीली रेखा में हाइलाइट किए गए परिणामी फिट को सभी घटनाओं के साथ ओवरलैप करना चाहिए। एक अच्छा फिट प्राप्त किया जाता है जब सभी घटनाओं फिट के साथ गठबंधन कर रहे हैं ।सॉफ्टवेयर के इंटरफ़ेस के शीर्ष दाएं मेनू के भीतर स्थित पैरामीटर टैब पर क्लिक करें और सांख्यिकी, भारित मतलब का चयन करें, और देखें कि ची स्क्वायर मूल्य जितना संभव हो उतना करीब है। चयनित छवि का आजीवन मूल्य इस प्रकार ताऊ एक के रूप में पता चला है। फ़ाइल, निर्यात तीव्रता छवियों, फिट परिणाम तालिका, छवियों, हिस्टोग्राम के माध्यम से ब्याज की किसी भी जानकारी का निर्यात करें।सी. एलिगेंस के प्रतिनिधि नक्शे चार या जीवन के आठ दिन पर पेशी Q40 RFP व्यक्त यहां दिखाया गया है । IQ85 के लंबे क्यू खिंचाव एकत्रीकरण के लिए अधिक प्रवण था और जीवन के चार दिन में पहले से ही हिस्टोग्राम में एक फ्लोरेसेंस लाइफटाइम बदलाव का प्रदर्शन किया । वास्तव में, चार दिन में, foci गठन IQ85 के लिए मनाया गया था, जबकि अभी भी IQ44 में अनुपस्थित ।उम्र बढ़ने पर, हालांकि, IQ44 ने फोसी गठन का भी प्रदर्शन किया और इस प्रकार एक कम फ्लोरेसेंस जीवनकाल। अंत में, फोसी गठन का पता नहीं चला और न ही NQ40CFP तनाव में फ्लोरेसेंस लाइफटाइम कम हो गया था । इस तनाव के लिए, उम्र बढ़ने पर मतलब फ्लोरेसेंस लाइफटाइम में केवल सूक्ष्म गैर-महत्वपूर्ण परिवर्तन थे।एक बार सूत्रकृमि मॉडल की स्थापना हो जाने के बाद, एकत्र किए गए फोटॉन की मात्रा एक अच्छा जीवनभर फिट प्राप्त करने के लिए सर्वोपरि है। इस विधि को विभिन्न तकनीकों जैसे कि फोर्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण, एफआरटी, फोटोब्लेचिंग, एफआरएपी या माप के बाद फ्लोरेसेंस रिकवरी के साथ जोड़ा जा सकता है। ये सभी अनुकूलन प्रोटीन अध्ययन और इसके एकत्रित रूप के गुणों के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करते हैं।प्रोटीन एकत्रीकरण और प्रोटीन हो्योस्टेसिस के क्षेत्र के भीतर, तकनीक प्रणाली पर लगाए गए किसी भी क्षोभ की जांच करने की अनुमति दी, विभिन्न प्रोटीन प्रजातियों के वितरण, और तस्करी और सामान्य रूप से जीवित जीव के भीतर घुलनशील और अघुलनशील प्रोटीन अंशों का अंतर और महत्व। संवेदनाहारी सोडियम एजाइड विषाक्त है और इसे दस्ताने और चश्मे के साथ संभाला जाना चाहिए और एक धुएं हुड के नीचे पतला किया जाना चाहिए। क्योंकि तकनीक माइक्रोस्कोपी आधारित है, इसलिए लेजर के साथ काम करने से संबंधित सभी चेतावनियों का पालन करना महत्वपूर्ण है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

इमेजिंग Amyloid ऊतक Hyperspectral फोकल माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग द्वारा Luminescent संयुग्मित Oligothiophenes के साथ दाग

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

पौधों में Mannan कोशिका दीवार Polysaccharides के संरचनात्मक लक्षण का उपयोग कर गति

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

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Caenorhabditis एलिगेंस में उच्च प्रवाह रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए एक सरल तरीका

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

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अलग आयामों के साथ बढ़ती प्रोटीन क्रिस्टल का उपयोग कर स्वचालित क्रिस्टलीकरण में सीटू गतिशील प्रकाश बिखरने के साथ युग्मित

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

दो आयामी अर्द्ध denaturing डिटर्जेंट Agarose जेल ट्रो का उपयोग Amyloid या Amyloid फाइबर की तरह आकार विविधता की पुष्टि करने के लिए

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

अंशांकन-मुक्त इन विट्रो ठहराव में प्रोटीन होमो-oligomerization का उपयोग कर वाणिज्यिक इंस्ट्रूमेंटेशन और नि: शुल्क, खुला स्रोत चमक विश्लेषण सॉफ्टवेयर

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Nanoparticle-ट्रैकिंग विश्लेषण के साथ मानव रक्त में एकल Extracellular बुलबुले के तेजी से प्रतिदीप्ति आधारित लक्षण वर्णन

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

सी elegans शरीर की दीवार की मांसपेशियों में Vivo कैल्शियम इमेजिंग में

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

एमीलॉयड फाइब्रिल्स द्वारा मस्तिष्क माइटोकोंड्रिया के साथ और झिल्ली permeabilization के साथ बातचीत

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

लीवर कैंसर में सूमो प्रोटेओम के संवर्धन, अलगाव, पहचान, और विशेषता के लिए उपकरण के रूप में SUMO-Binding संस्थाओं (SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...