Name: characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging
Uploaded: 2020-03-27T15:00:00
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CGC에 의해 제공되는 근육 Q40-mRFP 긴장, 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무실에 의해 투자되는 (P40 OD010440). 뉴런-Q40-CFP는 모리모토 연구소의 일종의 선물이었습니다. 우리는 DFG를 인정 (JK에 KI-1988/5-1, MLP에 우수성의 NeuroCure 클러스터에 의해 NeuroCure 박사 펠로우십), EMBO (MLP에 단기 펠로우십) 및 생물학자의 회사 (CG와 MLP에 여행 보조금) 자금. 우리는 또한 YFP 구조물을 이미지화하기 위한 설치를 제공하기 위한 베를린 분자 의학을 위한 막스 Delbrück 센터에 있는 고급 빛 현미경 화상 진찰 시설을 인정합니다.

1. C. 예쁜꼬마선충의 동기화
<ol><li>C. 예쁜꼬마선충을 알칼리성 하이포염소산염 용액 처리를 통해 또는 20 °C8에서4 시간 동안 간단한 계란 누워를 통해 동기화하십시오.</li>
	<li>표준 절차에 따라 OP50 대장균으로 시드 된 선충 성장 배지 (NGM) 플레이트에서 20 °C에서 선충을 성장시키고유지합니다. 선충을 원하는 발달 단계 또는 날까지 나이.<...

<ol>
	<li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease.">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li><li>Kikis, E. 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Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+measurements+and+biological+imaging.">Fluorescence lifetime measurements and biological imaging.</a> Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li><li>Kaminski Schierle, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET+sensor+for+non-invasive+imaging+of+amyloid+formation+in+vivo.">A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo.</a> ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).</li><li>Sandhof, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+INS-IGF1+signaling+protects+against+non-cell+autonomous+vesicle+rupture+caused+by+SNCA+spreading.">Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading.</a> Autophagy. , 1-22 (2019).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).</li><li>Becker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Lifetime+Imaging+by+Time-Correlated+Single-Photon+Counting.">Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting.</a> Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).</li><li>Warren, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+global+fitting+of+large+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+datasets.">Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets.</a> PloS one. 8 (8), e70687 (2013).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+of+proteostasis+represents+an+early+molecular+event+in+Caenorhabditis+elegans+aging.">Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Specific+Intrinsic+Fluorescence+of+Protein+Amyloids+Used+to+Study+their+Kinetics+of+Aggregation.">Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation.</a> Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).</li><li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Reveals+the+Aggregation+Processes+of+&#945;-Synuclein+and+Polyglutamine+in+Aging+Caenorhabditis+elegans.">Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of &#945;-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).</li><li>Kelbauskas, L., Dietel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Aggregated+Photosensitizers+by+Tumor+Cells:+Subcellular+Time-resolved+Fluorescence+Spectroscopy+on+Derivatives+of+Pyropheophorbide-a+Ethers+and+Chlorin+e6+under+Femtosecond+One-+and+Two-photon+Excitation.">Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).</li><li>Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+and+FCS+detection+in+laser-scanning+microscopes:+Increased+efficiency+by+GaAsP+hybrid+detectors.">FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors.</a> Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).</li><li>Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+fluorescence+microscopy.">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).</li></ol>

여기에 제시된 프로토콜은 C. elegans 모형 시스템에서 집계된 종을 확인하기 위하여 현미경 검사법 기지를 둔 기술을 기술합니다. FLIM은 형광 수명 부패의 측정을 통해 형광에 융합된 응집및 수용성 종의 존재를 정확하게 특성화할 수 있습니다. 융합 단백질이 집계되기 시작하면 기록된 평균 수명은 더 높은 값에서 더 낮은값(16)으로이동합니다. 응집의 성향은 다음 수명에 ?...

단백질 응집은 노화와 질병 모두에서 발생합니다. 큰 아밀로이드 또는 비정질 개재물의 형성 그리고 증착으로 이끌어 내는 통로는 따르기 어렵고 그들의 역학은 해명하기 위하여 유사하게 도전적입니다. 단백질은 유전 질병의 경우와 같이 코딩 순서 내의 본질적인 돌연변이 때문에 잘못 접을 수 있습니다. 단백질은 또한 그(것)들을 용해하고 제대로 접히지 않는 proteostasis 네트워크 (PN) 노후화 도중 일어나는 것과 같이 손상하기 때문에 잘못 접습니다. PN은 분자 샤페론 및 분해 기계를 포함하고 생물 발생, 접이식, 인신 매매 및 단백질의 분해에 대한 책임이1.
C. 예쁜꼬마선충은 수명이 짧고, 등소성 성질이 나고, 유전적 조작의 용이성으로 인해 노화와 질병을 연구하는 모델로 부상했습니다. 몇몇 C. 예쁜꼬마선충은 취약한 조직에서 인간 질병을 일으키는 단백질을 발현하는 형질전환 균주가 만들어졌습니다. 중요한 것은, 응집되기 쉬운 단백질을 포함하는 많은 균주는 아밀로이드 장애, 큰 개재물의 형성의 특징을 되풀이한다. C. elegans의 투명한 바디 덕분에, 이 응집체는 비침범성 및 비파괴적으로 생체 내에서 가시화될 수 있습니다2. 플루오로포어와 융합하여 관심 있는 단백질(POI)을 생성하면 그 위치, 인신매매, 상호 작용 네트워크 및 일반적인 운명을 조사할 수 있습니다.
우리는 형광 일생 화상 진찰 현미경 검사법 (FLIM)를 통해 생활과 노화 C. elegans에 있는 질병 일으키는 단백질의 집합을 감시하는 프로토콜을 제시합니다. FLIM은 방출 스펙트럼이 아닌 불소의 수명을 기반으로 하는 강력한 기술입니다. 수명(tau, θ)은 광자에서 흥분 상태에서 다시 지면 상태로 붕괴하는 데 필요한 평균 시간으로 정의됩니다. 주어진 분자의 수명은 시간 상관 된 단일 광자 계수 (TCSPC)의 시간 도메인 기술로 계산됩니다. TCSPC-FLIM에서 형광 부패 기능은 짧은 고주파 레이저 펄스로 형광을 흥분시키고 펄스와 관련하여 검출기에 방출된 광자의 도착 시간을 측정하여 얻을 수 있습니다. 샘플을 스캔할 때 각 픽셀에 대해 3차원 데이터 배열이 만들어집니다. x,y 따라서 주어진 샘플은 단백질의 구조, 결합 및 환경3,,4에대한 정보를 공개하는 수명의 지도가 됩니다. 각 형광 단백질은 생리화학적 특성에 따라 본질적으로 정확하게 정의된 수명을 가지고 있으며, 일반적으로 몇 나노초(ns)입니다. 중요한 것은 형광공의 수명은 농도, 형광 강도 및 이미징 방법론과 독립적입니다. 그러나, 생물학적 시스템 내에서, pH, 온도, 이온 농도, 산소 포화도 및 그 상호 작용 파트너와 같은 환경 요인에 의해 영향을 받을 수 있다. 수명은 내부 구조 변경 및 방향에도 민감합니다. POI에 형광포를 융합하면 수명이 변경되고 결과적으로 융합 된 단백질의 거동에 대한 정보가 생성됩니다. 불소가 아밀로이드 구조의 반병렬 베타 시트와 같이 단단히 결합된 환경에서 포위되거나 캡슐화되면, 비방사성으로 에너지를 잃게 되며, 담금질5로알려진 과정이다. 불소의 담금질은 명백한 수명의 단축 귀착됩니다. 용해될 때, 단백질의 수명은 원래의 더 높은 가치에 더 가깝게 유지됩니다. 대조적으로, 단백질이 응집하기 시작하면, 그 수명은 필연적으로 더 낮은 값6,,7로이동합니다. 따라서, 살아있는 C. elegans에있는 다른 나이에 어떤 아밀로이드 형성 단백질의 응집 성향을 감시하는 것이 가능하게 됩니다.
여기서 우리는 상이한 폴리글루타민(CAG, Q) 스트레글(Q40, Q44, 및 Q85)을 포함하는 융합 단백질의 응집을 분석하는 프로토콜을 설명한다. 우리는 기술이 청록색 형광 단백질 (CFP), 황색 형광 단백질 (YFP) 및 단모공 적색 형광 단백질 (mRFP)과 같은 다른 형광체에 동등하게 적용될 수 있는 방법을 설명합니다; 그리고 C. 예쁜 꼬마의모든 조직에서, 뉴런을 포함, 근육, 그리고 내장. 더욱이, proteostasis의 맥락에서, FLIM은 분자 chaperones의 고갈시 변경을 관찰하는 아주 유용한 공구입니다. RNA 간섭을 통해 주요 분자 샤페론 중 하나인 열 충격 단백질 1(hsp-1)을쓰러뜨리면 단백질의 조기 오인이 발생합니다. 노화, 질병 또는 결핍 된 샤페론의 결과로 응집 부하의 증가는 형광 수명 감소로 측정됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ahringer Library hsp-1 siRNA</td>
			<td>Source BioScience UK Limited</td>
			<td>F26D10.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.3</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H DCS-120 SPC-150</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H SPC830-SPC Image</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ44-YFP</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OG412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ85-YFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans mQ40-RFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans nQ40-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>2316.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoQuant PicoHarp300</td>
			<td>PicoQuant GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K305.1</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Agarose</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510-Meta NLO</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging

아밀로이드 섬유소는 헌팅턴병, 파킨슨병 또는 알츠하이머병과 같은 여러 신경 퇴행성 질환과 관련이 있습니다. 이러한 아밀로이드 섬유소는 단백질 성 세포(PN)의 성분뿐만 아니라 내인성 메타안정 단백질을 격리시킬 수 있으며, 이로 인해 세포에서 단백질오폴딩을 악화시킬 수 있다. 동물 내의 아밀로이드 단백질의 응집 과정을 평가하는 데 사용할 수 있는 도구의 수가 제한되어 있습니다. 우리는 뉴런과 같은 특정 세포에서 아밀로이드 섬유의 정량화뿐만 아니라 모니터링을 허용하는 형광 평생 현미경 검사법 (FLIM)에 대한 프로토콜을 비침습적 방식으로, 노화의 진행과 함께 PN. FLIM은 형광단의 발현 수준과 무관하며 더 이상 염색이나 표백없이 응집 과정을 분석할 수 있습니다. 형광광은 아밀로이드 구조의 가까운 곳에 있을 때 담금질되어 형광 수명이 감소합니다. 담금질은 아밀로이드 단백질의 응집과 직접 관련이 있습니다. FLIM은 비침습적 방식으로 생체 내상에서 상이한 아밀로이드 단백질, 환경 자극 또는 유전적 배경의 섬유화 과정을 비교하기 위해 적용될 수 있는 다목적 기술이다.

이 프로토콜은 자연 노화 중과 스트레스를 받을 때 살아있는 C. 예쁜 꼬마의응집된 종의 형성을 정확하게 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 우리는 40Q, 44Q 또는 85Q 반복의 폴리글루타민 단백질을 발현하는 형질전환 선충의 4개의 다른 긴장을 선택했습니다. 이 단백질은 다른 조직에서 합성되고 다른 형광단에 융합되었습니다. C. 예쁜꼬마선충 균주는 체내 벽 ...

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Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

형광 일생 화상 진찰은 생활, 노화 및 응력 C. elegans 질병 모형에 있는 단백질의 집합 경향을 정량화하고 구별합니다.

형광 일생 화상 진찰을 사용하여 노화 C. Elegans에 있는 아밀로이드 구조물의 특성화

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

이 방법을 통해 통합 아밀로이드 단백질 구조를 수용성 및 축적된 단백질 구조와 명확하게 구별할 수 있습니다. 이 기술은 독성 부작용이 거의 또는 전혀 없는 비침습적 방식으로 생체 내에서 수행됩니다. 형광소 자체의 형광 특성에 따라 다르기 때문에 시간이 지남에 따라 매우 견고하고 재현 할 수 있습니다.FLIM은 암 진단 분야에서 활용되고 있습니다. 그러나, 우리는 실제로 신경 퇴행성 질병과 관련이 있는 단백질 응집의 기본적인 기계장치를 연구하기 위하여 그것을 채택합니다. 방법론은 단백질 응집 분야에서 사용될 수 있다.관련 단백질이 형광 프로브와 태그되는 한 시간이 지남에 따라 추적 및 모니터링할 수 있습니다. 응집을 촉진하거나 방지하는 화합물 및 전략은 성공적으로 연구될 수 있습니다. 빛 현미경 검사법에 의해 시각화될 수 있는 모든 생물학적 시스템은 세포 배양, 고정 또는 투과성 시료 및 필요한 모든 매체에서 예를 들어 생체 내 또는 전 생체 내FLIM에 적합합니다.실험 데이터를 얻기 전에 선충 내에서 선택한 불소호의 특성을 테스트하고 측정을 획득하기 전에 설정이 완벽하게 작동하는지 테스트해야 합니다. 시작하려면 NGM 플레이트에서 선충을 섭씨 20도에서 재배하고 유지하십시오. 청년 성인으로 생활의 4 일째까지 선충을 나이와 노인으로 생활의 여덟 날.이미징 의 날에, 이미징 슬라이드를 준비하여 시작합니다. 아가로즈와 이중 증류수를 부피량으로 3%의 농도로 배치합니다. 전자레인지에 넣고 녹인 다음 약간 식힙니다.1 밀리리터 파이펫 팁의 끝을 잘라 녹은 아가로즈의 약 200 마이크로 리터를. 파이펫은 깨끗한 유리 슬라이드에 아가로즈를 하고 즉시 거품의 형성을 피하기 위해 위에 두 번째 하나를 배치합니다. 슬라이드를 건조시키고 상단 유리 슬라이드를 부드럽게 제거합니다.그 결과 선충이 배치될 아가로즈 표면이 있는 유리 슬라이드가 생성됩니다. 이미징 설정이 사용 준비가 되면 스테레오 현미경으로 작동하여 마취 화합물 10 마이크로 리터 드롭을 아가로즈 패드에 놓고 5 ~10 개의 선충을 부드럽게 전달하십시오. 속눈썹 팁을 사용하여 선충을 분리하십시오.이미지 수집 중에 선충의 편산화를 쉽게 할 수 있도록 가까이 두지만 만지지 않도록 하십시오. 선충을 커버슬립으로 조심스럽게 오버레이합니다. 장착 후 1시간 이내에 측정을 수행하십시오.선충이 완전히 움직이지 않는지 확인하십시오. FLIM 획득 소프트웨어를 엽니다. 탭 단추를 찾고 활성화 출력을 누릅니다.스테이지에 장착된 C.elegans와 함께 슬라이드를 배치하고 10X 배율 렌즈를 전송 모드로 사용하여 슬라이드의 선충의 위치를 국소화합니다. 슬라이드를 제거하고 목표를 63X 배율 렌즈로 전환하고 필요한 침지 매체를 적용합니다. 슬라이드를 무대에 놓고 선충을 현지화합니다.샘플 스캔을 시작합니다. 관심 영역을 선택하고 최대 투영 평면에 집중합니다. FLIM 소프트웨어의 인터페이스에서 감지된 광자 수를 미리 봅보십시오.ADC 값은 10~4번, 10~5회 사이여야 합니다. 필요한 경우 다른 평면에 초점을 이동하거나 레이저 전력을 늘려 더 많은 광자를 수집합니다. 광자 더미를 피하면서도 충분한 양의 광자를 수집하여 수명 적합성과 측정을 해야 합니다.메뉴 모음에서 탭을 선택하여 획득 매개 변수를 설정합니다. 단일 광자 감지를 허용하려면 스캔 동기화를 선택합니다. 수집을 고정된 시간 또는 고정된 수의 광자수로 설정합니다.프레스 는 인수를 시작합니다. 소프트웨어를 열고 파일을 통해 FLIM 데이터 파일을 가져오고 FLIM 데이터를 로드합니다. 다른 세션과 다른 생물학적 반복에서 얻은 경우에도 하나의 조건에서 모든 샘플을로드합니다.필요한 경우 세분화, 세분화 관리자를 통해 많은 FLIM 그림에 대한 선충을 신호하는 세그먼트. 자르기 도구가 강조 표시될 때까지 관심 영역 주위로 드래그합니다. 완료되면 확인을 누릅니다. C.elegans의 강도 기반 이미지가 나타나는 작은 영역을 선택합니다.해당 영역의 붕괴 곡선은 인터페이스의 오른쪽에 있는 큰 부패 창에 나타납니다. 수명을 추정하기 위해 데이터 탭에서 임의로 통합된 최소 값을 40~300으로 설정하여 너무 어둡게 된 픽셀을 제외하여 적합도를 생성합니다. FLIM 신호를 이러한 값으로 제한하려면 시간 최소 및 시간 최대 수를 선택합니다.미리 설정된 카운트 광자 하나를 변경하지 마십시오. 획득 시 활용된 레이저의 메가헤르츠에서 반복 속도를 입력합니다. 모든 포화 픽셀을 제외하려면 게이트 최대 값을 입력합니다.수명 탭에서 사용할 전역 피팅을 선택합니다. 선택한 형광 붕괴가 다수 지수이며 단일 수명 이상을 나타낸다는 것으로 알려진 경우 기하급수 선택 수를 제외한 다른 매개 변수를 변경하지 마십시오. IRF 메뉴를 통해 IRF를 업로드합니다.IRF 시프트를 추정하려면 IRF를 선택하고 IRF 시프트를 추정합니다. 값 집합이 IRF 탭에 자동으로 나타납니다. 이 설정이 설정되면 이 탭의 다른 매개 변수는 변경하지 않습니다.모든 매개 변수가 설정되면 맞춤 데이터 집합을 누릅니다. 파란색 선에서 강조 표시된 결과 맞춤은 모든 이벤트와 겹쳐야 합니다. 모든 이벤트가 핏에 따라 정렬될 때 좋은 착용감을 얻을 수 있습니다.소프트웨어 인터페이스의 오른쪽 상단 메뉴 내에 있는 매개 변수 탭을 클릭하고 통계, 가중 평균을 선택하고 치 사각형 값이 가능한 한 하나에 가깝게 있는지 확인합니다. 따라서 선택한 이미지의 수명 값이 타우 하나로 드러난다. 파일, 내보내기 강도 이미지, 적합 결과 테이블, 이미지, 히스토그램을 통해 관심있는 정보를 내보냅니다.4일째 또는 8일째에 근력 Q40 RFP를 표현하는 C.elegans의 대표적인 지도가 여기에 표시됩니다. IQ85의 더 긴 Q 스트레칭은 집계하는 경향이 있었고 이미 4 일째에 히스토그램의 형광 평생 변화를 보였습니다. 사실, 4 일째에 IQ85에 대한 포시 형성이 관찰되었지만 IQ44에는 여전히 존재하지 않았습니다.그러나 노화시 IQ44는 포시 형성을 나타내므로 형광 수명이 감소했습니다. 마지막으로, 포시 형성은 NQ40CFP 균주에서 형광 수명을 감소시키지 도 하였다. 이 긴장을 위해, 노화 시 평균 형광 수명에 만 미묘한 비 유의한 변화가 있었다.선충 모델이 확립되면 수집된 광자의 양이 가장 적합합니다. 이 방법은 포토표백, FRAP 또는 측정 후 포스터 공명 에너지 전달, FRET, 형광 회수와 같은 다른 기술과 더욱 결합될 수 있다. 이러한 모든 적응은 단백질 연구의 특성과 집계된 형태에 대한 추가 정보를 제공합니다.단백질 응집 및 단백질 항상성의 분야에서, 기술은 시스템에 부과된 어떤 동요든지, 다른 단백질 종의 분포 및 인신 매매 및 일반적으로 살아있는 유기체 내의 수용성 및 불용성 단백질 분획의 차이 그리고 중요성을 조사할 수 있었습니다. 마취 나트륨 아지드는 독성이 있으며 장갑과 고글로 취급하고 연기 후드 아래에 희석해야합니다. 이 기술은 현미경 기지를 기반으로 하기 때문에 레이저와 관련된 모든 경고를 따르는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

연구

생화학

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

속도 사용 하 여 식물에 Mannan 세포 벽 다 당 류 구조 특성

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

사용 하 여 다른 크기와 성장 단백질 결정 자동화 현장에서 동적 산란과 함께 결정 화

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

2 차원 반 변성 세제 Agarose 젤 전기 이동 법 확인 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유의 크기가 하 사용

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

나노-추적 분석 인 혈에 있는 단일 Extracellular Vesicles의 빠른 형광 기반 특성

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

간암에서 스모 프로테오메의 농축, 격리, 식별 및 특성화를 위한 도구로 스모 결합 엔티티(SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...