Name: characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging
Uploaded: 2020-03-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging at JoVE.com

Muskel-Q40-mRFP-stammen levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Den nevronale-Q40-CFP var en snill gave av Morimoto Lab. Vi anerkjenner DFG (KI-1988/5-1 til JK, NeuroCure PhD-fellesskap av NeuroCure Cluster of Excellence til MLP), EMBO (Kortsiktig fellesskap til MLP) og Biologselskapet (reisetilskudd til CG og MLP) for finansiering. Vi anerkjenner også Advanced Light Microscopy imaging anlegget ved Max Delbrück Centre for Molecular Medicine, Berlin, for å gi oppsettet for å bilde YFP-konstruksjonene.

1. Synkronisering av C. elegans
<ol><li>Synkroniser C. elegans enten via alkalisk hypoklorittløsningsbehandling eller via enkel egglegging i 4 timer ved 20 °C8.</li>
	<li>Vokse og vedlikeholdne ved 20 °C på nematodevekstmedium (NGM) plater sådd med OP50 E. coli i henhold til standardprosedyrer9. Alder nematodene til ønsket utviklingsstadium eller dag. MERK: I denne protokollen blir unge voksne avbildet på dag 4 og gamle nematoder er av...

<ol>
	<li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease.">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li><li>Kikis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+struggle+by+Caenorhabditis+elegans+to+maintain+proteostasis+during+aging+and+disease.">The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease.</a> Biology Direct. 11, 58 (2016).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+-+techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).</li><li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+measurements+and+biological+imaging.">Fluorescence lifetime measurements and biological imaging.</a> Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li><li>Kaminski Schierle, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET+sensor+for+non-invasive+imaging+of+amyloid+formation+in+vivo.">A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo.</a> ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).</li><li>Sandhof, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+INS-IGF1+signaling+protects+against+non-cell+autonomous+vesicle+rupture+caused+by+SNCA+spreading.">Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading.</a> Autophagy. , 1-22 (2019).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).</li><li>Becker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Lifetime+Imaging+by+Time-Correlated+Single-Photon+Counting.">Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting.</a> Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).</li><li>Warren, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+global+fitting+of+large+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+datasets.">Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets.</a> PloS one. 8 (8), e70687 (2013).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+of+proteostasis+represents+an+early+molecular+event+in+Caenorhabditis+elegans+aging.">Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Specific+Intrinsic+Fluorescence+of+Protein+Amyloids+Used+to+Study+their+Kinetics+of+Aggregation.">Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation.</a> Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).</li><li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Reveals+the+Aggregation+Processes+of+&#945;-Synuclein+and+Polyglutamine+in+Aging+Caenorhabditis+elegans.">Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of &#945;-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).</li><li>Kelbauskas, L., Dietel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Aggregated+Photosensitizers+by+Tumor+Cells:+Subcellular+Time-resolved+Fluorescence+Spectroscopy+on+Derivatives+of+Pyropheophorbide-a+Ethers+and+Chlorin+e6+under+Femtosecond+One-+and+Two-photon+Excitation.">Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).</li><li>Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+and+FCS+detection+in+laser-scanning+microscopes:+Increased+efficiency+by+GaAsP+hybrid+detectors.">FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors.</a> Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).</li><li>Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+fluorescence+microscopy.">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).</li></ol>

Protokollen som presenteres her beskriver en mikroskopibasert teknikk for å identifisere aggregerte arter i C. elegans modellsystem. FLIM kan nøyaktig karakterisere tilstedeværelsen av både aggregerte og oppløselige arter smeltet til en fluorophore via måling av deres fluorescens levetid forfall. Når et fusjonsprotein begynner å aggregere sin registrerte gjennomsnittlige levetid vil skifte fra en høyere til en lavere verdi16. Tilbøyeligheten til aggregering kan deretter utledes ...

Proteinaggregering forekommer både ved aldring og sykdom. Banene som fører til dannelse og avsetning av store amyloider eller amorfe inneslutninger er vanskelige å følge, og deres kinetikk er tilsvarende utfordrende å rakne. Proteiner kan misfold på grunn av iboende mutasjoner i deres koding sekvenser, som i tilfelle av genetiske sykdommer. Proteiner også misfold fordi proteostase nettverk (PN) som holder dem løselig og riktig foldet er svekket, som skjer under aldring. PN inkluderer molekylære chaperones og nedbrytning maskiner og er ansvarlig for biogenesis, folding, menneskehandel, og nedbrytning av proteiner1.
C. elegans har dukket opp som en modell for å studere aldring og sykdom på grunn av sin korte levetid, isogene natur, og enkel genetisk manipulasjon. Flere C. elegans transgene stammer som uttrykker menneskelig sykdomsfremkallende proteiner i sårbare vev har blitt opprettet. Viktigere, mange av stammene som inneholder aggregeringsutsatte proteiner rekapitulerer kjennetegnet på amyloid lidelser, dannelsen av store inneslutninger. Takket være C. elegans gjennomsiktige kropp, kan disse aggregatene visualiseres in vivo, ikke-invasivt og ikke-destruktivt2. Generering av ethvert protein av interesse (POI) i fusjon med en fluorophore gjør det mulig å undersøke sine steder, menneskehandel, interaksjonsnettverk og generell skjebne.
Vi presenterer en protokoll for å overvåke aggregering av sykdomsfremkallende proteiner i levende og aldrende C. elegans via fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM). FLIM er en kraftig teknikk basert på levetiden til en fluorophore, snarere enn utslippsspektra. Levetiden (tau, τ) er definert som den gjennomsnittlige tiden som kreves av et foton for å forfalle fra sin spente tilstand tilbake til sin bakketilstand. Levetiden til et gitt molekyl beregnes med tidsdomeneteknikken for tidskorrelert enkeltfotontelling (TCSPC). I TCSPC-FLIM oppnås fluorescerende forfallsfunksjon ved å spennende fluoroforforen med korte, høyfrekvente laserpulser og måle de emitterte fotonens ankomsttider til en detektor i forhold til pulsene. Når du skanner en prøve, opprettes en tredimensjonal datamatrise for hver piksel: matrisen inneholder informasjon om fordelingen av fotonene i x,y romlige koordinater og deres temporale forfallskurve. En gitt prøve blir derfor et kart over levetidsomhet som avslører informasjon om proteinets struktur, binding og miljø3,4. Hvert fluorescerende protein har en iboende og nøyaktig definert levetid, vanligvis av noen få nanosekunder (ns), avhengig av sine fysiokjemiske egenskaper. Viktigere, levetiden til en fluorophore er uavhengig av konsentrasjon, fluorescerende intensitet, og av bildemetoden. Men innenfor et biologisk system kan det påvirkes av miljøfaktorer som pH, temperatur, ionkonsentrasjoner, oksygenmetning og interaksjonspartnere. Levetider er også følsomme for interne strukturelle endringer og orientering. Å koble en fluorofor til et POI resulterer i en endring i levetiden og dermed informasjon om oppførselen til det smeltede proteinet. Når en fluoroforer er omgitt eller innkapslet i et tett bundet miljø, for eksempel de antiparallelle betaarkene i en amyloid struktur, mister den energi ikke-radiativt, en prosess kjent somslukkende 5. Slukking av fluoroforen resulterer i en forkortelse av sin tilsynelatende levetid. Når løselig, et protein levetid vil holde seg nærmere sin opprinnelige, høyere verdi. I motsetning, når et protein begynner å aggregere, vil levetiden uunngåelig skifte til en lavere verdi6,7. Derfor blir det mulig å overvåke aggregeringstilbøyeligheten til ethvert amyloiddannende protein i ulike aldre i levende C. elegans.
Her beskriver vi en protokoll for å analysere aggregeringen av et fusjonsprotein som består av forskjellige polyglutamin (CAG, Q) strekninger (Q40, Q44 og Q85). Vi illustrerer hvordan teknikken kan brukes likt på forskjellige fluoroforer, som cyanfluorescerende protein (CFP), gult fluorescerende protein (YFP) og monomeriske røde fluorescerende protein (mRFP); og i alle vev av C. elegans, inkludert nevroner, muskler, og tarmen. Videre, i sammenheng med proteostase, er FLIM et svært nyttig verktøy for å observere endringer ved uttømming av molekylære chaperons. Slå ned en av de viktigste molekylære chaperones, varme sjokk protein 1 (hsp-1), via RNA interferens produserer for tidlig feilfolding av proteiner. Økningen i aggregeringsbelastning som følge av aldring, sykdom eller mangelfulle chaperones, måles deretter som en reduksjon i fluorescens levetid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ahringer Library hsp-1 siRNA</td>
			<td>Source BioScience UK Limited</td>
			<td>F26D10.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.3</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H DCS-120 SPC-150</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H SPC830-SPC Image</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ44-YFP</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OG412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ85-YFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans mQ40-RFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans nQ40-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>2316.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoQuant PicoHarp300</td>
			<td>PicoQuant GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K305.1</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Agarose</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510-Meta NLO</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging

Amyloid fibriller er forbundet med en rekke nevrodegenerative sykdommer som Huntingtons, Parkinsons eller Alzheimers sykdom. Disse amyloid fibriller kan sequester endogene metastabile proteiner samt komponenter i proteostase nettverk (PN) og dermed forverre protein misfolding i cellen. Det finnes et begrenset antall verktøy tilgjengelig for å vurdere aggregeringsprosessen av amyloid proteiner i et dyr. Vi presenterer en protokoll for fluorescens livstidsmikroskopi (FLIM) som gjør det mulig å overvåke samt kvantifisering av amyloid fibrilization i bestemte celler, for eksempel nevroner, på en ikke-invasiv måte og med progresjon av aldring og ved perturbasjon av pn. FLIM er uavhengig av uttrykksnivåene til fluoroforen og muliggjør en analyse av aggregeringsprosessen uten ytterligere flekker eller bleking. Fluoroforer slukkes når de er i nærheten av amyloid strukturer, noe som resulterer i en reduksjon av fluorescens levetid. Slukkingen korrelerer direkte med aggregeringen av amyloidproteinet. FLIM er en allsidig teknikk som kan brukes til å sammenligne fibrilization prosessen med forskjellige amyloid proteiner, miljømessige stimuli, eller genetisk bakgrunn in vivo på en ikke-invasiv måte.

Protokollen viser hvordan man nøyaktig overvåker dannelsen av aggregerte arter i levende C. elegans, både under sin naturlige aldring og når de utsettes for stress. Vi valgte fire forskjellige stammer av transgene nematoder som uttrykker polyglutaminproteiner på enten 40Q, 44Q eller 85Q repetisjoner. Disse proteinene syntetiseres i forskjellige vev og ble smeltet sammen til forskjellige fluoroforer. C. elegans stammer enten uttrykt Q40-mRFP i kroppen veggen muskler ...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging at JoVE.com

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Fluorescens levetid bildebehandlingsskjermer, kvantifiserer og skiller aggregering tendenser av proteiner i levende, aldring, og stresset C. elegans sykdom modeller.

Karakterisering av amyloid strukturer i aldring C. Elegans ved hjelp av fluorescens levetid imaging

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Metoden tillater oss å tydelig skille integrerte amyloid proteinstrukturer fra løselige og til og med akkumulerte kolleger. Teknikken utføres in vivo på en ikke-invasiv måte med små eller ingen toksiske bivirkninger. Da det avhenger av fluoroforens fluorescerende egenskaper, er den svært robust og reproduserbar over tid.FLIM har blitt benyttet innen kreftdiagnose. Vi bruker det imidlertid til å studere de grunnleggende mekanismene for proteinaggregasjon som faktisk er relevante for nevrodegenerative sykdommer. Metodikken kan brukes innen proteinaggregasjon.Så lenge sykdommen forbundet protein er merket med en fluorescerende sonde, kan den spores og overvåkes over tid. Forbindelser og strategier som enten fremmer eller forhindrer aggregering kan studeres. Ethvert biologisk system som gjør det mulig å visualiseres av lett mikroskopi er egnet for FLIM enten in vivo eller ex vivo, for eksempel i cellekultur, i fikserte eller permeabiliserte prøver og i ethvert medium som er nødvendig.Sørg for å teste egenskapene til din valgte fluorofor i nematoden før du henter eksperimentelle data og for å teste at oppsettet er fullt funksjonelt før du anskaffer målinger. For å begynne, vokse og vedlikeholde nematoder ved 20 grader Celsius på NGM plater. Alder nematodene til dag fire av livet som de unge voksne og dag åtte av livet som de gamle voksne.På bildedagen starter du med å klargjøre bildeglideglassene. Plasser agarose og dobbelt destillert vann i en konsentrasjon på 3% vekt etter volum. Overfør den til en mikrobølgeovn for å smelte og la den avkjøles litt.Klipp spissen av en en milliliter pipettespiss og ta omtrent 200 mikroliter av smeltet agarose. Pipette agarose på en ren glasssklie og umiddelbart plassere en annen på toppen unngå dannelsen av noen bobler. La lysbildene tørke og fjern det øverste glasslysbildet forsiktig.Resultatet er en glasssklie med en jevn agarose overflate hvor nematodene vil bli plassert. Når bildeoppsettet er klart til bruk, arbeider under et stereomikroskop, plasserer du en 10 mikroliter dråpe bedøvelsesforbindelse på en agarosepute og overfører forsiktig fem til 10 nematoder inn i den. Bruk en øyenvippespiss for å skille nematodene.Hold dem tett sammen, men ikke berøre for å tillate enklere lokalisering av nematodene under bildeoppkjøp. Legg forsiktig nematodene med en dekkslipp. Innen en time etter montering, ta målinger.Kontroller at nematodene er helt immobile. Åpne programvare for FLIM-oppkjøp. Finn tabulatorknappen og trykk aktiver utganger.Plasser lysbildet med de monterte C.elegans på scenen og bruk en 10X forstørrelseslinse i overføringsmodus, lokaliser posisjonen til nematodene på lysbildet. Fjern lysbildet, bytt målet til et 63X forstørrelsesobjektiv, og bruk det nødvendige nedsenkingsmediet. Plasser lysbildet på scenen og lokaliser nematodene.Begynn å skanne prøven. Velg en interesseregion og fokuser på det maksimale projeksjonsplanet. På grensesnittet til FLIM-programvaren forhåndsviser du antall fotoner som oppdages.ADC-verdien skal være mellom én gang 10 til den fjerde og én ganger 10 til den femte. Om nødvendig, skift fokus på et annet plan eller øk laserkraften for å samle flere fotoner. Sørg for at du unngår foton hoper seg opp, men samle en tilstrekkelig mengde fotoner for å skape en god levetid passform og måling.Velg kategorien på menylinjen for å angi anskaffelsesparameterne. Velg skannesynkronisering for å tillate enkel fotonregistrering. Angi anskaffelsen til et fast tidsbeløp eller et fast antall fotoner.Trykk start for å starte oppkjøpet. Åpne programvaren og importer FLIM datafiler via fil, last inn FLIM-data. Last alle prøvene fra en tilstand selv om de oppnås i forskjellige økter og fra forskjellige biologiske repetisjoner.Om nødvendig segmenter for å signalisere nematode for mange FLIM-bilder via segmentering, segmenteringsbehandling. Dra beskjæringsverktøyet rundt interesseområdet til det er uthevet. Når du er ferdig, trykker du på OK. Velg et lite område der det intensitetsbaserte bildet av en C.elegans vises.Forfallskurven i denne regionen vises i det store forfallsvinduet på høyre side av grensesnittet. Hvis du vil ekstrapolere levetiden, angir du en vilkårlig integrert minimumsverdi mellom 40 og 300 i kategorien data for å utelate eventuelle piksler som er for svake til å gi god passform. Velg et minimumstid og et maksimumsnummer for tid for å begrense FLIM-signalet til disse verdiene.Ikke endre det forhåndsinnstilte antallet foton av ett. Skriv inn repetisjonshastigheten i megahertz av laseren som benyttes under oppkjøpet. Skriv inn en port maksverdi for å ekskludere alle mettede piksler.Velg en global tilpasning som skal brukes, i kategorien levetid. Ikke endre noen annen parameter unntatt antall eksponentielle valg hvis det er kjent at den valgte fluorescens forfall er multi-eksponentiell og viser mer enn en enkelt levetid. Last opp IRF via IRF-menyen.Hvis du vil estimere IRF-skiftet, velger du IRF, anslåR IRF-skift. Et sett med verdier vises automatisk i kategorien IRF. Når dette er opprettet, må du ikke endre andre parametere i denne kategorien.Når alle parameterne er angitt, trykker du på tilpass datasett. Den resulterende passformen uthevet i en blå linje skal overlappe med alle hendelsene. En god passform oppnås når alle hendelser er justert langs passformen.Klikk kategorien parametere øverst til høyre i programvarens grensesnitt og velg statistikk, vektet gjennomsnitt, og kontroller at chi-kvadratverdien er så nær som mulig til en. Levetidsverdien til det valgte bildet blir dermed avslørt som tau en. Eksporter all informasjon av interesse gjennom fil, eksport intensitet bilder, passer resultattabell, bilder, histogrammer.Representative kart over C.elegans uttrykker muskuløs Q40 RFP på dag fire eller dag åtte av livet er vist her. Den lengre Q-strekningen av IQ85 var mer utsatt for aggregering og viste et fluorescens livstidsskifte i histogrammet allerede på dag fire av livet. Faktisk, på dag fire, foci formasjon ble observert for IQ85 mens fortsatt fraværende i IQ44.Ved aldring viste IQ44 også foci dannelse og dermed en redusert fluorescens levetid. Til slutt ble foci-dannelse ikke oppdaget, og heller ikke redusert fluorescenslevetid i NQ40CFP-stammen. For denne belastningen var det bare subtile ikke-signifikante endringer i gjennomsnittlig fluorescenslevetid ved aldring.Når nematodemodellen er etablert, er mengden foton samlet avgjørende for å oppnå en god levetid passform. Metoden kan videre kobles til ulike teknikker som Forster resonans energioverføring, FRET, fluorescens utvinning etter fotobleaching, FRAP, eller måling. Alle disse tilpasningene gir ekstra informasjon om egenskapene til proteinstudiene og dens aggregerte form.Innen proteinaggregasjon og protein homeostase, teknikken lov til å undersøke eventuelle perturbasjon pålagt systemet, fordelingen av ulike proteinarter, og menneskehandel og generelt forskjellen og betydningen av løselige og uoppløselige protein fraksjoner i den levende organismen. Bedøvelsesnatriumazidet er giftig og skal håndteres med hansker og vernebriller og fortynnes under en røykhette. Fordi teknikken er mikroskopibasert, er det viktig å følge alle advarsler knyttet til arbeid med lasere.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid vev beiset med selvlysende konjugert Oligothiophenes av hyperspektral AC Confocal mikroskopi og fluorescens levetid bildebehandling

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Strukturelle karakteristikk av Mannan cellevegg polysakkarider i planter ved hjelp av TEMPO

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metode for høy gjennomstrømning kjemiske Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Voksende Protein krystaller med forskjellige dimensjoner bruke automatisert krystallisering kombinert med In Situ dynamisk lysspredning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Bruk av to-dimensjonale semi denaturing vaskemiddel Agarose Gel geleelektroforese å bekrefte størrelse heterogenitet av Amyloid eller Amyloid-lignende fiber

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantifisering av Protein Homo-oligomerization med kommersielle instrumentering og gratis, åpen kildekode lysstyrke analyseprogramvare

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Rask fluorescens-baserte karakterisering av enkelt ekstracellulær blemmer i menneskelig blod hydrogenion sporing analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Inne vivo kalsium tenkelig inne C. elegans kropp mur muskelen

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaksjoner med og membran Permeabilization av Brain mitokondrier av amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende enheter (SUBEs) som verktøy for berikelse, isolasjon, identifisering og karakterisering av SUMO proteom i leverkreft

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...