Name: characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging
Uploaded: 2020-03-27T15:00:00
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A cepa músculo-Q40-mRFP fornecida pelo CGC, que é financiada pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). O neuronal-Q40-CFP foi um presente gentil do Laboratório Morimoto. Reconhecemos o DFG (KI-1988/5-1 para JK, a bolsa de doutorado NeuroCure pelo Cluster de Excelência neurocure para MLP), a EMBO (bolsa de curto prazo para a MLP) e a Companhia de Biólogos (bolsas de viagem para CG e MLP) para financiamento. Também reconhecemos a instalação de imagens de microscopia avançada de luz no Centro Max Delbrück de Medicina Molecular, Berlim, por fornecer a configuração para a imagem que o YFP constrói.

1. Sincronização de C. elegans
<ol><li>Sincronize C. elegans através do tratamento da solução de hipoclorito alcalino ou através de um simples ovo por 4 h a 20 °C8.</li>
	<li>Cultivar e manter nematóides a 20 °C em placas médias de crescimento de nematóides (NGM) semeadas com OP50 E. coli de acordo com os procedimentos padrão9. Idade dos nematóides até o estágio ou dia de desenvolvimento desejado. NOTA: Neste protocolo, adultos...

<ol>
	<li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease.">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li><li>Kikis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+struggle+by+Caenorhabditis+elegans+to+maintain+proteostasis+during+aging+and+disease.">The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease.</a> Biology Direct. 11, 58 (2016).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+-+techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications.</a> Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).</li><li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+measurements+and+biological+imaging.">Fluorescence lifetime measurements and biological imaging.</a> Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li><li>Kaminski Schierle, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET+sensor+for+non-invasive+imaging+of+amyloid+formation+in+vivo.">A FRET sensor for non-invasive imaging of amyloid formation in vivo.</a> ChemPhysChem. 12 (3), 673-680 (2011).</li><li>Sandhof, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+INS-IGF1+signaling+protects+against+non-cell+autonomous+vesicle+rupture+caused+by+SNCA+spreading.">Reducing INS-IGF1 signaling protects against non-cell autonomous vesicle rupture caused by SNCA spreading.</a> Autophagy. , 1-22 (2019).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 64, e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), 1-10 (2001).</li><li>Becker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Lifetime+Imaging+by+Time-Correlated+Single-Photon+Counting.">Fluorescence Lifetime Imaging by Time-Correlated Single-Photon Counting.</a> Microscopy Research and Technique. 63 (1), 58-66 (2004).</li><li>Warren, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+global+fitting+of+large+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+datasets.">Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets.</a> PloS one. 8 (8), e70687 (2013).</li><li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states.">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li><li>Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+of+proteostasis+represents+an+early+molecular+event+in+Caenorhabditis+elegans+aging.">Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Current Opinion in Biotechnology. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>Chan, F. T. S., Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Specific+Intrinsic+Fluorescence+of+Protein+Amyloids+Used+to+Study+their+Kinetics+of+Aggregation.">Structure-Specific Intrinsic Fluorescence of Protein Amyloids Used to Study their Kinetics of Aggregation.</a> Bio-nanoimaging: Protein Misfolding and Aggregation. , 147-155 (2013).</li><li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Reveals+the+Aggregation+Processes+of+&#945;-Synuclein+and+Polyglutamine+in+Aging+Caenorhabditis+elegans.">Fast Fluorescence Lifetime Imaging Reveals the Aggregation Processes of &#945;-Synuclein and Polyglutamine in Aging Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chemical Biology. 14 (7), 1628-1636 (2019).</li><li>Kelbauskas, L., Dietel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Aggregated+Photosensitizers+by+Tumor+Cells:+Subcellular+Time-resolved+Fluorescence+Spectroscopy+on+Derivatives+of+Pyropheophorbide-a+Ethers+and+Chlorin+e6+under+Femtosecond+One-+and+Two-photon+Excitation.">Internalization of Aggregated Photosensitizers by Tumor Cells: Subcellular Time-resolved Fluorescence Spectroscopy on Derivatives of Pyropheophorbide-a Ethers and Chlorin e6 under Femtosecond One- and Two-photon Excitation.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (6), 686-694 (2002).</li><li>Becker, W., Su, B., Holub, O., Weisshart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIM+and+FCS+detection+in+laser-scanning+microscopes:+Increased+efficiency+by+GaAsP+hybrid+detectors.">FLIM and FCS detection in laser-scanning microscopes: Increased efficiency by GaAsP hybrid detectors.</a> Microscopy Research and Technique. 74 (9), 804-811 (2011).</li><li>Suhling, K., French, M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+fluorescence+microscopy.">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 4 (1), 13-22 (2005).</li></ol>

O protocolo aqui apresentado descreve uma técnica baseada em microscopia para identificar espécies agregadas no sistema modelo C. elegans. FLIM pode caracterizar com precisão a presença de espécies agregadas e solúveis fundidas a um fluoróforo através da medição de suas decaidas ao longo da vida de fluorescência. Quando uma proteína de fusão começar a agregar sua vida média registrada passará de um valor mais alto para um valor mais baixo16. A propensão da agregação pod...

A agregação proteica ocorre tanto no envelhecimento quanto na doença. Os caminhos que levam à formação e deposição de grandes amilóides ou inclusões amorfas são difíceis de seguir e seus cinéticos são igualmente desafiadores para desvendar. As proteínas podem se desdobrar devido a mutações intrínsecas dentro de suas sequências de codificação, como no caso de doenças genéticas. As proteínas também se desdobram porque a rede de proteota (PN) que as mantém solúveis e devidamente dobradas é prejudicada, como acontece durante o envelhecimento. A PN inclui acompanhantes moleculares e máquinas de degradação e é responsável pela biogênese, dobramento, tráfico e degradação de proteínas1.
C. elegans emergiu como um modelo para estudar o envelhecimento e a doença devido à sua curta vida útil, natureza isogênica e facilidade de manipulação genética. Várias cepas transgênicas C. elegans que expressam proteínas causadoras de doenças humanas em tecidos vulneráveis foram criadas. É importante ressaltar que muitas das cepas que contêm proteínas propensas à agregação recapitulam a marca registrada de distúrbios amilóides, a formação de grandes inclusões. Graças ao corpo transparente de C. elegans, esses agregados podem ser visualizados in vivo, não invasiva e não destrutivo2. Gerar qualquer proteína de interesse (POI) em fusão com um flúor permite investigar suas localizações, tráfico, rede de interação e destino geral.
Apresentamos um protocolo para monitorar a agregação de proteínas causadoras de doenças em vivos e envelhecimento s c. elegans via fluorescência de imagem ao longo da vida (FLIM). FLIM é uma técnica poderosa baseada na vida de um fluoróforo, em vez de seus espectros de emissão. A vida útil (tau, τ) é definida como o tempo médio exigido por um fóton para decair de seu estado animado de volta ao seu estado terrestre. A vida útil de uma determinada molécula é calculada com a técnica de domínio temporal da contagem de fótons únicos correlacionados com o tempo (TCSPC). No TCSPC-FLIM, a função de decaimento fluorescente é obtida por excitar o fluoróforo com pulsos laser curtos e de alta frequência e medir os tempos de chegada do fóton emitido a um detector em relação aos pulsos. Ao digitalizar uma amostra, um conjunto de dados tridimensional é criado para cada pixel: o array inclui informações sobre a distribuição dos fótons em suas coordenadas espaciais x,y e sua curva de decaimento temporal. Uma determinada amostra torna-se, portanto, um mapa de vidas revelando informações sobre a estrutura, a ligação e o ambiente da proteína3,4. Cada proteína fluorescente possui uma vida útil intrínseca e precisamente definida, geralmente de alguns nanossegundos (ns), dependendo de suas propriedades fisioquímicas. É importante ressaltar que a vida útil de um flofófono é independente de sua concentração, intensidade fluorescente e da metodologia de imagem. No entanto, dentro de um sistema biológico, pode ser afetado por fatores ambientais como pH, temperatura, concentrações de íons, saturação de oxigênio e seus parceiros de interação. As vidas também são sensíveis a mudanças estruturais internas e orientação. Fundir um florofófono a um POI resulta em uma mudança em sua vida útil e, consequentemente, informações sobre o comportamento da proteína fundida. Quando um fluoróforo é cercado ou encapsulado em um ambiente bem ligado, como as folhas beta antiparalelas de uma estrutura amilóide, ele perde energia não radiativamente, um processo conhecido como saciamento5. A saciedade do flúor resulta em um encurtamento de sua vida aparente. Quando solúvel, a vida útil de uma proteína permanecerá mais próxima de seu valor original e mais alto. Em contraste, quando uma proteína começa a se agregar, sua vida útil inevitavelmente mudará para um valor mais baixo6,7. Assim, torna-se possível monitorar a propensão de agregação de qualquer proteína formadora de amilóide em diferentes idades em c. elegansvivos .
Aqui descrevemos um protocolo para analisar a agregação de uma proteína de fusão que compreende diferentes trechos de poliglutamina (CAG, Q) (Q40, Q44 e Q85). Ilustramos como a técnica pode ser aplicada igualmente a diferentes fluoróforos, como proteína fluorescente de ciano (PCP), proteína fluorescente amarela (FpS) e proteína fluorescente vermelha monórica (mRFP); e em todos os tecidos de C. elegans,incluindo os neurônios, músculos e o intestino. Além disso, no contexto da proteotase, a FLIM é uma ferramenta muito útil para observar mudanças no esgotamento das acompanhantes moleculares. Derrubar uma das principais acompanhantes moleculares, a proteína de choque térmico 1 (hsp-1), através da interferência do RNA produz o desdobramento prematuro das proteínas. O aumento da carga de agregação como resultado do envelhecimento, doença ou acompanhantes deficientes, é então medido como uma diminuição na vida útil da fluorescência.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ahringer Library hsp-1 siRNA</td>
			<td>Source BioScience UK Limited</td>
			<td>F26D10.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K029.3</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H DCS-120 SPC-150</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#38;H SPC830-SPC Image</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ44-YFP</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OG412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans iQ85-YFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans mQ40-RFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans nQ40-CFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Morimoto Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>2316.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M165 FC</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting Stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoQuant PicoHarp300</td>
			<td>PicoQuant GmbH</td>
			<td></td>
			<td>FLIM Aquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>K305.1</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Agarose</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss AxioObserver.Z1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510-Meta NLO</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of amyloid structures in aging c. elegans using fluorescence lifetime imaging

Fibrilas amilóides estão associadas a uma série de doenças neurodegenerativas, como Huntington, Parkinson ou Doença de Alzheimer. Essas fibrilas amilóides podem sequestrar proteínas metastáveis endógenas, bem como componentes da rede de proteotase (PN) e, assim, exacerbar a proteína dobrável na célula. Há um número limitado de ferramentas disponíveis para avaliar o processo de agregação de proteínas amilóides dentro de um animal. Apresentamos um protocolo de microscopia vitalícia de fluorescência (FLIM) que permite o monitoramento, bem como a quantificação da fibrilização amiloide em células específicas, como neurônios, de forma não invasiva e com a progressão do envelhecimento e após perturbação de o PN. FLIM é independente dos níveis de expressão do flúor e permite uma análise do processo de agregação sem qualquer maior coloração ou branqueamento. Fluoróforos são extintos quando estão próximos de estruturas amilóides, o que resulta em uma diminuição da vida útil da fluorescência. A saciedade correlaciona-se diretamente com a agregação da proteína amilóide. FLIM é uma técnica versátil que pode ser aplicada para comparar o processo de fibrilização de diferentes proteínas amilóides, estímulos ambientais ou origens genéticas in vivo de forma não invasiva.

O protocolo mostra como monitorar com precisão a formação de espécies agregadas em C. elegansvivos, tanto durante seu envelhecimento natural quanto quando submetidos ao estresse. Selecionamos quatro cepas diferentes de nematóides transgênicos que expressam proteínas de poliglutamina de repetições de 40T, 44T ou 85Q. Essas proteínas são sintetizadas em diferentes tecidos e foram fundidas a diferentes floróforos. As cepas C. elegans expressaram Q40-mRFP nos mú...

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Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

A fluorescência de imagens ao longo da vida monitora, quantifica e distingue as tendências de agregação de proteínas em modelos de doença susturais de C. elegans vivos, envelhecidos e estressados.

Caracterização de estruturas amilóides em Envelhecimento C. Elegans usando imagem de fluorescência ao longo da vida

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

O método permite distinguir claramente estruturas integradas de proteína amiloide das contrapartes solúveis e até acumuladas. A técnica é realizada in vivo de forma não invasiva, com pouco ou nenhum efeito colateral tóxico. Como depende das propriedades fluorescentes do próprio fluorohore, é altamente robusto e reprodutível ao longo do tempo.A FLIM tem sido utilizada no campo do diagnóstico de câncer. No entanto, nós o utilizamos para estudar os mecanismos básicos de agregação de proteínas que são de fato relevantes para doenças neurodegenerativas. A metodologia pode ser utilizada no campo da agregação de proteínas.Enquanto a proteína associada à doença for marcada com uma sonda fluorescente, ela pode ser rastreada e monitorada ao longo do tempo. Compostos e estratégias que promovam ou previnem a agregação podem ser estudados com sucesso. Qualquer sistema biológico que permita ser visualizado por microscopia leve é adequado para FLIM in vivo ou ex vivo, por exemplo, na cultura celular, em amostras fixadas ou permeabilizadas e em qualquer meio necessário.Certifique-se de testar as propriedades do fluorohore selecionado dentro do nematoide antes de obter dados experimentais e testar se a configuração está totalmente funcional antes de adquirir medições. Para começar, cresça e mantenha nematoides a 20 graus Celsius em placas de NGM. Envelhecer os nematoides até o quarto dia da vida como os jovens adultos e o oitavo dia de vida como os idosos.No dia da imagem, comece preparando os slides de imagem. Coloque agarose e dupla água destilada com uma concentração de 3% de peso em volume. Transfira para um micro-ondas para derreter e deixe esfriar um pouco.Corte a ponta de uma ponta de pipeta de um mililitro e pegue cerca de 200 microliters da agarose derretida. Pipeta a ága subiu em um escorregador de vidro limpo e imediatamente colocar um segundo em cima evitando a formação de quaisquer bolhas. Deixe os slides secarem e retire delicadamente o deslizamento de vidro superior.O resultado é um deslizamento de vidro com uma superfície ainda agarose onde os nematoides serão posicionados. Uma vez que a configuração de imagem esteja pronta para uso, trabalhando sob um microscópio estéreo, coloque uma gota de 10 microliter de composto anestésico em uma almofada de agarose e transfira suavemente de cinco a 10 nematoides para ele. Use uma ponta de cílios para separar os nematoides.Mantenha-os juntos, mas não toque para permitir uma localização mais fácil dos nematoides durante a aquisição de imagens. Sobreponha cuidadosamente os nematoides com uma mancha de cobertura. Dentro de uma hora após a montagem, faça medições.Certifique-se de que os nematoides estão completamente imóveis. Abra o software de aquisição da FLIM. Localize o botão de guia e pressione ativar saídas.Coloque o slide com os C.elegans montados no palco e usando uma lente de ampliação de 10X no modo de transmissão, localize a posição dos nematoides no slide. Remova o slide, mude o objetivo para uma lente de ampliação de 63X e aplique o meio de imersão necessário. Coloque o slide no palco e localize os nematoides.Comece a digitalizar a amostra. Selecione uma região de interesse e foque em seu plano de projeção máxima. Na interface do software FLIM, visualize o número de fótons detectados.O valor da ADC deve ser entre uma vez 10 a 10 e uma vez 10 para a quinta. Se necessário, mude o foco em um plano diferente ou aumente a potência do laser para coletar mais fótons. Certifique-se de evitar o acúmulo de fótons, mas colete uma quantidade suficiente de fótons para criar um bom ajuste e medição ao longo da vida.Na barra de menu, selecione a guia para definir os parâmetros de aquisição. Selecione a sincronização de varredura para permitir a detecção de fótons únicos. Defina a aquisição para um período fixo de tempo ou um número fixo de fótons.A imprensa começa a ser aquisição. Abra o software e importe arquivos de dados FLIM via arquivo, carregue dados FLIM. Carregue todas as amostras de uma condição, mesmo se obtidas em sessões diferentes e de diferentes repetições biológicas.Se necessário, segmento para sinalizar nematoide para muitas imagens FLIM via segmentação, gerente de segmentação. Arraste a ferramenta de corte ao redor da área de interesse até que ela seja destacada. Uma vez concluída, pressione OK. Selecione uma pequena região onde a imagem baseada em intensidade de um C.elegans aparece.A curva de decomposição dessa região aparece na grande janela de decomposição no lado direito da interface. Para extrapolar a vida útil, na guia de dados, defina um valor mínimo integrado arbitrário entre 40 e 300 para excluir quaisquer pixels que sejam muito fracos para produzir um bom ajuste. Selecione um número mínimo de tempo e um número máximo de tempo para limitar o sinal FLIM a esses valores.Não altere o fóton predefinido de um. Insira a taxa de repetição em mega-hertz do laser utilizado durante a aquisição. Insira um valor máximo do portão para excluir todos os pixels saturados.Na guia lifetime, selecione um ajuste global a ser usado. Não altere nenhum outro parâmetro, exceto o número de seleção exponencial se soube-se que a decadência da fluorescência escolhida é multi-exponencial e exibe mais de uma única vida útil. Faça upload do IRF através do menu IRF.Para estimar o turno do IRF, selecione IRF, estime o deslocamento do IRF. Um conjunto de valores aparece automaticamente na guia IRF. Uma vez estabelecido, não altere nenhum outro parâmetro desta guia.Uma vez definidos todos os parâmetros, pressione o conjunto de dados de ajuste. O ajuste resultante destacado em uma linha azul deve se sobrepor a todos os eventos. Um bom ajuste é obtido quando todos os eventos estão alinhados ao longo do ajuste.Clique na guia parâmetros localizada dentro dos menus superiores certos da interface do software e selecione estatística, média ponderada e verifique se o valor do quadrado chi está o mais próximo possível de um. O valor vitalício da imagem selecionada é, portanto, revelado como tau um. Exporte qualquer informação de interesse através de arquivo, imagens de intensidade de exportação, tabela de resultados de ajuste, imagens, histogramas.Mapas representativos de C.elegans expressando rfp muscular Q40 no quarto ou oitavo dia de vida são mostrados aqui. O trecho Q mais longo do QI85 foi mais propenso à agregação e exibiu uma mudança de vida fluorescência no histograma já no quarto dia da vida. De fato, no quarto dia, observou-se formação de focos para QI85 enquanto ainda estava ausente no QI44.Após o envelhecimento, no entanto, o IQ44 também apresentou formação de focos e, portanto, uma vida de fluorescência reduzida. Finalmente, a formação de focos não foi detectada nem diminuiu a vida útil da fluorescência na cepa NQ40CFP. Para esta cepa, houve apenas mudanças sutis não significativas na vida média da fluorescência ao envelhecer.Uma vez estabelecido o modelo de nematoide, a quantidade de fóton coletado é primordial para obter um bom ajuste vitalício. O método pode ser ainda mais associado a diferentes técnicas como transferência de energia de ressonância forster, FRET, recuperação de fluorescência após fotobleaching, FRAP ou medição. Todas essas adaptações fornecem informações extras sobre as propriedades dos estudos proteicos e sua forma agregada.No campo da agregação de proteínas e da homeostase proteica, a técnica permitiu investigar qualquer perturbação imposta ao sistema, a distribuição de diferentes espécies proteicas e o tráfico e, em geral, a diferença e significância de frações proteicas solúveis e insolúveis dentro do organismo vivo. O azida de sódio anestésico é tóxico e deve ser manuseado com luvas e óculos e diluído sob um capô de fumaça. Como a técnica é baseada em microscopia, é importante seguir todos os avisos relacionados ao trabalho com lasers.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imagem de tecidos amiloides manchado com Luminescent Oligothiophenes conjugados por hiperespectrais Confocal imagem de vida de fluorescência e microscopia

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Bioquímica

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Caracterização estrutural de polissacarídeos de parede celular Medeiros em plantas usando a ritmo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Crescimento de cristais de proteína com dimensões distintas usando automatizado cristalização juntamente com In Situ Difusão dinâmica da luz

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Utilização de eletroforese em Gel de Agarose detergente semi desnaturação Dimensional dois para confirmar a heterogeneidade de tamanho das fibras de amiloides ou Amyloid-como

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Caracterização de baseada em fluorescência rápida das vesículas extracelulares única no sangue humano, com análise de acompanhamento de nanopartículas

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interações com e permeabilização de membrana de mitocôndrias cerebrais por fibrilas amiloides

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Entidades vinculantes ao SUMO (SUBEs) como ferramentas para enriquecimento, isolamento, identificação e caracterização do Proteome SUMO em Câncer de Fígado

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...